средство оценки антиокислительной активности химических соединений и биологических жидкостей

Формула изобретения

Способ оценки антиокислительной активности химических соединений и биологических жидкостей путем индукции свободнорадикальных реакций в тест-системе на основе водных растворов в присутствии и отсутствии исследуемых соединений или исследуемых биологических жидкостей с последующим измерением быстрой вспышки хемилюминесценции и определением антиоксидантной активности по степени тушения хемилюминесценции в образцах, содержащих исследуемые соединения или исследуемую биологическую жидкость, отличающийся тем, что свободнорадикальные реакции индуцируют путем воздействия на образец в течение 5-100 с высокоэнергетическим некогерентным импульсным излучением, длительностью импульса 1-10 мс, силой тока 1 кА, напряжение на электродах 10 кВ, энергией 5 Дж в 1 импульсе.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине и биологии, а именно к биохимии, и может быть использовано, в частности, при исследовании антиоксидаитных свойств лекарственных препаратов, применяемых для коррекции процессов перекисного окисления липидов, а также для определения антиоксидантной активности биологических жидкостей организма человека и животных.

Известно, что свободнорадикальные реакции организма усиливаются вследствие различных патологических процессов [1]. Поэтому появилась необходимость в новых методах и способах ингибировать свободнорадикальные реакции и защищать органы и ткани организма от их повреждающего действия.

Об антиокислительной активности исследуемого образца судят по интенсивности и длительности вспышки хемилюминесценции и ее затуханию в тест-системах при воздействии на них или не воздействии на них исследуемого фактора. Наличие светосуммы хемилюминесценции, превышающей шумовой фон, подтверждает наличие свободных радикалов в растворе, а по гашению хемилюминесценции можно оценить способность вводимого в раствор препарата связывать свободные радикалы. В качестве тест-системы в известном способе используют цельную кровь. Свободнорадикальное окисление индуцируют, пропуская через образец крови озон в концентрации 0,26-0,35 мг/л в течение 5-7 минут, а перед измерением хемилюминесценции дополнительно усиливают ее введением в образец ионов двухвалентного железа [2].

Однако использование в качестве тест-системы плазмы крови, представляющей собой многокомпонентную систему с высокой концентрацией различных ионов и белков, усложняет способ оценки антиокислительной активности химических соединений, так как для инициирования перекисного окисления липидов, кроме воздействия озоном, необходимо дополнительно вводить в тест-системы ионы двухвалентного железа и гидроперекись третичного бутила.

В связи с решением имеющихся проблем был разработан другой способ, сокративший число трудоемких операций и увеличивший точность антиокислительной активности. В нем оценка антиокислительной активности химических и биохимических соединений решалась путем индукции свободнорадикальных реакций в тест-системе посредством озонирования в присутствии и отсутствии исследуемого соединения с последующим измерением быстрой вспышки хемилюминесценции и определением антиокислительной активности по степени тушения хемилюминесценции в образцах, содержащих исследуемое соединение, в соответствии с изобретением в качестве тест-системы используют водные растворы солей неорганического происхождения, а также би- и дистилированную воду, свободнорадикальные реакции индуцируют, пропуская через образец раствора озон в концентрации 1,2-1,6 мг/л в течение 5-10 минут [3]. Этот способ выбран в качестве прототипа.

Но и этот метод содержал ряд недостатков. Тест-системы подвергались обработке озоном, который является сильным окислителем и ядовитым газом [4]. Помимо этого, озонирование раствора является довольно трудоемкой операцией. Также свечение сохраняется на непродолжительное время (несколько минут), что позволяет провести малое количество измерений, и не всегда малое количество измерений является статистически достоверным.

Поэтому задачей изобретения является упрощение способа оценки антиоксидантиой активности за счет сокращения числа трудоемких операций, увеличение продолжительности свечения исследуемых образцов и повышение точности оценки антиокислительной активности исследуемого образца.

Новый технический результат заключается в следующем

Предлагаемое изобретение существенно упрощает способ оценки антиокислительной активности химических соединений за счет сокращения числа трудоемких операций (при озонотерапии к кислородному баллону подключается прибор озонатор, на нем выставляется определенная интенсивность озонирования кислорода, измеряемая в мг/мл, и получаемая смесь под давлением подается в исследуемый раствор на протяжении 5-10 минут, в отличие от этого в предлагаемом изобретении необходимо только поднести источник высокоэнергетического некогерентного импульсного излучения (ВНИИ) к исследуемому образцу, предварительно выставив на приборе время обработки, также продолжительность обработки сокращается до 100 с). Повышается точность оценки антиокислительной активности (так как с увеличением продолжительности свечения возможно проведение большего числа измерений, что увеличит статистическую точность) свечение может сохраняться на протяжении большего временного промежутка (1,5 ч и дольше).

Поставленная задача в способе оценки антиокислительной активности химических соединений и биологических жидкостей путем индукции свободнорадикальных реакций в тест-системе на основе водных растворов в присутствии и отсутствие исследуемых соединений или исследуемых биологических жидкостей с последующим измерением быстрой вспышки хемилюминесценции и определением антиоксидантной активности по степени тушения хемилюминесценции в образцах, содержащих исследуемые соединения, достигается тем, что свободнорадикальные реакции индуцируют путем воздействия на образец в течение 5-100 с ВНИИ, длительностью импульса 1-10 мс, силой тока 1 кА, напряжение на электродах 10 кВ, энергией 5 Дж в 1 импульсе.

В соответствии с изобретением в качестве тест-системы используют водные растворы солей неорганического происхождения, а также би- и дистиллированную воду, свободнорадикальные реакции индуцируют, облучением образца ВНИИ продолжительностью от 5 до 100 с.

Продолжительность облучения образцов установлена опытным путем. Было установлено, что обработка водных растворов ВНИИ в течение 5 с светосумма хемилюминесценции самая низкая, а при обработке более 100 с нецелесообразно, так как вспышка хемилюминесценции практически не меняется (табл.1).

Таблица №1 Уровень хемилюминесценции растворов после воздействия высокоэнергетических некогерентных импульсных излучений разной продолжительности.
Растворы	ХЛмВ 5 сек	ХЛ, мВ 25 сек	ХЛмВ 55 сек	ХЛ, мВ 100 сек	ХЛ, мВ 200 сек
Сразу после воздействия ВНИИ
Вода дистиллированная	0,45±0,042	0,75±0,074	0,91±0,089	0,6±0,058	0,62±0,06
Р-р Хенкса	0,07±0,007	0,09±0,0086	0,14±0,01	0,41±0,04	0,43±0,04
Физ.р-р	0,09±0,009	0,13±0,01	0,35±0,03	0,6±0,06	0,59±0,06
Через 1,5 часа воздействия ВНИИ
Вода дистиллированная	на уровне шума	0,87±0,09	0,95±0,09	0,55±0,05	0,56±0,055
Р-р Хенкса	0,62±0,06	0,52±0,05	0,42±0,04	0,52±0,05	0,5±0,05
Физ.р-р	0,06±0,006	0,12±0,01	0,02±0,002	0,53±0,05	0,55±0,055
Примечания: ХЛ - хемилюминесценция, физ.р-р - физиологический раствор, мВ - милливольт, ВНИИ - высокоэнергетическое некогерентное импульсное излучение, р-р Хенкса - раствор Хенкса.

Способ оценки антиокислительной активности химических соединений в соответствии с изобретением осуществляется следующим образом.

В емкость помещаются водные растворы солей неорганического происхождения, а также би- и дистиллированная вода и проводится облучение образца ВНИИ (длительность импульса 1-10 мс, сила тока 1 кА, напряжение на электродах 10 кВ, энергия 5 Дж в 1 импульсе) продолжительностью 5-100 с. После этого 1 мл облученного раствора вносят в кювету и ставят в светонепроницаемую камеру устройства, регистрируют уровень светового потока спонтанной хемилюминесценции раствора. Затем в эту же кювету, не вынимая из камеры, вносят исследуемое вещество, тщательно перемешивают и снова регистрируют уровень светового потока хемилюминесценции при закрытой створке прерывателя светового потока темновой камеры. При этом полученные результаты автоматически выводятся на цифровой регистратор устройства или экран компьютера. Степень выраженности антиокислительной активности исследуемого вещества оценивают по разности светосумм хемилюминесценции между опытным и контрольным образцами раствора.

Пример. В стеклянный сосуд помещают дистиллированную воду, где она облучается ВНИИ (длительность импульса 1-10 мл, сила тока 1 кА, напряжение на электродах 10 кВ, энергия 5 Дж в 1 импульсе) в течение 100 с, один мл раствора после обработки отбирается в измерительную кювету, помещается в светонепроницаемую камеру устройства (БХЛ-6), регистрируется светосумма хемилюминесценции (мВ) за 11 секунд. Затем измерительная кювета вынимается из измерительного прибора, в нее вносится определенное количество миксидола (в количестве 0,0125 мг/мл), и кювета снова помещается в светонепроницаемую камеру устройства, замеряется светосумма хемилюминесценции за 11 секунд. Далее полученные результаты сравниваются. По ним видно, что миксидол уменьшает светосумму хемилюминесценции, т.е. обладают антиокислительной активностью. Помимо миксидола также были использованы: гутимин, глутатион и конская сыворотка крови. Данные приведены в таблице №2.

Таблица №2 Уровень хемилюминесценции воды после воздействия высокоэнергетических некогерентных импульсных излучений продолжительностью 100 секунд до и после добавления антиоксидантов или плазмы крови.
	Вода + ВНИИ	Вода + ВНИИ + миксидол (0,0125 мг/мл)	Вода + ВНИИ + гутимин (10-6 моль/л)	Вода + ВНИИ + глутатион (10-6 моль/л)	Вода + ВНИИ + конская сыворотка крови (0,05 мл)
Уровень ХЛ, мВ	0,6±0,06	0,36±0,035	0,26±0,025	0,31±0,03	0,3±0,03
Примечания: ХЛ - хемилюминесценция, мВ - милливольт, ВНИИ - высокоэнергетическое некогерентное импульсное излучение, моль/л -моль/литр.

Источники информации

1. Журавлев Л.И., Журавлева А.И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике - М., Медицина, 1979 г., с.128.

2. Авт. свидетельство СССР №1045127, кл. G01N 33/48, 1985 г. Конторщикова К.Н., Перетягин С.П., Кузьмина Е.И. Способ определения антиоксидантной активности химических соединений.

3. Пат. РФ №2112982, МКИ G01N 33/48. Конторщикова К.Н., Иванова И.П. Способ оценки антиоксидантной активности химических и биохимических соединений.

4. Алехина C.П., Щербатюк Т.Г. Озонотерапия: клинические и экспериментальные аспекты - Н.Новгород, Литера, 2003, с.240.