способ получения высоких урожаев зиготоподобных семядольных зародышей сосны с использованием сред, содержащих дисахарид и глюкозу (варианты)

Формула изобретения

1. Способ получения семядольных зародышей сосны, включающий этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в среде или на среде, содержащей мальтозу и глюкозу для выращивания семядольных зародышей сосны, отличающийся тем, что и мальтоза, и глюкоза присутствуют в среде в концентрации меньше 3%, причем концентрация мальтозы в среде в 2,5 раза выше концентрации глюкозы в среде.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что эмбриогенная ткань сосны содержит эмбриональные суспензорные массы.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 60% семядольных зародышей сосны содержат от 6 до 12 семядолей.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 70% семядольных зародышей сосны содержат от 6 до 12 семядолей.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 80% семядольных зародышей сосны содержат от 6 до 12 семядолей.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 90% семядольных зародышей сосны содержат от 6 до 12 семядолей.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что и мальтоза присутствует в среде в концентрации 2,5%, и глюкоза присутствует в среде в концентрации 1%.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда содержит мальтозу и, по меньшей мере, один дополнительный полисахарид, причем общая концентрация дисахаридов в среде составляет от 1 до 2,5%.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда содержит мальтозу и, по меньшей мере, один дополнительный полисахарид, причем общая концентрация дисахаридов в среде составляет от 2 до 2,5%.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что эмбриогенную ткань сосны культивируют в среде или на среде, содержащей мальтозу и глюкозу, в течение периода от 6 до 12 нед.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что эмбриогенную ткань сосны культивируют в среде или на среде, содержащей мальтозу и глюкозу, в течение периода от 8 до 12 нед.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что эмбриогенную ткань сосны культивируют в среде или на среде, содержащей мальтозу и глюкозу, в течение периода от 9 до 11 нед.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что осмолярность среды, содержащей мальтозу и глюкозу, составляет от 250 до 450 ммоль/кг.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что водородный показатель (рН) среды, содержащей дисахарид и глюкозу, составляет от 4,5 до 6,5.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит абсорбирующий состав.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что абсорбирующий состав выбирают из группы, включающей активированный уголь, растворимый поли-N-винилпирролидон, нерастворимый поли-N-винилпирролидон, активированный оксид алюминия и силикагель.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что абсорбирующий состав является активированным углем.

18. Способ по п.15, отличающийся тем, что концентрация абсорбирующего состава составляет от 0,01 до 5 г/л.

19. Способ по п.15, отличающийся тем, что концентрация абсорбирующего состава составляет от 0,05 до 1 г/л.

20. Способ по п.15, отличающийся тем, что среда содержит, по меньшей мере, два абсорбирующих состава, причем общая концентрация абсорбирующих составов в среде составляет от 0,01 до 5 г/л.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда содержит, по меньшей мере, два абсорбирующих состава, причем общая концентрация абсорбирующих составов в среде составляет от 0,05 до 5 г/л.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что семядольные зародыши сосны Лоблолли получают из эмбриогенной ткани сосны Лоблолли.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда является жидкой средой.

24. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда является твердой средой.

25. Способ получения семядольных зародышей сосны, включающий этапы:

(а) культивирования эмбриогенной ткани сосны в среде или на среде для поддержания жизнедеятельности; и

(б) культивирования эмбриогенной ткани сосны, причем упомянутая ткань выдерживалась в соответствии с этапом (а), в среде или на среде для развития, содержащей глюкозу и мальтозу, для образования семядольных зародышей сосны, причем и мальтоза, и глюкоза присутствуют в среде для развития в концентрации меньше 3%, причем концентрация мальтозы в среде в 2,5 раза выше концентрации глюкозы в среде.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что и мальтоза присутствует в среде в концентрации 2,5%, и глюкоза присутствует в среде для развития в концентрации 1%.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам получения зародышей растений в искусственных условиях и дополнительного получения растений из зародышей растений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Спрос на сосны для изготовления продуктов деревообработки продолжает возрастать. Одним предлагаемым решением этой проблемы является определение отдельных деревьев, которые обладают желательными характеристиками, такими как высокая скорость роста, и дают многочисленные, генетически идентичные, клоны взрослых деревьев путем соматического клонирования. Эти клоны могут культивироваться для получения посадок или целых лесов сосен, которые обладают желательными характеристиками.

Один способ клонирования сосен использует обработку в искусственных условиях изолированной живой ткани сосны в условиях, которые способствуют образованию зародышей сосны и затем целых растений из обработанной ткани. Изолированная ткань сосны может быть культивирована в присутствии одного или нескольких ауксинов и/или цитокининов для способствования образованию и размножению эмбриогенной ткани, которая затем культивируется в условиях, которые способствуют образованию семядольных зародышей сосны. Затем зародыши могут быть выращены до сосновых деревьев. Примером эмбриогенной ткани сосны являются эмбриональные суспензорные массы (ЭСМ), которые могут формироваться культурой ткани в искусственных условиях из зародышей сосны, вырезанных из семян сосны.

На Фиг.1 показаны эмбриональные суспензорные массы сосны в жидкой культуре. На Фиг.2 показан семядольный зародыш сосны, образовавшийся из ЭСМ (семядоли видны на верху зародыша).

Существующая проблема, однако, заключается в стимулировании эффективного образования семядольных зародышей сосны, которые способны давать ростки с высокой частотой для получения саженцев сосны. Предпочтительно семядольные зародыши сосны, образовавшиеся в искусственных условиях, морфологически, анатомически и биохимически аналогичны или идентичны зиготным зародышам сосны, образовавшимся в естественных условиях в семенах сосны. В частности, существует потребность в способах получения в искусственных условиях большего числа зиготоподобных семядольных зародышей сосны, чем можно получить, используя известные способы. Предпочтительно частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных новыми способами, должно быть выше, чем частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных известными способами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет способы получения семядольных зародышей сосны. Способы по настоящему изобретению дают большее количество зиготоподобных семядольных зародышей сосны, чем можно получить известными способами. Кроме того, частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных способами по настоящему изобретению, выше, чем частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных известными способами.

Каждый из способов по настоящему изобретению включает в себя этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в или на среде, включающей дисахарид и глюкозу для получения семядольных зародышей сосны, и отличается тем, что дисахарид и глюкоза присутствуют в среде в концентрации меньше 3% (т.е. дисахарид присутствует в среде в концентрации меньше 3%, и глюкоза присутствует в среде в концентрации меньше 3%). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения среда включает глюкозу (присутствует в концентрации меньше 3%) и по меньшей мере два дисахарида, и тогда общая концентрация всех дисахаридов в среде меньше 3%. Среды может также содержать один или несколько абсорбирующих составов. Способы по настоящему изобретению могут, кроме того, включать этап получения одного или нескольких сосновых деревьев (например, популяции сосновых деревьев) из семядольных зародышей сосны, полученных в соответствии с настоящим изобретением.

При практическом осуществлении некоторых вариантов настоящего изобретения эмбриогенная ткань последовательно культивируется на или в последовательности из по меньшей мере двух сред, по меньшей мере одна из которых включает дисахарид и глюкозу, каждый из которых присутствует в среде в концентрации меньше 3%. Среда, которая содержит дисахарид и глюкозу, адаптирована для содействия развитию и созреванию семядольных зародышей из эмбриогенной ткани.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы получения семядольных зародышей сосны, причем каждый из способов содержит следующие этапы: (а) культивирование эмбриогенной ткани сосны (такой как эмбриональные суспензорные массы) на или в среде для поддержания в жизнеспособном состоянии; и (б) культивирование эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (а) на среде для развития при концентрации меньше 3%. Среда для развития может по выбору содержать абсорбирующий состав. Способы этого аспекта изобретения могут по выбору включать этап культивирования ткани сосны на или в среде для зарождения для получения эмбриогенной ткани сосны, которая затем культивируется на или в среде для поддержания, упомянутой в этапе (а).

В еще одном аспекте настоящее изобретение дает семядольные зародыши сосны, полученные в соответствии с одним из способов по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению полезны, например, для получения семядольных зародышей сосны, которые могут быть далее охарактеризованы генными или биохимическими средствами и/или могут быть выращены до небольших саженцев сосны, которые могут быть выращены до взрослых сосновых деревьев в случае необходимости. Таким образом, например, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для получения клонов индивидуальных сосновых деревьев, которые обладают одной или несколькими желательными характеристиками, такими как быстрый рост или повышенное качество древесины. Например, семядольные зародыши сосны по настоящему изобретению могут быть использованы для получения посадок или лесов сосновых деревьев, обладающих одной или несколькими желательными характеристиками, такими как высокая скорость роста или повышенное качество древесины. Деревья могут быть использованы для получения продукции деревообработки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 показаны эмбриональные суспензорные массы сосны в жидкой культуре.

На Фиг.2 показан типовой семядольный зародыш сосны, полученный с использованием способов по настоящему изобретению (семядоли видимы на верху зародыша).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если в тексте специально не определено иное, все используемые в нем термины имеют то же значение, которое они имели бы для специалиста в области техники настоящего изобретения.

Используемый в тексте термин «семядольный зародыш» означает зародыш, который имеет одну или несколько семядолей.

Термин «дисахарид» относится к углеводам, которые состоят из двух моносахаридных радикалов. Примерами дисахаридов являются мальтоза, сахароза, лактоза, целлобиоза, изомальтоза, гентиобиоза, ламинарабиоза, хитобиоза, ксилобиоза, инулобиоза, маннобиоза, гиалобиурониевая кислота, хондрозин и целлобиурониевая кислота.

Используемый в тексте термин «эмбриогенная ткань» относится к любой ткани, полученной из растения семейства Pinacea, которая способна производить один или несколько семядольных зародышей сосны, будучи обработанной в соответствии со способами по настоящему изобретению. Так, термин «эмбриогенная ткань» включает, например, эмбриональные суспензорные массы сосны.

Если не указано иное, все значения концентрации, которые выражены в процентах, являются весовыми процентами на единицу объема.

В одном аспекте настоящее изобретение представляет способы получения семядольных зародышей сосны. Каждый из способов по настоящему изобретению включает этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, для получения семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде в концентрации меньше 3%.

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению по меньшей мере 50% (также по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%) полученных семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными (т.е. обладают теми же морфологическими особенностями и физиологическими свойствами, что и зиготные семядольные зародыши сосны на той же стадии развития). Так, в некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению от 50% до 100% (также от 60% до 90% или от 70% до 80%) полученных семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными.

Обычно каждый из семядольных зародышей сосны, полученных в соответствии с настоящим изобретением, обладает одной или несколькими из следующих характеристик: зародыши длиннее (обычно на 0,5-1,0 мм), чем зародыши, которые были обработаны аналогично за тем исключением, что ни глюкоза, ни дисахарид не присутствовали в культурной среде в концентрации меньше 3%; каждый зародыш содержит от восьми до 12 семядолей; и зародыши, обработанные в соответствии с настоящим изобретением, развиваются быстрее, чем зародыши, которые обработаны аналогично за тем исключением, что ни глюкоза, ни дисахарид не присутствовали в культурной среде в концентрации больше 3% (например, в некоторых вариантах осуществления зародыши, подготовленные в соответствии с настоящим изобретением, развиваются в течение 9 недель).

Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для получения семядольных зародышей любого члена семейства Pinacea, таких как члены рода Pinus, таких как сосна Лоблолли (Pinus taedd).

Примером эмбриогенной ткани, применимой при практическом осуществлении настоящего изобретения, являются эмбриональные суспензорные массы (ЭСМ). ЭСМ могут быть приготовлены из предсемядольных зародышей, удаленных из семян сосны. Семена обычно поверхностно стерилизуются до удаления предсемядольных зародышей, которые затем культивируются на или в среде, которая допускает образование ЭСМ, которые включают зародыши на ранней стадии в процессе размножения путем образования почек и деления. Среда может, по желанию, содержать гормоны, которые стимулируют размножение зародышей на ранней стадии. Примерами гормонов, которые могут быть включены в среду, являются ауксины (например, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D)) и цитокинины (например, 6-бензиламинопурин (БАП)). Ауксины могут использоваться, например, в концентрации от 1 мг/л до 200 мг/л. Цитокинины могут использоваться, например, в концентрации от 0,1 мг/л до 10 мг/л. Примером среды, применимой для культивирования предсемядольных зародышей сосны для инициирования формирования ЭСМ, является среда BM₁, указанная в Примере 1.

Каждый из способов по настоящему изобретению включает этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, для получения семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в концентрации меньше 3% (или меньше 2,9%, или меньше 2,8%, или меньше 2,7%, или меньше 2,6%). В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению дисахарид и глюкоза присутствуют в среде в концентрации от 1 до 2,5% каждый. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению дисахарид и глюкоза присутствуют в среде в концентрации от 2 до 2,5% каждый. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению дисахарид присутствует в среде в концентрации 2,5%, и глюкоза присутствует в среде в концентрации 1%. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению среда содержит глюкозу и по меньшей мере два дисахарида, в таком случае концентрация глюкозы в среде меньше 3%, и общая концентрация всех дисахаридов в среде от 1% до 2,5%. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению среда содержит глюкозу и по меньшей мере два дисахарида; в этом случае глюкоза присутствует в среде в концентрации меньше 3%, а общая концентрация всех дисахаридов в среде от 2% до 2,5%.

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань сосны культивируется в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, каждый в концентрации меньше 3%, в течение периода от шести недель до 12 недель, или от восьми недель до 12 недель, или от девяти недель до 11 недель. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань сосны культивируется в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, каждый в концентрации меньше 3%, при температуре от 20°С до 24°С или от 21°С до 24°С.

Среда, которая содержит дисахарид и глюкозу, также может содержать питательные вещества (например, соли), которые поддерживают существование инкубированной растительной ткани, и один или несколько агентов для регулирования осмолярности среды в желаемом диапазоне. Например, осмолярность среды может составлять от 250 ммоль/кг до 450 ммоль/кг или от 250 ммоль/кг до 350 ммоль/кг. Водородный показатель среды также может регулироваться до желаемого значения. Например рН среды может составлять от 4,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0.

Среда, содержащая дисахарид и глюкозу, может быть жидкой средой или твердой средой. При использовании жидкой среды эмбриогенная ткань обычно помещается на абсорбирующую подложку (например, фильтровальную бумагу), которая пропитана жидкой средой. При использовании твердой среды эмбриогенная ткань может быть помещена на поверхность среды и может частично проникать в поверхность твердой среды. Так, твердые среды включают среды, которые отверждены частично и позволяют эмбриогенной ткани значительно проникать в материал среды, и полностью отвержденные среды, которые не позволяют эмбриогенной ткани проникать в материал отвержденной среды. Жидкие среды могут быть полностью или частично отверждены путем добавления соответствующего количества огеливающего агента, такого как агар-агар или гелрит.

Было определено, что включение абсорбирующего состава в среду, которая содержит дисахарид и глюкозу, далее способствует получению высокого урожая семядольных зародышей сосны, имеющих повышенную частоту прорастания и улучшенное качество. Абсорбирующим составом может быть любой состав, который не токсичен к эмбриогенной ткани в концентрациях, используемых при практическом осуществлении методов по настоящему изобретению, и который способен абсорбировать гормоны роста и токсические соединения, продуцируемые растительными клетками во время развития зародышей и присутствующие в среде. Так, абсорбированный гормон более не способен способствовать росту эмбриогенной ткани в или на среде, и абсорбированные токсины не могут неблагоприятно влиять на растительные клетки. В этом контексте термин "абсорбирующий" охватывает любое химическое или физическое взаимодействие между абсорбирующим составом и одним или несколькими гормонами роста и/или токсинами в среде, так что гормоны роста и/или токсины становятся связанными абсорбирующим составом.

Так, в некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань инкубируется в или на среде, которая содержит гормоны роста, такие как ауксины и/или цитокинины, для содействия размножению эмбриогенной ткани. Когда получен достаточный объем эмбриогенной ткани, она может быть затем перенесена на среду, которая не содержит гормонов роста, но содержит дисахарид и глюкозу, а также, по выбору, один или несколько абсорбирующих составов. Абсорбирующий состав или составы связывают гормоны роста, присутствующие в среде, так что скорость размножения эмбриогенной ткани снижается, или размножение полностью останавливается, и дисахарид и глюкоза инициируют получение семядольных зародышей сосны из эмбриогенной ткани.

Не ограничительные примеры применимых абсорбирующих составов включают активированный уголь, растворимый поли-N-винилпирролидон, нерастворимый поли-N-винилпирролидон, активированный оксид алюминия и силикагель. Абсорбирующий раствор может присутствовать в количестве, например, от 0,01 г/л до 5 г/л. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения абсорбирующий состав присутствует в количестве от 0,05 г/л до 1 г/л. В тех вариантах осуществления способов по настоящему изобретению, в которых в среде присутствуют несколько абсорбирующих составов (например, по меньшей мере два абсорбирующих состава), вышеуказанные диапазоны концентраций относятся к общему содержанию абсорбирующих составов в среде.

При практическом осуществлении некоторых вариантов настоящего изобретения эмбриогенная ткань последовательно культивируется на или в последовательности из по меньшей мере двух сред, по меньшей мере одна из которых содержит дисахарид и глюкозу, которые каждый присутствуют в среде в концентрации меньше 3%. Среда, которая содержит дисахарид и глюкозу, адаптирована для способствования развитию и созреванию семядольных зародышей из эмбриогенной ткани, такой как эмбриогенная ткань, в которую были добавлены один или несколько гормонов роста. Семядольные зародыши сосны имеют повышенную частоту прорастания и улучшенное качество.

Например, при практическом осуществлении некоторых вариантов способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань сосны (такая как ЭСМ) культивируется на или в среде для поддержания жизнедеятельности, которая адаптирована для содействия делению клеток и росту эмбриогенной ткани. Среда для поддержания жизнедеятельности может быть твердой средой, или жидкой средой, которая может перемешиваться для содействия росту и размножению содержащейся в ней эмбриогенной ткани. Среда для поддержания жизнедеятельности может содержать питательные вещества, которые поддерживают жизнедеятельность эмбриогенной ткани, и может содержать гормоны, такие как один или несколько ауксинов (например, 2,4-D) и/или цитокинины (например, кинетин, БАП), которые способствуют делению клеток и росту эмбриогенной ткани. Если используется ауксин, его концентрация в среде для поддержания жизнедеятельности может составлять, например, от 0,1 мг/л до 10 мг/л (или от 0,1 мг/л до 5 мг/л). Если в среде присутствуют несколько ауксинов, вышеуказанные диапазоны концентрации относятся к общему содержанию ауксинов в среде. Если используется цитокинин, его концентрация в среде для поддержания жизнедеятельности может составлять, например, от 0,1 мг/л до 2 мг/л (или от 0,1 мг/л до 1 мг/л). Если в среде присутствуют несколько цитокининов, вышеуказанные диапазоны концентрации относятся к общему содержанию цитокининов в среде.

Обычно желательно, хотя и не обязательно, включать в среду для поддержания жизнедеятельности мальтозу в качестве единственного или главного источника сахара. Мальтоза может присутствовать в концентрации от 0,5 мг/л до 6 мг/л или от 1 мг/л до 3 мг/л.

Осмолярность среды для поддержания жизнедеятельности может регулироваться до значения, которое находится в желаемом диапазоне, например от 100 ммоль/кг до 250 ммоль/кг или от 100 ммоль/кг до 200 ммоль/кг. Водородный показатель среды для поддержания жизнедеятельности может также регулироваться до значения в желаемом диапазоне, например от 4,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0. Эмбриогенная ткань обычно инкубируется в или на среде для поддержания жизнедеятельности при температуре в интервале от 20°С до 24°С или от 21°С до 24°С. Примером подходящей среды для поддержания жизнедеятельности является среда ВМ₂ в Примере 1.

Эмбриогенная ткань инкубируется в или на среде для поддержания жизнедеятельности до тех пор, пока эмбриогенная ткань не размножится до желаемого объема (определяемого, например, по массе культивированной эмбриогенной ткани). Эмбриогенная ткань затем может быть перенесена на среду для развития, адаптированную для содействия развитию высококачественных семядольных зародышей сосны. Средой для развития обычно является твердая среда, хотя она может быть и жидкой средой.

Среда для развития содержит дисахарид и глюкозу, которые каждый присутствует в концентрации меньше 3% (или меньше 2,9%, или меньше 2,8%, или меньше 2,7%, или меньше 2,6%). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации от 1% до 2,5%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации от 2% до 2,5%.

Среда для развития может содержать питательные вещества (например, соли), которые поддерживают жизнедеятельность эмбриогенной ткани. Подходящие среды для развития обычно не содержат гормонов роста, таких как ауксины и цитокинины, но могут содержать гормон - абсцизовую кислоту. При использовании абсцизовой кислоты в среде для развития она обычно применяется в концентрации в диапазоне от 1 мг/л до 200 мг/л, например от 1 мг/л до 100 мг/л. Осмолярность среды для развития может регулироваться до значения, которое находится в желаемом диапазоне, например от 250 ммоль/кг до 450 ммоль/кг или от 250 ммоль/кг до 350 ммоль/кг. Водородный показатель среды для развития также может регулироваться в желаемом диапазоне, например от 4,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0. Эмбриогенная ткань обычно инкубируется в или на среде для развития при температуре в интервале от 20°С до 24°С или от 21°С до 24°С. Примером подходящей среды для развития является среда ВМ ₃ в Примере 1.

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань инкубируется в или на среде для развития в течение периода от шести недель до 12 недель или от шести недель до девяти недель.

Так, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы для получения семядольных зародышей сосны, причем каждый из способов включает этапы: (а) культивирования эмбриогенной ткани сосны (такой как эмбриональные суспензорные массы) на или в среде для поддержания жизнедеятельности; и (б) культивирования эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (а), на или в среде для развития, содержащей дисахарид и глюкозу для образования семядольных зародышей сосны, где дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации меньше 3%. Среда для развития может, по выбору, содержать абсорбирующий состав. Способы по данному аспекту настоящего изобретения могут, по выбору, включать этап культивирования ткани сосны в или на среде для инициирования для получения эмбриогенной ткани сосны, которая затем культивируется в или на среде для поддержания жизнедеятельности, как указано в этапе (а).

В других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы для получения семядольных зародышей сосны, причем каждый из способов включает этапы: (а) культивирования эмбриогенной ткани сосны (такой как эмбриональные суспензорные массы сосны) на твердой среде для поддержания жизнедеятельности; (б) культивирования эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (а) в жидкой среде для поддержания жизнедеятельности; и (в) культивирования эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (б), на твердой среде для развития, содержащей дисахарид и глюкозу, для образования семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации меньше 3%. Среда для развития может, по выбору, содержать абсорбирующий состав. Способы по данному аспекту настоящего изобретения могут, по выбору, включать этап культивирования ткани сосны в среде для инициирования для получения эмбриогенной ткани сосны, которая затем культивируется на среде для поддержания жизнедеятельности, как указано в этапе (а).

Семядольные зародыши сосны, полученные с использованием способов по настоящему изобретению, могут, по выбору, развиваться до образования саженцев сосны, которые могут быть выращены до сосновых деревьев, по желанию. Семядольные зародыши сосны могут проращиваться на твердой среде для прорастания, такой как среда BM ₅ в Примере 1. Проросшие саженцы могут быть перенесены в почву для последующего роста. Например, проросшие саженцы могут быть помещены в почву в теплице и расти там до переноса в открытый грунт. Обычно семядольные зародыши сосны освещаются для стимулирования роста. Обычно все этапы способов по настоящему изобретению, за исключением прорастания, проводятся в темноте.

Способы по настоящему изобретению могут использоваться, например, для получения клонов индивидуальных сосновых деревьев, которые обладают одной или несколькими желательными характеристиками, такими как быстрая скорость роста. Так, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы для получения генетически идентичных семядольных зародышей сосны. Способы по данному аспекту настоящего изобретения включают этап культивирования генетически идентичной эмбриогенной ткани сосны в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, для получения генетически идентичных семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в концентрации меньше 3%.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает популяции зиготоподобных семядольных зародышей сосны. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 50% (или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%) семядольных зародышей сосны в популяции семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными. Так, в некоторых вариантах данного аспекта настоящего изобретения от 50 до 100% (или от 60 до 80%, или от 70 до 80%) семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными. Способы по настоящему изобретению могут использоваться для получения популяций зиготоподобных семядольных зародышей сосны по настоящему изобретению. Так, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает популяции семядольных зародышей сосны, подготовленных по одному из способов по настоящему изобретению.

Следующие примеры просто иллюстрируют рассмотренный выше наилучший способ практического осуществления настоящего изобретения, но не должны истолковываться как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1

Данный Пример представляет показательный способ по настоящему изобретению для получения популяции сосны Лоблолли (Pinus taeda) семядольных зародышей и прорастания зародышей.

Женские гаметофиты, содержащие зиготные зародыши, удаляются из семян через 4-5 недель после оплодотворения. Шелуха семян удаляется, но зародыши не вырезаются из окружающего их гаметофита, вырезается только центральная часть семяпочки. Конусы хранятся при температуре 4°С до использования. Сразу же после удаления недоразвившихся зародышей семена стерилизуются после начальной промывки и обработки моющим средством в 15%-ном растворе Н₂О₂ в течение 10 минут. Экспланты тщательно промываются в стерильной дистиллированной воде после каждого этапа обработки.

В Таблице 1 приведены составы типичных сред, применяемых для эмбриогенеза сосны Лоблолли.

Таблица 1
Состав сред для сосны Лоблолли
	ВМ	ВМ 1	ВМ 2	ВМ 3	ВМ 4	ВМ 5	ВМ 6	ВМ 7
Соли (мг/л)
NH4NO 3	150	150	150	150	150	206,25	150	150
KNO 3	909,9	909,9	909,9	909,9	909,9	1170	909,9	909,9
Са(NO 3)2·4Н2 О	236,15	236,15	236,15	236,15	236,15		236,15	236,15
MgSO 4·7H2O	246,5	246,5	246,5	246,5	246,5	185	246,5	246,5
Mg(NO3) 2·6H2O	256,5	256,5	256,5	256,5	256,5		256,5	256,5
MgCl2·6H 2O	50	50	50	50	50		50	50
КН2PO 4	136	136	136	136	136	85	136	136
CaCl2·2Н 2O	50	50	50	50	50	220	50	50
KI	4,15	4,15	4,15	4,15	4,15	0,415	4,15	4,15
Н3ВО3	15,5	15,5	15,5	15,5	15,5	3,1	15,5	15,5
MnSO4·H 2O	10,5	10,5	10,5	10,5	10,5	8,45	10,5	10,5
ZnSO 4·7H2О	14,4	14,4	14,4	14,4	14,4	4,3	14,4	14,4
Na2MoO 4·2H2O	0,125	0,125	0,125	0,125	0,125	0,125	0,125	0,125
CuSO4·5H 2O	0,125	0,125	0,125	0,125	0,125	0,0125	0,125	0,125
COCl 2·6Н2O	0,125	0,125	0,125	0,125	0,125	0,0125	0,125	0,125
FeSO4·7H 2O	27,87	27,87	27,87	13,93	13,93	13,93	13,93	13,93
Na 2EDTA	37,26	37,26	37,26	18,63	18,63	18,63	18,63	18,63
Витамины/ Аминокислоты
Никотиновая кислота	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Пиридоксин HCI	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Тиамин HCI	1	1	1	1	1	1	1	1
Глицин	2	2	2	2	2	2	2	2
L-пролин				100	100		100	100
L-аспарагин				100	100		100	100
L-аргенин				50	50		50	50
L-аланин				20	20		20	20
L-серин				20	20		20	20
PEG 8000mw				10000	13000
Сахар/агар-агар, мг/л
Мио-Инозитол	200	200	200	1000	1000	100	1000	1000
Гидролизат казеина	500	500	500	500	500		500	500
L-глютамин	1000	1000	1000	1000	1000		1000	1000
Сахароза						20000
Мальтоза	30	30	30	25000	20000		20000	20000
Глюкоза				10000
ГЕЛРИТ				2500	2500
ТС агар-агар						8000
Активированный уголь				1000	1000	2500		1000
Гормоны, мг/л
АБА				25	25		10
2,4-D		11,0	1,1
БАП		1,0	0,1
Кинетин		1,0	0,1

Стадия I - Инициирование: Стерильные гаметофиты с цельными зародышами помещаются на твердую культурную среду ВМ₁ и выдерживаются при температуре 22-25°С в течение 3-5 недель в полной темноте. Продолжительность выдержки зависит от культивируемого генотипа. В конце этого периода образуется белая слизистая масса вместе с первоначальными эксплантами. Анализ под микроскопом обычно выявляет в этой массе многочисленные зародыши на начальной стадии. Они обычно характеризуются наличием длинного тонкостенного суспензора с небольшой головкой, имеющей плотную цитоплазму и крупные ядра.

Осмолярность среды для инициирования в некоторых случаях может достигать 170 ммоль/кг. Обычно она составляет около 160 ммоль/кг или даже ниже (150 ммоль/кг).

Стадия II - Поддержание жизнедеятельности и размножение:

Зародыши на ранней стадии, удаленные из масс, образованных на стадии инициирования, сначала помещаются на загущенную среду для поддержания жизнедеятельности и размножения. Она отличается от среды для инициирования тем, что гормоны роста (ауксины и цитокинины) снижаются по меньшей мере на порядок. Осмолярность этой среды обычно выше, чем среды для инициирования, и составляет 180 ммоль/кг или больше в результате увеличения концентрации мио-инозитола до 0,5 объемных процентов. Температура и световой период по-прежнему равны 22-25°С при полной темноте. Зародыши культивируются в течение 12-14 дней на твердой среде ВМ ₂ до переноса в жидкую среду для дальнейшего субкультивирования. Эта жидкая среда имеет аналогичный состав, но без огеливающего агента. Зародыши в конце стадии поддержания жизнеспособности на твердой среде обычно сходны по внешнему виду с зародышами стадии I. После 5-6 недель субкультур на жидкой среде для поддержания жизнеспособности образуются развитые зародыши на ранней стадии. Они характеризуются мягкими эмбриональными головками, обычно имеют свыше 100 индивидуальных клеток и многочисленные суспензоры.

Осмотический потенциал сред для поддержания жизнеспособности для Pinus taeda обычно составляет примерно 180-400 ммоль/кг. В большинстве случаев осмотический потенциал сред для поддержания жизнедеятельности примерно в 1,5 раза выше, чем у сред для инициирования или размножения.

Стадия III - Развитие зародыша: Развившиеся зародыши на ранней стадии их культуры Стадии II переносятся на подложку из фильтровальной бумаги, помещенной на подкладку, пропитанную жидкой средой для развития. Эта среда или совсем не имеет гормонов роста, или они присутствуют только в очень небольших количествах, и эта среда имеет такой же пониженный уровень осмотических агентов как и на Стадиях I и II. Присутствуют глюкоза и мальтоза. Может быть добавлена абсцизовая кислота для ускорения дальнейшего развития. Также может быть добавлен абсорбирующий состав (такой как активированный уголь, растворимые и нерастворимые формы поли-N-винилпирролидона, активированный оксид алюминия и силикагель) в концентрации примерно 0,1-5 г/л или примерно 0,25-2,5 г/л.

Осмотический потенциал этой среды может быть значительно поднят по сравнению со средой для поддержания жизнедеятельности. Например, осмолярность может достигать 350 ммоль/кг или даже больше. Развитие предпочтительно проводится в полной темноте при температуре 22-25°С до развития удлиненных семядольных зародышей. Время развития обычно составляет несколько недель, обычно от 6 до 9 недель.

Затем зародыши инкубируются при 4-10°С в течение 3-4 недель в среде, которая не содержит PEG или АБА (например, среда ВМ7).

Стадия IV - Сушка: Зародыши, все еще находящиеся на подложке из фильтровальной бумаги, поднимаются с подкладки и помещаются в закрытый контейнер на насыщенный раствор K₂SO ₄ или воду, при относительной влажности 97% на период около трех недель.

Стадия V - Прорастание: Высушенные семядольные зародыши со Стадии IV регидратируются путем помещения их на той же подложке из фильтровальной бумаги примерно на 24 часа на подкладку, насыщенную жидкой средой для прорастания. Затем зародыши индивидуально размещаются на твердой среде ВМ₅ для прорастания. Это основная питательная среда без гормонов роста, которая была модифицирована путем снижения содержания сахарозы, мио-инозитола и органического азота. Зародыши инкубируются на среде ВМ ₅ в течение примерно 6-8 недель при температуре 23-25°С и световым периодом 16 часов света - 8 часов темноты до тех пор, пока получившиеся проростки не будут иметь хорошо развитый корешок и гипокотиль и зеленую семядольную структуру и эпикотиль. По желанию, семядольные зародыши могут быть превращены в искусственные семена.

Из-за пониженной концентрации углеводов осмотический потенциал среды для прорастания далее снижается ниже уровня среды для развития. Обычно он ниже примерно 150 ммоль/кг (или примерно 100 ммоль/кг).

Стадия VI - Преобразование: Проростки со Стадии V удаляются из среды для прорастания и помещаются в грунт, состоящий из равных частей торфа и мелкого перлита.

Пример 2

Этот пример демонстрирует воздействие среды для развития, которая содержит 2,5% мальтозы и 1% глюкозы, на развитие и прорастание культивируемых на ней соматических зародышей сосны Лоблолли.

Были испытаны три генотипа сосны Лоблолли: Генотип А, Генотип В и Генотип С. Эмбриональные суспензорные массы (ЭСМ) каждого генотипа выращивались в колбе, содержащей 1 л среды ВМ2. Каждая колба с ЭСМ отстаивалась в течение 15 мин, среды перемешивалась, и отстоявшиеся клетки переносились в новый сосуд. Равный объем среды ВМ6 добавлялся к клеткам, которым затем давали отстаиваться в течение 10 мин. Половина среды ВМ6 удалялась, и аликвотные пробы по 1,5 мл отстоявшихся клеток (соотношение клетки с ВМ6 1:0,5) переносились непосредственно на среды ВМ3 (содержит глюкозу и мальтозу) и ВМ4 (содержит мальтозу, но не содержит глюкозу) для развития, а также на среды ВМ2, ВМ5, ВМ6 и ВМ7.

После инкубирования в течение 4 недель на этих средах для развития наблюдалось, что среда ВМ3 обеспечивала более быстрое развитие, чем среда ВМ4. Другие среды не показали различий по сравнению с контрольной средой. После инкубирования в течение 12 недель на средах для развития зародыши, культивируемые на среде ВМ3, были намного больше, длиннее и более напоминали зиготных зародышей, чем зародыши, культивируемые на среде ВМ4. Зародыши, культивируемые на среде ВМ3, начали развивать семядоли после восьми недель. Зародыши, культивируемые на среде ВМ3, имели 8-10 семядолей (генотип А дал несколько зародышей, имевших 14-16 семядолей) по сравнению с 4-6 семядолями на зародышах, культивируемых на среде ВМ4. Так, культивирование зародышей на среде для развития, содержащей мальтозу и глюкозу (среда ВМ3), дало более крупные зародыши улучшенного качества с большим количеством семядолей и видимых сводов, чем другие среды. В Таблице 2 показано количество зиготоподобных зародышей сосны Лоблолли, полученных на средах ВМ4 и ВМ3.

Таблица 2
Генотип	Среда ВМ4	Среда ВМ3
А	47	61
В	75	84
С	43	56
среднее	55	67

Зиготоподобные зародыши были выбраны из плоских чашек со средами ВМ3 и ВМ4 и перенесены в чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу на подложке, пропитанной средой ВМ7. Чашки Петри герметизировались парафином и хранились в холодном месте. После 4 недель куски фильтровальной бумаги с зародышами переносились на ячеистые мостики в коробках Magenta, которые содержали примерно 100 мл воды. После 3 недель сушки в коробках куски фильтровальной бумаги с зародышами переносились в чашки Петри, содержащие подложку, пропитанную жидкой средой ВМ5. После 24 часов зародыши переносились на твердую среду ВМ5 в коробки для прорастания. Коробки были оставлены в темноте на одну неделю и затем перенесены в светлое помещение.

Зародыши, полученные на ВМ3, имели частоту прорастания, которая почти вдвое превышала частоту прорастания зародышей на ВМ4. Более того, качество проростков, полученных на среде ВМ3, было лучше качества проростков, полученных на среде ВМ4. Например, для Генотипов А и В биполярные проростки на среде ВМ3 имели прямые и толстые гипокотили при энергичном росте эпикотилей. Напротив, биполярные проростки, полученные на среде ВМ4, имели искривленные, относительно тонкие гипокотили.

Хотя предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения был продемонстрирован и изложен, будет понятно, что в него могут быть внесены различные изменения без отхода от идеи и объема настоящего изобретения.