рентгеноконтрастное средство

Формула изобретения

Рентгеноконтрастное средство, характеризующееся тем, что оно представляет собой масляное контрастное вещество, содержащее дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты и этиловый эфир линолевой кислоты при следующем соотношении компонентов, мас.%:

дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты	95,0
этиловый эфир линолевой кислоты	5,0

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым лекарственным препаратам, а именно к средствам контрастирования внутренних органов, и может найти применение в лучевой диагностике (ЛД) при ангиографии, компьютерной томографии (КТ) и лимфографии.

Известно, что возможности ЛД значительно увеличиваются при использовании рентгеноконтрастных средств (РКС). При этом необходимо, чтобы РКС сочетали в себе максимальную способность поглощать рентгеновские лучи, фармакологическую инертность, химическую стабильность, органоспецифичность, низкую вязкость, минимальную осмотическую активность и токсичность и быстрое выведение из организма.

Наиболее приемлемым компонентом таких средств является йод ввиду его высокой плотности, относительно низкой токсичности и прочного ковалентного связывания в молекуле органического вещества.

Этим требованиям в наибольшей степени удовлетворяют йодированные масляные РКС, поскольку они

- не являются солями и не диссоциируют на ионы в водной среде;

- обладают продолжительным действием;

- легко ассимилируются организмом;

- за счет прочного связывания йода в молекуле РКС не вызывают отравления организма свободным йодом;

- характеризуются низкой всасываемостью стенками сосудов, что снижает их токсическое действие на организм.

В последние годы рентгеноконтрастные методы исследования с использованием масляных контрастных веществ нашли широкое применение в экспериментальной и клинической медицине. Традиционными областями их применения стали лимфография, сиалография, рентгеноэндоваскулярная окклюзия и химиоэмболизация злокачественных новообразований различных локализаций и пр.

Однако количество пригодных для этих целей масляных РКС в настоящее время недостаточно. Основной задачей при разработке новых йодсодержащих рентгеноконтрастных препаратов является снижение токсичности, вязкости, улучшение качества визуализации и уменьшение вероятности осложнений, которые могут возникать при их использовании.

Йодированные масла известны с 1896 года, когда было получено йоднокунжутное масло, названное йодипином. В 1901 г. было изготовлено йодированное маковое масло, получившее название липиодол. Известно около 20 аналогичных препаратов, полученных йодированием растительных масел: рафинированного подсолнечного масла (йодолипол), сурепкового (кампиодол), вышеназванных кунжутного (йодипин) и макового (липиодол) и многих других. С 1961 г. началось широкое использование масляных РКС для прямой клинической лимфографии, при этом преимущественное применение получил липиодол.

Липиодол получают из макового масла, представляющего собой смесь стеариновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой кислот.Масло подвергают йодированию, после чего длительно и тщательно очищают.Содержание йода в липиодоле составляет 40%, уд. вес его 1.350, вязкость - 4.3 П.

Серьезным недостатком липиодола является, в первую очередь, высокая вязкость и опасность жировых эмболий, а также сложный состав, поскольку он представляет собой смесь йодированных и нейодированных продуктов, что затрудняет его идентификацию.

Применение липиодола и других масляных контрастных препаратов вызывает ряд осложнений в зависимости от области их применения (высокая вязкость масляных РКС, как выше сказано, может стать причиной жировых эмболий, наиболее опасного осложнения, у некоторых пациентов наблюдаются аллергические реакции, в лимфе масляные РКС подвергаются фрагментации, что обусловливает прерывистость изображения лимфатических сосудов). В связи с этим усилия исследователей направлены на создание РКС с меньшей вязкостью, пригодных для лимфографии.

Анализ зарубежной литературы свидетельствует об интенсивных исследованиях в области создания более совершенных масляных контрастных препаратов. В нашей стране производство РКС отсутствует и в клинической практике используются только импортные средства, в связи с чем создание отечественных РКС чрезвычайно актуально и явилось задачей настоящего изобретения.

Наиболее близким к предлагаемому РКС является сверхжидкий липиодол (Lipiodol ultra fluid) (прототип) [C.Maiorovici et al., Pharmazie, 1956, v.4, N2, p.126-130], вязкость которого равна 38 сП (при 25°С), уд. вес. - 1.27 (при 25°С), содержание йода составляет 48%. Рентгеноконтрастность (денситометрическая плотность по шкале Хаунсфилда) - 2984. Препарат широко применяется для контрастирования внутренних органов, лимфатического русла и лимфатических узлов.

Получают его йодированием очищенного макового масла посредством газообразной йодистоводородной кислоты. Иодированное масло с вязкостью 4.3 П (липиодол) этерифицируют посредством этилового спирта с получением менее вязкого продукта, получившего название сверхжидкий липиодол (Guebert, Франция).

Однако использование этого РКС все же может приводить к жировым эмболиям, а также к уменьшению капиллярного объема легочных артерий - опасного сопутствующего явления. Достаточно высокая вязкость препарата приводит к длительной по времени инъекции и требует электрических инжекторов для его введения. Кроме того, препарат не дает четких изображений некоторых групп лимфатических узлов. Помимо этого, он представляет собой смесь йодированных эфиров жирных кислот и потому трудно идентифицируется.

Техническая задача настоящего изобретения состояла в получении отечественного РКС, представляющего собой легко идентифицируемое индивидуальное соединение с более низкой вязкостью, что делает его пригодным для безопасного системного применения.

Эта задача решена получением масляного РКС, представляющего собой дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты с добавлением к ней 5% этилового эфира линолевой кислоты.

Получают заявляемое РКС следующим образом.

Исходным сырьем для получения дийодоэтилового эфира линолевой кислоты является индивидуальная линолевая кислота (торговый продукт), которую после перегонки в вакууме обрабатывают этиловым спиртом в бензоле в присутствии катализатора (серной кислоты) при перемешивании в течение 3 часов и температуре 80°С. Для повышения выхода эфира в процессе реакции осуществляют азеотропную отгонку воды до полного удаления ее и избытка этилового спирта. Затем полученный этиловый эфир линолевой кислоты отделяют (жирный слой), промывают его дистиллированной водой, нейтрализуют насыщенным раствором соды и снова промывают водой, после чего сушат прокаленным сульфатом натрия. Фракция с температурой кипения 160-170°С при вакуумной разгонке полученной реакционной массы представляет собой этиловый эфир линолевой кислоты.

Этиловый эфир линолевой кислоты в петролейном эфире обрабатывают 57% раствором йодистоводородной кислоты в присутствии фосфорного ангидрида Р₂ O₅ при температуре 20°С, охлаждая реакционную смесь льдом с солью. После этого нижний слой реакционной смеси отделяют (фосфорная кислота), а верхний (дийодированный эфир линолевой кислоты в петролейном эфире) нейтрализуют, дегалогенизируют, отмывают и сушат, после чего отгоняют петролейный эфир. В полученный йодированный эфир линолевой кислоты добавляют 5% исходного этилового эфира линолевой кислоты (для повышения его стабильности). Содержание йода в готовом продукте составляет 48%, плотность его - 1.18, вязкость - 15.2 сП, рентгеноконтрастность - 2958 (для сравнения вязкость сверхжидкого липиодола - 38 сП, плотность - 1.27, рентгеноконтрастность - 2984, содержание йода - 48%).

Приводим результаты доклинического изучения заявляемого РКС.

Объем проводимых испытаний определялся "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (МЗ РФ, М., 2000, 398 с.) и "Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств Good Laboratory Practice (GLP)». Дозы препарата (в мг/кг) брались из расчета на дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты.

ИЗУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ ЗАЯВЛЯЕМЫХ ПРЕПАРАТОВ

1. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ

Острую токсичность препарата изучали на половозрелых белых мышах и белых крысах линии Wistar.

В экспериментах на грызунах методом рандомизации животных разбивали на группы. В качестве критерия приемлемости рандомизации считали отсутствие у животных признаков заболеваний и гомогенность групп (по 5 животных) по полу и массе тела (±20%). Белым мышам препарат вводили внутрибрюшинно, крысам - внутривенно в возрастающих дозах по Литчфолду-Уилкоксону (точность дозирования достигалась изменением объема вводимого препарата). Дозы препарата (из расчета на дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты) при внутрибрюшинном введении составляли 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1000, 2000 и 3000 мг/кг.

После острого опыта грызуны наблюдались в течение 14 дней (1-й день - непрерывное наблюдение). Оценивали интегральные показатели: внешний вид животных (состояние волосяного и кожного покровов, места инъекции), поведение, симптомы интоксикации, прирост массы тела (определение исходной массы, на 7 и 14 сутки), потребление пищи и воды за сутки (определение исходного потребления, на 7 и 14 сутки). Также проводили оценку выделительной системы (частота мочеиспускания, цвет мочи), сердечно-сосудистую и дыхательную системы (частота дыхательных движений, частота сердечных сокращений - определение исходной частоты, на 7 и 14 сутки), пищеварительной системы (количество и консистенция фекальных масс - определение исходного количества за сутки, на 7 и 14 сутки), центральной и периферической нервной системы (поведенческие реакции, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, реакция на тактильные, звуковые, болевые и световые раздражители).

Проводили макроскопическое исследование внутренних органов погибших животных (головной мозг, сердце, печень, почки, легкие, селезенка, надпочечники, желудок, кишечник, мочевой пузырь, поджелудочная железа, тимус). При отсроченной гибели проводилось микроскопическое исследование органов.

Результаты исследования острой токсичности

1.1. Токсикометрия

Летальность белых мышей при внутрибрюшном введении препарата в течение 14 дней наблюдения отсутствовала.

Летальность крыс линии Wistar при внутривенном введении отмечена лишь в дозе 3000 мг/кг и составила к 14 дню 6 крыс (3 самца и 3 самки).

Расчет острой токсичности по методу пробит-анализа

Дозы (мг/кг)

ED16 = 2296 ED50 = 2842 ED84 = 3519

Как свидетельствуют полученные данные, препарат обладает крайне низкой токсичностью.

1.2. Влияние однократного введения препарата на интегральные и функциональные показатели.

На протяжении всего периода наблюдения (вводимые дозы препарата ежедневно в течение 14 дней белым мышам внутрибрюшинно по 2000, 3500 и 5000 мг/кг, крысам - внутривенно по 1000, 2000 и 3000 мг/кг) отклонений от нормы по общему состоянию и поведению у выживших животных опытных групп отмечено не было. Наблюдалась равномерная прибавка массы животных во время всего срока наблюдения, что доказывало отсутствие отсроченного токсического действия препарата.

Для регистрации потребления животными воды и пищи в эти же временные сроки через 2 часа после введения препарата животных на сутки высаживали в обменные клетки.

Проведенные исследования показали, что при введении препарата во всех дозах отмечалось небольшое увеличение потребления корма к 14 суткам после введения. В группах животных с внутривенным введением препарата в дозах 2000 и 3000 мг/кг наблюдалось и увеличение потребления воды.

Оценка выделительной функции почек проводилась по количеству суточной мочи крыс. Также оценивалась частота мочеиспускания, цвет и прозрачность мочи.

Моча во всех группах на всех сроках наблюдения была прозрачная, цвет колебался от светло-желтого до темно-желтого. Динамика суточного количества мочи у крыс позволила сделать вывод об отсутствии влияния препарата на ее суточное количество. Статистически значимого различия между исходными показателями и суточным количеством мочи после введения препарата выявлено не было.

Параметром оценки сердечно-сосудистой системы (ССС) была выбрана частота сердечных сокращений (ЧСС). Проведенное исследование показало, что у животных (крыс) с однократным внутривенным введением препарата в дозах 1000, 2000 и 3000 мг/кг только при введении дозы 3000 мг/кг отмечается склонность к тахикардии.

Параметром оценки дыхательной системы (ДС) крыс была частота дыхательных движений (ЧДД) при однократном внутривенном введении препарата в дозах 1000, 2000 и 3000 мг/кг. Полученные результаты показали, что во всех дозах статистически значимых различий с исходными значениями по параметру ЧДД выявлено не было.

Функцию пищеварительной системы у белых мышей и крыс оценивали по количеству и консистенции фекальных масс. При внутрибрюшинном и внутривенном введении препарата во всех дозах изменений по количеству и консистенции фекальных масс ни у белых мышей, ни у крыс зарегистрировано не было.

1.3. Паталогоанатомические исследования

Животные всех экспериментальных групп по истечении периода наблюдения (14 дней) были выведены из эксперимента. Дозы препарата при внутрибрюшинном введении составляли 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1000, 2000, 3000 мг/кг (по 10 животных на каждую группу - 5 самок, 5 самцов). Внешних различий между животными опытных групп не выявлено.

Шерсть мышей и крыс имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Питание животных удовлетворительное. Кожа и подкожная клетчатка в месте введения препарата изменений не представляли. Инфильтратов, раздражения или некроза тканей в месте введения не наблюдалось.

При макроскопическом исследовании отчетливого влияния препарата на состояние внутренних органов не установлено. При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось.

Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и плотность, розовато-красный цвет. Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию.

Величина и форма сердца изменений не имели. Мышца сердца была коричневой, плотной.

Поверхность легких имела бледно-розовую окраску; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка вне легочных бронхов была гладкой, блестящей, бледно-розовой.

Желудок имел обычную форму и размеры, просвет был заполнен плотным пищевым содержимым. Слизистая тела желудка была бледно-розовой, блестящей, складчатой. Слизистая тонкой и толстой кишки была блестящей, гладкой.

Печень умеренно увеличена. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию.

Поджелудочная железа была бледно-розовой, дольчатой.

Величина и форма почек не отличались от контроля, капсула легко снималась. Поверхность органа была гладкой, однородной коричнево-сероватой окраски. На разрезе почек четко различались корковое и мозговое вещество.

Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или яичек не отличались от обычных.

Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотную консистенцию.

Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество головного мозга имело умеренную плотность. Расширения желудочков мозга не наблюдалось.

У крыс с летальным исходом при внутривенном введении препарата в дозе 3000 мг/кг при вскрытии были обнаружены следующие изменения:

- в легких на поверхности разреза выступает пенистая жидкость бледно-розового цвета;

- сосуды оболочек мозга полнокровны;

- печень умеренно увеличена, ткань бледного цвета, зернистой консистенции.

Проведенные испытания свидетельствуют об отсутствии противопоказаний для медицинского применения исследуемого препарата по показателям острой токсичности.

2. ПОДОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ

Эксперименты по изучению подострой токсичности препарата выполнялись на 48 половозрелых крысах обоего пола линии Wistar, объединенных в рандомизированные группы для проведения исследования.

Исследуемый препарат вводили ежедневно в течение 28 дней внутрибрюшинно в дозах 900 мг/кг и 1800 мг/кг и внутривенно (в хвостовые вены) в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг. Каждая группа животных состояла из 5 самцов и 5 самок.

Общая продолжительность наблюдения за животными составила 28 дней. Состояние животных (состояние волосяного и кожного покрова, места инъекции, поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, симптомы интоксикации) фиксировалось ежедневно. Взвешивание животных, потребление пищи и воды за сутки выполнялось раз в неделю.

Физиологические и биохимические исследования проводили до начала опыта (фоновые значения), на 7 и 14 дни.

После окончания введения препарата животные всех экспериментальных групп были подвергнуты эвтаназии и направлены на вскрытие и патоморфологическое исследование.

2.1 Токсикометрия

При введении препарата в дозах 900 мг/кг внутрибрюшинно и 140 мг/кг внутривенно смертности животных в течение 28-дневного ежедневного введения препарата отмечено не было. Так как в течение первых 14 суток от момента ежедневного введения летальности среди животных даже с дозами внутрибрюшинного и внутривенного введения 1800 и 1400 мг/кг соответственно не отмечалось, сроки введения препарата продлили до 28 суток. После 16 суток животные умирали (4 самки и 4 самца) на фоне дыхательной недостаточности при внутривенном введении и на фоне общей интоксикации при внутрибрюшинном введении.

Расчет подострой токсичности при внутрибрюшинном введении

ДОЗА - 1800 мг/кг

Самцы: Дозы (мг/кг)

ED16 = 28046 ED50 = 35622 ED84 = 45246

Самки: Дозы (мг/кг)

ED16 = 21570 ED50 = 32588 ED84 = 49236

Вывод: результаты проведенных исследований показали, что изучаемое соединение обладает низкой токсичностью при внутрибрюшинном введении. Суммарная летальная доза препарата при внутрибрюшинном введении составила 32588 мг/кг, что соответствует VI классу токсичности (относительно безвредно). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Расчет подострой токсичности при внутривенном введении препарата

ДОЗА - 1400 мг/кг

Самцы: Дозы (мг/кг)

ED16 = 23966 ED50 = 28007 ED84 = 32729

Самки: Дозы (мг/кг)

ED16 = 21245 ED50 = 26928 ED84 = 34132

Вывод: результаты проведенных исследований показали, что изучаемое соединение обладает низкой токсичностью при внутривенном введении. Полученные данные позволили рассчитать коэффициент кумулятивной активности ЛД _50(N)/ЛД₅₀₍₁₎, который составил около 10, что соответствует очень слабой кумулятивной активности (практически отсутствие). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Общий вывод: вещество относится к 4 классу опасности по степени воздействия на организм.

2.2. Влияние препарата на лабораторные показатели периферической крови крыс.

Биохимические и гематологические исследования проводили на 14 и 28 дни от начала введения препарата. Кровь получали пункцией хвостовой вены или (в конце исследования) после одномоментного гильотирования животных.

После ежедневного внутрибрюшинного введения препарата в дозах 900 мг/кг и 1800 мг/кг и внутривенного введения в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг в периферической крови крыс определяли следующие лабораторные показатели: эритроциты, гемоглобин, гематокрит, цветовой показатель, средний объем эритроцитов, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, тромбоциты, лейкоциты, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, продолжительность свертывания, начало и окончание свертывания крови.

Полученные данные свидетельствовали о том, что ежедневное внутрибрюшинное введение препарата не приводит к значимым отклонениям, в лабораторных показателях крови на 14 день, на 28 день отмечен лейкоцитоз и повышение относительного содержания нейтрофилов, что следует расценить как признак реактивной воспалительной реакции брюшины (перитонит) в результате длительного введения препарата. При внутривенном введении препарата в дозе 140 мг/кг отклонений в лабораторных показателях от нормы не наблюдалось. При введении препарата в дозе 1400 мг/кг на 14 день отклонений также не отмечалось, а к 28 дню имела место 100% летальность животных.

Биохимические показатели крови определяли после ежедневного внутрибрюшинного введения препарата в дозах 900 и 1800 мг/кг и внутривенного введения в дозах 140 и 1400 мг/кг, которые включали общий белок, креатинин, мочевину, холестерин, глюкозу, билирубин общий, аланинаминотрансферазу, щелочную фосфатазу, натрий и калий также через 14 и 28 дней от начала введения препарата.

Полученные данные свидетельствовали о том, что ежедневное внутривенное и внутрибрюшинное введение препарата не приводит к значимым отклонениям биохимических показателей периферической крови у выживших животных.

2.3. Результаты гистологического исследования

Объекты исследования фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Для гистологического исследования использовались препараты головного мозга, печени, сердца, почек и легких в окрасках гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и Суданом Ш.

Исследование препаратов животных, погибших в ходе эксперимента при внутривенном введении препарата в дозе 1400 мг/кг, показало следующее:

В печени резко выраженное полнокровие, особенно в центральных отделах долек. Балочная и дольковая структура печени сохранена. Цитоплазма гепатоцитов хлопьевидна или мелко вакуолизирована. Купферовские клетки немногочисленны.

В мозге резко выраженное полнокровие сосудов мозга и оболочек. В части сосудов мозга очаговые экстравазаты. Обратимые дистрофические изменения нейронов. Вокруг сосудов встречаются отдельные клетки в состоянии апоптоза (апоптозные тельца и обломки ядерного хроматина).

В селезенке отмечается полнокровие. Лимфоидные фолликулы довольно крупные. Светлые центры отсутствуют. Периартериальные зоны широкие. В красной пульпе диффузно расположенные макрофаги в умеренном количестве.

Таким образом, изучение органов животных, погибших в ходе эксперимента, выявило резко выраженные нарушения кровообращения в изученных органах, что сопровождалось дистрофическими изменениями паренхиматозных элементов в головном мозге и печени.

При исследовании почек, сердца, головного мозга животных на 14 и 28 сутки от введения препарата не получено существенной разницы изученных параметров. Не выявлено зависимости структуры указанных органов от дозы и пути введения, а также от сроков эксперимента.

В печени состояние гепатоцитов характеризовалось большей выраженностью дистрофических изменений на 14 сутки (варианты белковой дистрофии) по сравнению с 28 сутками. Убедительных признаков жировой дистрофии или накопления препарата в печени не выявлено ни у одного животного.

В легких на поздних сроках эксперимента вне зависимости от пути введения препарата постоянно выявлялось накопление жирсодержащих веществ (препарата) в сосудах мелкого калибра и/или макрофагах (у 6 из 7 животных против 2 из 8 на ранних сроках). Это не сопровождалось существенными изменениями структуры бронхов или респираторных отделов. Не было отмечено и обогащения свободными клетками.

Резюме по подострой токсичности

Описанные выше результаты экспериментов на половозрелых крысах линии Wistar показали, что изучаемое соединение обладает низкой токсичностью при внутрибрюшинном и внутривенном путях введения. Суммарная летальная доза при его внутрибрюшинном введении составила 32588 мг/кг, при внутривенном - 26928 мг/кг, что соответствует VI классу токсичности (относительно безвредно). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Заявляемое РКС относится к 4 классу опасности по степени воздействия на организм. Многократное введение препарата может вызвать воспалительную реакцию.

3. Изучение аллергенных свойств препарата

Исследование аллергенных свойств препарата проводили в соответствии с «Методическими указаниями по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» МЗ РФ, 2000.

Эксперименты проводились на белых крысах линии Wistar с массой тела 200-225 г.), белых беспородных мышах с массой тела 18-20 г., морских свинках-альбиносах (масса тела 250-300 г.).

Все экспериментальные животные проходили карантин длительностью 14 дней. В течение этого периода проводили ежедневный осмотр животных, оценивали поведение и общее состояние, больных или отличающихся по поведению животных отбраковывали. Перед началом эксперимента животные, отвечающие критериям включения в исследование, распределены на группы с помощью метода рандомизации.

При исследовании аллергенных свойств препарата применяли регистрацию реакции общей анафилаксии (морские свинки), исследовали реакции иммунных комплексов (крысы), реакцию гиперчувствительности замедленного типа (мыши), применяли метод накожных аппликаций (морские свинки).

3.1. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок).

Морским свинкам препарат вводили в эффективной диагностической дозе (140 мг/кг) и в дозе, в 10 раз ее превышающей (1400 мг/кг): первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в объеме, соответствующем объему исследуемого препарата.

На 21 день после сенсебилизирующей инъекции животным внутривенно вводили разрешающую дозу препарата, равную суммарной сенсебилизирующей. Аналогичную дозу вводили морским свинкам контрольных групп. Учет интенсивности анафилактического шока проводился в индексах по Wiegle:

++++ - шок со смертельным исходом;

+++ - шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает);

++ - шок умеренный (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма);

+ - шок слабый (некоторое беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошенная);

0 - шок не развился, признаки его отсутствуют.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что препарат в диагностической дозе обладает незначительными аллергизирующими свойствами. У половины животных был зафиксирован шок слабой степени (+ по шкале Wiegle). При введении препарата в дозе 1400 мг/кг в ряде случаев отмечался шок со смертельным исходом (++++ по шкале Wiegle). Следует отметить, что и в группе контрольных животных, получивших ту же разрешающую дозу, также отмечался шок со смертельным исходом.

3.2. Реакция иммунных комплексов

Для постановки реакции использовали белых крыс линии Wistar, которым препарат вводили в дозах 140 и 1400 мг/кг. В контрольных группах использовали физиологический раствор в таком же объеме. Сенсибилизацию проводили подкожно, пятикратно с интервалом в 6 суток.

Через 10 суток после последнего введения препарата осуществляли введение разрешающей дозы внутрикожно.

Разрешающую дозу препарата определяли на интактных животных. За разрешающую дозу принимали наибольшее разведение антигена, не вызывающее видимых изменений в коже через час после введения. В контрольных группах в таком же объеме вводили растворитель.

Учет реакции проводили визуально по пятибалльной системе:

0 - видимой реакции нет;

1 - бледно-розовая эритема по всему участку или его периферии;

2 - ярко- розовая эритема по всему участку или его периферии;

3 - красная эритема по всему участку;

4 - инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы;

5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления (некроз), возможны геморрагии, образование корочек.

В положительном случае уже через 30 мин на месте инъекции может развиться отек и гиперемия. Через 2-3 ч воспалительный очаг может уплотниться и кожа становится буро-красной. При гистологическом исследовании в случае положительной реакции может быть обнаружено острое геморрагическое воспаление, в инфильтрированном участке могут быть видны полиморфно-ядерные лейкоциты.

Из полученных в результате проведенных исследований данных следует, что при сенсибилизации животных диагностической дозой препарата признаков реакции иммунных комплексов обнаружено не было. В случае десятикратного ее превышения в месте введения отмечался лишь незначительный отек без гиперемии.

По данным гистологического исследования, при сенсибилизации дозой 140 мг/кг признаков отека, полнокровия, клеточной реакции нет. При окраске по Ван-Гизону соединительная ткань фуксинофильна. Судан-положительные включения располагаются на уровне придатков, местами достигают сосочкового слоя.

При сенсибилизации крыс дозой 1400 мг/мл в гистологических препаратах кожи отмечается отек и полнокровие дермы, очаговые кровоизлияния. При окраске по Ван-Гизону выраженная пикринофилия. Судан-положительные каплевидные включения располагаются преимущественно на уровне придатков кожи, местами - вплоть до сосочкового слоя дермы. Клеточной реакции нет.

3.3. Метод накожных аппликаций.

Исследование сенсибилизирующего действия препарата проводили путем 10 повторных накожных аппликаций на участок боковой поверхности туловища морских свинок-альбиносов. Нанесение препарата на кожу в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг проводилось 5 раз в неделю на протяжении двух недель. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб С.В.Суворова.

Возникновение красной эритемы по всему участку кожи отмечалось у животных с нанесением 1400 мг/кг через 7 аппликаций. У животных с нанесением 140 мг/кг отмечалось лишь возникновение транзиторной бледно-розовой эритемы по всему участку. У ряда животных этой группы визуально изменений на коже выявить не удалось.

Таким образом, развитие контактного дерматита при накожном нанесении препарата возможно только при десятикратном увеличении суточной дозировки.

3.4. Реакция гиперчувствительности «замедленного типа»

Эксперимент проводился на 10 мышах (5 самцов, 5 самок). Мышей сенсибилизировали однократно путем внутрикожного введения препарата в основание хвоста в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Группе контроля (мыши, 5 самцов, 5 самок) вводился раствор ПАФ с раствором Хэнкса. Для выявления сенсебилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы вводили 40 мкл 10 мМ раствора препарата в растворе Хенкса. Регистрировали величину отека с помощью инженерного микрометра через 6, 22 и 24 часа. Животных контрольной группы сенсебилизировали ПАФ с растовром Хенкса по той же схеме. Разница в толщине обеих лапок характеризует величину отека, по которой можно судить об интенсивности реакции гиперчувствительности «замедленного типа» (ГЗТ).

Полученные данные свидетельствовали о том, что реакция ГЗТ в экспериментальной группе не развивалась.

3.5. Резюме по оценке аллергизирующих свойств

Препарат обладает умеренным аллергизирующим действием, однако при превышении дозировки возможно развитие анафилактического шока, контактного дерматита и гипречувствительности, обусловленной образованием иммунных комплексов. Во избежание развития анафилатического шока следует исключить применение препарата при аллергиях на йодсодержащие препараты в анамнезе.

4. Иммунотоксическое действие

Исследование проводили на мышах линии Balb с весом 18-20 г. Общее количество животных - 60 особей.

Животные были разделены на три группы:

1. Группа контроля - животные (10 самцов и 10 самок), которым в течение двух дней подкожно вводили физиологический раствор.

2. Подопытные животные (10 самцов и 10 самок), которым подкожно вводили исследуемый препарат в дозе 140 мг/кг веса.

3. Подопытные животные (10 самцов и 10 самок), которым подкожно вводили препарат в дозе 1400 мг/кг веса.

На 8 день после первого введения препарата проводили оценку состояния иммунной системы подопытных и контрольной животных. У части мышей (15 самцов и 15 самок) определяли массу и клеточность лимфоидных органов, а также фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов.

Другая часть животных (15 самцов и 15 самок) была использована для оценки иммунного ответа на эритроциты барана.

Оценка массы и клеточности органов иммунной системы

1. Животных умерщвляли с помощью дислокации шейных позвонков, вырезали у каждого животного 4 лимфоузла (2 паховых и 2 подмышечных), тимус и селезенку.

Взвешивание органов проводили на торсионных весах.

2. Из селезенки, тимуса и лимфоузлов готовили суспензии клеток. Подсчет количества клеток в суспензии проводили после лизиса эритроцитов на кондуктометрическом счетчике частиц.

Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.

Для фагоцитоза использовали частицы коллоидной туши. 0,05% Суспензию туши в объеме 2 мл вводили внутрибрюшинно. Через 10 мин промывали полость 5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Полученные таким образом клетки перитонеального экссудата (КПЭ) трижды отмывали, ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева содержание ядросодержащих и процент фагоцитирующих клеток.

Определение титра антител в сыворотке крови мышей.

Мышам контрольной и двух подопытных групп вводили внутрибрюшинно суспензию эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе в субоптимальной дозе, равной 5×10 ⁷ ЭБ/мышь. На 7 день после введения эритроцитов от мышей брали кровь и определяли титр антител против ЭБ методом гемагглютинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Масса лимфоидных органов животных подопытных групп не отличалась достоверно от соответствующего показателя животных контрольной группы.

2. Клеточность лимфоидных органов после введения препарата оставалась в пределах контрольных значений.

3. Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов показало, что введение препарата в дозе 140 мг/кг не влияло ни на количество клеток в брюшной полости, ни на их фагоцитарную активность. В то же время введение препарата в дозе 1400 мг/кг снижало количество клеток в полости. При этом процент фагоцитирующих клеток увеличивался в 2-3 раза.

4. Определение титра антител против эритроцитов барана показало, что у животных, получивших препарат в дозе 140 мг/кг, титры антител в точности соответствуют контрольным значениям. В группе животных, получавших препарат в десятикратно увеличенной дозе, у части особей титр антител был в 2-4 раза выше, чем в контроле. Однако эти отклонения находятся в пределах ошибки метода титрования и потому их нельзя считать достоверными.

5. Мутагенные свойства

Исследование проводилось на мышах весом 18-20 г. (общее количество - 28 особей). Учет аберраций хромосом в первой серии опытов проводился только на самцах, препарат вводили однократно подкожно в дозах 140 и 1400 мг/кг (на дозу - 4 мыши), группе контроля (4 мыши) вводили физиологический раствор. Фиксацию клеточного материала (красный костный мозг и семенники) осуществляли через 24 ч после введения.

Во второй серии опытов препарат в дозе 140 мг/кг вводили подкожно ежедневно в течение 5 дней на самцах и самках (8 мышей, из них 4 самца и 4 самки, группа контроля - 8 мышей, из них 4 самца и 4 самки). Фиксация клеточного материала (красный костный мозг у самцов и самок, семенники у самцов) проводилась через 24 ч после последнего введения. Затем проводился микроскопический цитогенетический анализ приготовленных препаратов.

Полученные в результате проведенного исследования данные свидетельствовали о наличии мутагенного эффекта препарата в дозе, десятикратно превышающей эффективную диагностическую дозу. При однократном и многократном применении препарата в дозировке 140 мг/кг мутагенный эффект не выявлен.

6. Исследование ренттеноконтрастных свойств

Исследование проводилось на половозрелых крысах линии Wistar (всего 20 особей). Осуществлялось внутрисосудистое введение препарата в дозе 140 мг/кг (в хвостовую вену) с рентгеновскими снимками через 5 и 10 мин от момента введения (5 самцов опытная группа, 5 самцов - контрольная группа с введением липиодола ультра-флюида). Второй группе животных производилось подкожное введение исследуемого препарата с рентгеновскими снимками через 10 мин от момента введения (5 самцов опытная группа, 5 самцов - контрольная группа с введением липиодола ультра-флюида). Доза введения препарата - 900 мг/кг. Рентгеновское исследование осуществлялось с помощью рентгеновского аппарата «ДИАГНОМАКС М-25».

При подкожном введении препарата на серии полученных рентгенограмм визиализируется рентгеноконтрастное образование в месте введения (имбибиция мягких тканей), размером, соответствующим количеству введенного препарата.

При внутривенном введении наибольшая контрастность определялась в хвостовой вене по ходу введения на протяжении 30 мм. Меньшая степень контрастности определялась в сосудистой системе печени, легких, головного мозга. Такая картина сохранялась на всех временных периодах исследования.

При сравнении результатов рентгеновского исследования, полученного при аналогичном введении липиодола ультра-флюида, при визуальном исследовании существенных отличий с исследуемым препаратом не получено.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что рентгеноконтрастные свойства исследуемого препарата сопоставимы с таковыми у препарата сравнения («Липиодол Ультра-флюид»).

На основании проведенных исследований стало возможным определить области применения заявляемого препарата: диагностика методом гепатографии, гистеросальпингографии, везикулографии, лимфографии, сиалографии, фистулографии и паллиативное лечение первичных и метастатических опухолей печени, почки методом масляной химиоэмболизации.

Рекомендуемые способы введения: в артерии печени, почки, поджелудочной железы, воротную вену, лимфатический сосуд, проток слюнной железы, свод ступни или кисть руки, лимфография в конечности, сиалография.

На заявляемое РКС подготовлен проект ФСП, который подан в ФГУП «Научный центр экспертизы средств медицинского применения».

Подготовлены документы для подачи в Фармакологический и Фармакопейный Комитеты на регистрацию препарата в качестве РКС.