способ количественного определения онкомаркера muc1 в сыворотке крови человека

Формула изобретения

Способ количественного определения онкомаркера MUC1 в сыворотке крови человека в формате прямого твердофазного двухсайтового иммунофотометрического анализа с применением тест-системы из двух моноклональных антител, взаимодействующих с онкомаркером сыворотки крови, а в контроле со стандартом онкомаркера, отличающийся тем, что в качестве тест-системы используют пару моноклональных антител M3F1/M3B11, для выявления образовавшихся комплексов антиген-антитело используют Mab-пероксидазный коньюгат с последующим введением красителя ТМБ, а в качестве стандарта онкомаркера выделенный из жировых глобул молока человека антиген MUC1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и клинической иммунологии и состоит в разработке способа количественного определения уровня онкомаркера (антигена) MUC1 в сыворотке крови человека при диагностике рака молочной железы (РМЖ) путем прямого твердофазного двухсайтового иммунофотометрического анализа (ИФА).

Антиген MUC1 представляет собой высоко гликозилированный трансмембранный белок, который обнаруживают как в нормальных, так и в злокачественных эпителиальных клетках (Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1241: 407-424). Молекула MUC1 состоит из трех доменов: цитоплазматического, трансмембранного и экстрацеллюлярного. Внеклеточный связанный с мембраной компонент антигена характеризуется высоким полиморфизмом. В нормальных физиологических условиях полиморфный MUC1 антиген экспрессируется на поверхности клеток и выполняет различные физиологические функции (J.Nucl.Med.Allied Sci 1990; 34 (Suppl 3):151-162).

Часть мембраносвязанного антигена представляет собой растворимую форму MUC1 антигена (sMUC1) и циркулирует в различных жидкостях организма. Растворимые формы MUC1 обнаружены в грудном молоке, периферической крови, моче человека, а также в супернатантах культур опухолевых клеточных линий (Biochim Biophys Acta. 1995; 1241:407-424; Int J Cancer. 1995; 63:412-418; Cancer Res. 1987; 47:5476-5482; Dis Markers. 1988; 6, 185-194).

По данным Европейского общества онкологов антиген MUC1 наряду с раковоэмбриональным антигеном (РЭА) является одним из главных онкомаркеров при диагностике РМЖ (EGTM// Tumor markers in breast cancer - EGTM recomendation, 1999). Наиболее изучен представитель семейства MUC1 антиген СА 15.3.

Известно, что процесс злокачественного роста сопровождается повышением уровня опухолевых маркеров в сыворотке. У больных с аденокарциномой обнаружено повышение уровня СА 15.3 в сыворотке, которое коррелирует с размерами опухоли (Breast Cancer Res Treat. 1996; 37:209-216; Cancer Immun. Immunother. 1990; 31:269-273; J. Clin. Oncol. 1997; 15:2322-2328; Clin. Chem. 1997; 43:585-593). Антиген MUC1 играет существенную роль в метастатическом процессе (J. Nucl. Med. Allied Sci 1990; 34 (Suppl 3): 151-162). Однако чувствительность первичной диагностики по уровню СА 15.3 в сыворотке больных РМЖ составляет 15-35%, так как низкое содержание онкомаркера в сыворотке больного не гарантирует отсутствия злокачественного процесса. В то же время, пациенты с прогрессирующим заболеванием, при рецидиве и метастазировании, имеют устойчиво высокий уровень онкомаркеров (Br.J.Cancer, 63: 809-813), поэтому методы определения СА15.3 рекомендованы EGTM для мониторинговых исследований и прогнозирования течения РМЖ (Blood, 2000, v.96(9): 3147-3153).

Первой коммерческой тест-системой для определения уровня MUC1 в сыворотке крови человека стала система Centocor СА 15-3^TM RIA (Malvern, РА) на основе двух моноклональных антител, специфичных к эпитопам, локализованным на внеклеточном домене молекулы MUC1 (Hybridoma 1984; 3:223-226). Первое моноклональное антитело (Mab) DF3 направлено к пептидной части молекулы (DTRPAGS); другое Mab - 115D8 специфично к углеводному эпитопу MUC1.

На базе тех же Mab разработаны ИФА тест-системы IMx Са 15.3 MEIA (Abbott) и Enzymun-Test СА 15.3 (Boehringer Mannheim), а на их основе способы определения онкомаркера в сыворотке крови человека (Cancer J., 2001, 7: 181-190).

В качестве ближайшего аналога рассмотрим способ Enzymun-Test СА 15.3 (Cancer J., 2001, 7: 181-190), обладающий чувствительностью 13-14% при диагностике РМЖ по содержанию в сыворотке больного онкомаркера СА 15.3. При осуществлении этого способа использован формат прямого твердофазного двухсайтового ИФА и, дополнительно, авидин-биотиновая система, в основу которой положено высокое сродство гликопротеина яичного белка (авидина) к молекуле биотина. Применение процедуры биотинилирования антител позволяет одновременно вносить в лунки планшета, обработанные стрептавидином, антиген MUC1, биотинилированные Mab DF3 и конъюгированные с пероксидазой Mab 115D8. Стандартом онкомаркера является антиген СА 15.3, выделенный из супернатантов клеточной линии ZR-75 (Ann. Clin.Biochem, 1999, 36: 579-586). Использование биотинилированных моноклональных антител имеет как достоинства (высокую чувствительность ИФА), так и недостатки (дополнительные трудозатраты).

Задача заявляемого изобретения - разработать более эффективный и чувствительный способ количественного определения опухоль ассоциированного антигена MUC1 в сыворотке крови человека.

Задача решена путем разработки способа количественного определения онкомаркера MUC1 в сыворотке крови человека в формате прямого твердофазного двухсайтового иммунофотометрического анализа с применением тест-системы из двух моноклональных антител, взаимодействующих с онкомаркером сыворотки крови, а в контроле со стандартом онкомаркера; отличающийся тем, что реакцию взаимодействия онкомаркер-антитело осуществляют в формате ИФА, в качестве тест-системы используют пару моноклональных антител M3F1/M3B11, для выявления образовавшихся комплексов антиген-антитело используют Mab-пероксидазный конъюгат с последующим введением красителя ТМБ, а в качестве стандарта онкомаркера выделенный из жировых глобул молока человека антиген MUC1.

Набор для определения MUC1 в сыворотке крови человека.

Тест-система на основе моноклональных антител M3F1/M3B11 представляет собой стандартный набор компонентов для прямого твердофазного двухсайтового ИФА определения MUC1 антигена (ELISA):

1) анти-MUC1 Mab М3F1;

2) стандарт антигена MUC1;

3) контроли 1 и 2 с содержанием антигена 8 и 16 нг/мл, соответственно;

4) конъюгат анти- MUC1 Mab М3В11 с пероксидазой хрена (М3В11-РО);

5) буферные растворы для разведения и нанесения образцов (фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20);

6) буферный раствор (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) и субстрат для проявки (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, ТМБ);

7) раствор для остановки реакции (10% раствор серной кислоты).

Способ в общем виде.

Заявляемый способ основан на прямом твердофазном двухсайтовом ИФА. Исследуемые сыворотки и стандарт антигена вносят в лунки планшета, предварительно покрытые Mab M3F1. Исследуемые сыворотки разводят буфером для нанесения образцов в соотношении 1:40. При этом используют не более 25 мкл сыворотки пациента. Антиген MUC1 в нанесенных образцах сывороток и контролей, специфически связанный с Mab (M3F1) на подложке, выявляют путем нанесения Mab-пероксидазного конъюгата (М3В11-РО). Далее для развития цветной реакции в лунки планшета добавляют субстратную смесь, содержащую в качестве красителя ТМБ, и измеряют интенсивность окраски спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Количество антигена в исследуемых образцах сывороток определяют по калибровочной кривой, построенной для стандарта антигена MUC1. Стандартную кривую строят для каждого анализа в координатах: оптическая плотность против концентрации антигена в стандарте (Фиг.1), где: ось X - концентрация антигена MUC1 (1-64 нг/мл); ось Y - оптическая плотность при 450 нм. При определении в пробе более 16 нг антигена образец сыворотки разводят дополнительно в 2-4 раза.

Интерпретацию результатов теста проводят, используя расчетный средний уровень антигена MUC1 у здоровых доноров (cutoff) (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v.149), Humana Press, 2000). Сыворотки, содержащие антиген MUC1 в концентрации выше уровня cutoff, диагностируют как патологические. Уровень нормальных значений MUC1 антигена устанавливают с учетом локальных факторов окружающей среды и задач исследования. В заявляемом способе применяют два уровня cutoff, в зависимости от целей исследования: cutoff 1 - при мониторинге терапии и для обнаружения рецидивов, a cutoff 2 - для первичной диагностики РМЖ (см. Пример 4).

Основные параметры количественного определения MUC1 заявляемым способом.

Основные параметры количественного определения MUC1 соответствуют ГОСТу Р 51352-99 и представлены в табл.1. Перекрестные реакции с билирубином, гемоглобином человека, а также при использовании сывороток больных липимией, как возможных источников интерференции, не обнаружены (Method Validation-The Interference and Recovery Experiments, 2000).

Табл.1
Параметры по ГОСТ Р 51352-99	Требования ГОСТ	Результаты определения заявляемым способом
Воспроизводимость (коэффициент отклонений)	Не более 15%	5-10%
Предел обнаружения MUC1 антигена		2±0,1 нг/мл
Линейность	90-110%	95-110%
% открытия	90-110%	95-115%

Иммуноспецифическая характеристика панели моноклональных антител к MUC1.

Mab M3F1 и М3В11 получают в результате гибридизации нормальных лимфоцитов иммунизированной мыши (Balb/c) с клетками миеломы (P3/X63-Ag8) и характеризуют по способности связываться с природным муцином, выделенным из молока (MUC1), рекомбинантным полипептидом VNTR, гипо- и дегликозилированным муцином - deMUC1 (остаточное содержание углеводов <1%; содержание сиаловых кислот - 1%), а также нативным муцином опухолевой клеточной линии карциномы человека Т47 D.

Штаммы - продуценты моноклональных антител ВКПМ Н-97 (M3F1) и ВКПМ Н-98 (М3В11) депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. (Заявка на патент РФ 2006130857 и 2006130858, соответственно).

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами. Фиг.1. Стандартная кривая определения количества антигена MUC1 заявляемым способом.

Фиг.2. Распределение уровней онкомаркера (MUC1, нг/мл) среди доноров и больных при определении заявляемым способом.

Фиг.3. ROC кривые для заявляемого способа (обследован 71 больной с первичным диагнозом РМЖ II-III стадий) и Enzymun-Test СА 15.3 (обследовано 77 больных II-III стадий РМЖ).

Пример 1. Получение конъюгата Mab МЗВ11 с пероксидазой хрена.

2-4 мг пероксидазы хрена (Amressco, conjugation grad, USA) подвергают окислению периодатом натрия и объединяют с диализованными Mab М3В11 в соотношении 1:2 (J.Histochem.Cytochem, 1974, 22, 1084). Реакцию останавливают тетраборатом натрия (4 мг/мл при 4°С). Полученный пероксидазный конъюгат диализуют против фосфатного буфера рН 7,4 и подвергают высаливанию насыщенным раствором сульфата аммония. Взвесь центрифугируют 20 мин при 5000g и растворяют осадок в боратном буфере (рН 8,0). Конъюгат хранят при 0°С после добавления глицерина в соотношении 1:1. Рабочее разведение полученного пероксидазного конъюгата составляет 1:2500.

Пример 2. Получение стандарта антигена MUC1.

MUC1 получают из жировых глобул человеческого молока методом иммуноаффинной хроматографии на бромциан сефарозе 4 В (Sigma, США), конъюгированной со специфичными к MUC1 Mab (М4С4), с последующей элюацией 0,1 М глицином (модификация метода Burshell J.et al./Cancer Invest., 1989, 17, 53-61). Полученный антиген MUC1 хранят в лиофилизированном виде с концентрацией 5 мг/мл при 4 С° или в виде готового к использованию раствора с добавлением консерванта (0,2% тимеросала).

1 нг полученного антигена MUC1 соответствует 2 U антигена СА 15.3 (где U - универсальная единица по международной классификации MUC1 антигена).

Пример 3. Определение уровней MUC1 в сыворотках крови доноров и больных РМЖ II и III стадий. Расчет cutoff.

Исследовано 111 образцов сывороток. Из них 41 сыворотка здоровых женщин, 52 - больных РМЖ II стадии, 18 - больных РМЖ III стадии. Объем выборки нормальных и патологических сывороток определяют по формулам, исходя из заданных величин специфичности и чувствительности метода (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v. 149), Humana Press, 2000).

Содержание MUC1 в сыворотках здоровых женщин при определении заявляемым способом колеблется от 3,5 до 16 нг/мл, а в отдельных случаях достигает и 20 нг/мл. Среднее статистическое содержание антигена MUC1 в норме равно 10 нг/мл со стандартным отклонением 3,5 (р=0,95).

Для выбора величины cutoff использован графический метод (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v. 149), Humana Press, 2000; Radiology, 2003, 228: 3-9).

Результаты определения уровня MUC1 в сыворотках крови больных РМЖ и здоровых доноров представляют в виде диаграммы (Фиг.2), где: ось X - отражает интервалы содержания антигена в сыворотке от 5 до 40 нг, а ось Y - количество образцов сывороток, содержание MUC1 антигена в которых соответствует этому интервалу. Величину cutoff определяют путем проведения вертикальной черты через точку пересечения двух массивов: области сосредоточения нормальных и патологических сывороток. Таким образом, cutoff в заявляемом способе определения онкомаркера лежит в пределах 10-15 нг/мл.

Cutoff 1 равен 15 нг/мл, что совпадает с величиной данного параметра у ближайшего аналога (30 U MUC1/мл, 1 нг=2 U). Уровень антигена MUC1 ниже cutoff1 имеют 93% протестированных доноров. 56% больных РМЖ II и III стадии имеют уровень онкомаркера выше cutoff1.

Для снижения доли ложнонегативных результатов, что принципиально важно при первичной диагностике онкологических заболеваний, применяют cutoff 2, равный 12 нг/мл (фиг.2). 63% больных РМЖ II и III стадии имеют уровень онкомаркера выше cutoff 2 и доля ложноотрицательных результатов диагностики РМЖ снижается на 7%.

Пример 4. Расчет параметров диагностической эффективности заявляемого способа в зависимости от cutoff 1 и 2.

На основании результатов количественного определения MUC1 онкомаркера в сыворотках здоровых и больных РМЖ проводят расчет чувствительности, специфичности и других параметров эффективности заявляемого способа (табл.2) (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v. 149), Humana Press, 2000).

50% сывороток больных II и 67% III стадии РМЖ имеют уровень онкомаркера выше cutoff 1. Чувствительность диагностики на II стадии РМЖ повышают до 61% путем использования cutoff 2.

При диагностике РМЖ II и III стадий независимо от выбранного cutoff эффективность заявляемого способа в несколько раз выше, чем у ближайшего аналога.

Сопоставление эффективности заявляемого способа диагностики и ближайшего аналога (Enzymun-Test СА 15.3) при РМЖ проводят также путем построения ROC кривых (Radiology, 2003, 228: 3-9), исходя из того, что, чем больше площадь под кривой, тем выше диагностическая эффективность метода. По оси X на фиг.3 - величина (1 - специфичность) при cutoff от 5 до 30 нг/мл, по оси Y - чувствительность ИФА тест-системы при заданных параметрах cutoff и специфичности. Для сопоставления использована ROC-кривая ближайшего аналога по опубликованным данным (Clincal.Chemistry, 1997, 43: 4, 585-593). Заявляемый способ определения онкомаркера MUC1 является более эффективным, чем ближайший аналог, так как при специфичности не менее 70% обладает более высокой, чем ближайший аналог чувствительностью (75% и 40%, соответственно) (фиг.3)

Табл.2.
ИФА система	Cutoff (а)	Se, % (b)	Sp, % (с)	А, % (d)	В, % (е)	Е, % (f)
M3F1/M3B11	15 нг/мл	56	93	91	61	72
	12 нг/мл	63	83	83	64	72
Enzymun-Test СА 15.3	30 U/мл	13,4	93,9	80	35,8	40,4
(a) - уровень MUC1 антигена у здоровых доноров; (b) - чувствительность диагностики; (c) - специфичность диагностики; (d) - доля больных с установленным диагнозом, имеющих аналогичный диагноз при определении указанным методом; (e) - доля здоровых, имеющих отрицательный результат при определении указанным методом; (f) - коэффициент эффективности диагностического метода.

Для заявляемого способа отмечают:

- более высокую точность положительных (А) и отрицательных (В) результатов теста (83-91% и 61-64%, вместо 80% и 36% у ближайшего аналога, соответственно);

- в 2 раза более высокий коэффициент эффективности диагностики (Е), то есть корректной классификации больных и здоровых;

увеличение специфичности способа до 93% и снижение доли ложноотрицательных результатов при прогнозировании рецидивов и метастазирования в случае использования cutoff 1;

- увеличение чувствительности способа до 63% в случае использования cutoff 2 при первичной диагностике II и III стадий РМЖ.

Из представленных данных следует, что заявляемый способ определения MUC1 онкомаркера в сыворотке крови человека обладает высокой диагностической эффективностью, позволяя при использовании его в клинической практике выявить 56-63% больных в процессе первичной диагностики РМЖ II и III стадий, мониторинга рецидивов заболевания и оценки эффективности терапии при установленном диагнозе.