антимикробный препарат

Формула изобретения

Антимикробный препарат, включающий бактериальную нуклеазу - продукт гена nucA (синоним nuc), отличающийся тем, что дополнительно содержит электроактивированный водно-солевой раствор, включающий 0,1 мас.% йодита калия и 0,3 мас.% хлорида натрия, и в качестве стабилизатора глицерин или сахарозу или поливинилпирролидон или глюкозу или альбумин.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарии, сельскому хозяйству, медицине, биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты от инфекций, вызываемых микроорганизмами.

В настоящее время рынок насыщен препаратами, ингибирующими рост и развитие микроорганизмов. Однако до сих пор не создан надежный универсальный препарат, способный угнетать рост и развитие бактерий, грибов, в также ДНК- и РНК-содержащих вирусов, оставаясь при этом нетоксичным для человека и животных. Обычно отсутствие видо- и типоспецифичности препаратов сочетается с их острой токсичностью в отношении теплокровных организмов или (и) агрессивностью в отношении окружающей среды.

Наиболее близким к заявляемому препарату является препарат «Эндоглюкин», созданный на основе бактериальной эндонуклеазы и применяемый для борьбы и профилактики инфекций пчел, вызываемых рядом РНК-содержащих вирусов [1].

Бактериальная эндонуклеаза - продукт структурного гена nuc, исходно найденного в геноме бактерий S.marcescens и позднее клонированного и экспрессированного в клетках S.marcescens и Е.colli [2]. Поскольку бактериальная эндонуклеаза - это природный биологический катализатор белковой природы, она нетоксична благодаря способности к самопроизвольной инактивации и безвредна для человека, животных и растений. Присутствие в среде бактериальной эндонуклеазы ускоряет нарушение фосфодиэфирных связей ДНК и РНК по сравнению с их спонтанным разрушением в 10¹⁶ раз. Фермент гидролизует нуклеиновые кислоты по эндонуклеолитическому механизму до моно-, ди-, три-, тетра- и олигонуклеотидов, чем обусловлено его воздействие на вирусы.

Влияние бактериальной эндонуклеазы на рост и размножение бактерий и грибов отсутствует, что было установлено в ходе разработки «Ингибитора РНК-геномных бактериофагов» для микробиологической промышленности и биотехнологии [3].

Задачей изобретения является расширение спектра действия бактериальной эндонуклеазы, т.е. создание препарата, обладающего вирулицидным, фунгицидным, бактерицидным и хламидиоцидным действием без выраженной видо- и типоспецифичности.

Поставленная задача решается применением препарата бактериальной эндонуклеазы в комбинации с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1% йодита калия и 0,3% хлорида натрия (препарат «Йодохлорин»), и стабилизатором.

Препарат эндонуклеазы представляет собой раствор с активностью не менее 10000 ед./мл (удельная активность 10000 ед./мг белка), содержащий 1 М Трис-HCl буфер, рН 6,5-9,5, и не менее 0,5 моль/л ионов магния.

Стабилизатор представляет собой 40-80% глицерин, или 30-70% сахарозу, или 50-90% поливинилпирролидон, или 40-80% глюкозу, или 0,5-10% альбумин.

Пример: Антимикробное действие испытывали в непосредственном контакте микроорганизмов с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1 мас.% йодита калия и 0,3 мас.% хлорида натрия, и 0,01% бактериальной эндонуклеазой в присутствии стабилизатора. Комбинированный препарат получали, смешивая равные объемы электроактивированного водно-солевого раствора (препарат «Йодохлорин»), исходно содержавшего 0,2 мас.% йодита калия и 0,6 мас.% хлорида натрия, и 0,02% раствора бактериальной эндонуклеазы, предварительно разведенной в 100 раз раствором стабилизатора. Фунгицидное, бактерицидное и хламидиоцидное действие оценивали по изменению числа жизнеспособных клеток стандартными методами. Вирулицидную активность определяли в отношении бактериофагов E.coli в перекрестном тесте на чашках Петри.

Минимальное время контакта микроорганизмов с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1 мас.% йодита калия и 0,3 мас.% хлорида натрия, и бактериальной эндонуклеазой в присутствии стабилизатора, вызывающее 40-90% снижение жизнеспособности микроорганизмов: РНК- и ДНК-содержащих вирусов, грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая хламидии, а также несовершенных грибов, - при 20-40°, составляло 1 мин.

Созданный принципиально новый препарат обладает широким спектром действия в отношении микроорганизмов разных групп и представляет собой нетоксичное, экологически чистое вещество, проявляющее активность при мягких физиологических условиях.

Полученные данные показывают возможность применения препарата в качестве универсального средства защиты при инфекциях различной этиологии (бактерии, хламидии, грибы и вирусы), микробиологических и биотехнологических процессов от бактериофагов, а также в различных отраслях животноводства. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Микроорганизмы	Препарат		Доза (мг, мас.%) или концентрация (%)		Время экспозиции, мин	Снижение жизнеспособности, %
						Опыт	Контроль
1	2		3		4	5	6
Ser. marcescens	Иодохлорин		0,1-0,3		1	40	0
St. aureus			0,1-0,3		1	20	0
Aspergillus niger			0,1-0,3		1	0	0
Ascosphera apis			0,1-0,3		1	0	0
Chl. psittaci			0,1-0,3		1	10	0
Фаг fd			0,1-0,3		1	0	0
Фаг Т4			0,1-0,3		1	0	0
Ser. marcescens	Эндонуклеаза		0,01		1	0	0
St. aureus			0,01		1	0	0
Aspergillus niger			0,01		1	0	0
Ascosphera apis			0,01		1	0	0
Chl. psittaci			0,01		1	0	0
Фаг fd			0,01		1	20	0
Фаг f2			0,01		1	40	0
Ser. marcescens	Глицерин		39,6		1	0	0
St. aureus			39,6		1	0	0
Aspergillus niger			39,6		1	0	0
Ascosphera apis			39,6		1	0	0
Chl. psittaci			39,6		1	0	0
Фаг fd			39,6		1	0	0
Фаг f2			39,6		1	0	0
Ser. marcescens	Сахароза		29,7	1		0	0
St. aureus			29,7	1		0	0
Aspergillus niger			29,7	1		0	0
Ascosphera apis			29,7	1		0	0
Chl. psittaci			29,7	1		0	0
Фаг fd			29,7	1		0	0
Фаг f 2			29,7	1		0	0
Ser. marcescens	Поливинилпирролидон		44,6	1		0	0
St. aureus			44,6	1		0	0
Aspergillus niger			44,6	1		0	0
Ascosphera apis			44,6	1		0	0
Chl.psittaci			44,6	1		0	0
Фаг fd			44,6	1		0	0
Фаг f 2			44,6	1		0	0
Ser. marcescens	Глюкоза		39,6	1		0	0
St. aureus			39,6	1		0	0
Aspergillus niger			39,6	1		0	0
Ascosphera apis			39,6	1		0	0
Chl. psittaci			39,6	1		0	0
Фаг fd			39,6	1		0	0
Фаг f 2			39,6	1		0	0
Ser. marcescens	Альбумин		0,495	1		0	0
St. aureus			0,495	1		0	0
Aspergillus niger			0,495	1		0	0
Ascosphera apis			0,495	1		0	0
Chl. psittaci			0,495	1		0	0
Фаг fd			0,495	1		0	0
Фаг f 2			0,495	1		0	0
Ser. marcescens			0,1-0,3	1		90	0
			0,01
			39,6
St. aureus			0,1-0,3	1		80	0
			0,01
			39,6
Aspergillus niger			0,1-0,3	1		50	0
	Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ глицерин		0,01
			39,6
Ascosphera apis			0,1-0,3	1		50	0
			0,01
			39,6
Chl. psittaci			0,1-0,3	1		60	0
			0,01,
			39,6
Фаг fd			0,1-0,3	1		80	0
			0,0111
			39,6
Фаг f2			0,1-0,3	1		70	0
			0,01
			39,6
Ser. marcescens			0,1-0,3	1		80	0
			0,01
			29,7
St. aureus			0,1-0,3	1		70	0
			0,01
			29,7
Aspergillus niger			0,1-0,3	1		40	0
			0,01
		Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ сахароза	29,7
Ascosphera apis			0,1-0,3	1		40	0
			0,01
			29,7
Chl.psittaci			0,1-0,3	1		50	0
			0,01
			29,7
Фаг fd			0,1-0,3	1		50	0
			0,01
			29,7
Фаг f2			0,1-0,3	1		60	0
			0,01
			29,7
Ser. marcescens			0,1-0,3	1		80	0
			0,01
			44,6
St. aureus			0,1-0,5	1		70	0
			0,01
			44,6
Aspergillus niger			0,1-0,3	1		40	0
		Антибактериальный препарат: Йодохлорин/ эндонуклеаза/поливинилпирролидон	0,01
			44,6
Ascosphera apis			0,1-0,3	1		40	0
			0,01,
			44,6
Chl. psittaci			0,1-0,3	1		50	0
			0,01
			44,6
Фаг fd			0,1-0,3	1		80	0
			0,01
			44,6
Фаг f2			0,1-0,3	1		80	0
			0,01
			44,6
Ser. marcescens			0,1-0,3	1		60	0
			0,01
			39,6
St. aureus			0,1-0,3	1		60	0
			0,01
			39,6
Aspergillus niger			0,1-0,3	1		40	0
		Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ глюкоза	0,01
			39,6
Ascosphera apis			0,1-0,3	1		40	0
			0,01
			39,6
Chl. psittaci			0,1-0,3	1		40	0
			0,01
			39,6
Фаг fd			0,1-0,3	1		70	0
			0,01
			39,6
Фаг f2			0,1-0,3	1		60	0
			0,01
			39,6
Ser. marcescens			0,1-0,3	1		80	0
			0,01
			0,495
St. aureus			0,1-0,3	1		70	0
			0,01
			0,495
Aspergillus niger			0,1-0,3	1		40	0
		Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ альбумин	0,01
			0,495
Ascosphera apis			0,1-0,3	1		40	0
			0,01
			0,495
Chl. psittaci			0,1-0,3	1		60	0
			0,01
			0,495
Фаг fd			0,1-0,3	1		70	0
			0,01
			0,495
Фаг f2			0,1-0,3	1		60	0
			0,01
			0,495
Ser. marcescens		Прототип «Эндоглюкин»	0,01	1		0	0
St. aureus			0,01	1		0	0
Aspergillus niger			0,01	1		0	0
Ascosphera apis			0,01	1		0	0
Chl. psittaci			0,01	1		0	0
Фаг fd			0,01	1		0	0
Фаг f2			0,01	1		54	0

Источники информации

1. Аликин Ю.С., Сенженко Л.П., Клименко В.П. Развитие технологии получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens // Ферменты микроорганизмов: Сб. Докладов XI Всероссийской конференции. - Казань, 1998. - С.152-163.

2. Ball Т.К., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli // Gene. -1987. - V.57. - P.183-192.

3. Лещинская И.Б., Шарипова Ф.Р., Филимонова М.Н., Штенц Э., Рокштро А., Клуге 3. Ингибитор РНК-геномных бактериофагов / Патент '1781295 A1, SU, С12N 9/14, приор. 31.05.90, регистр. 14.10.93.