способ изготовления отраслевого стандартного образца (осо) поверхностного антигена вируса гепатита в (hbsag) для контроля качества тест-систем и определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ифа
Классы МПК: | A61K39/29 вирус гепатита |
Автор(ы): | Дудник Анна Николаевна (RU), Шарипова Ирина Николаевна (RU), Егорова Наталия Игоревна (RU), Обрядина Анна Петровна (RU), Бурков Анатолий Николаевич (RU), Уланова Татьяна Ивановна (RU), Баранова Елена Николаевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-02-22 публикация патента:
27.12.2008 |
Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации. Заявлен способ изготовления отраслевого стандартного образца (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В для контроля качества тест-систем, а также для определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА и набор для контроля качества тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также для определения количественного содержания антигена HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА. Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение длительности хранения и обеспечение возможности неоднократного использования препарата. 2 н.п. ф-лы, 3 ил.
Формула изобретения
1. Способ изготовления отраслевого стандартного образца (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для контроля качества тест-систем, а также для определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, отличающийся тем, что в 1%-ный водный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 0,75% глицина, 0,01% тимеросала, вносят плазменный или рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В HBsAg до концентрации 20 МЕ/мл, перемешивают, не допуская вспенивания, в течение 30-60 мин и лиофилизируют.
2. Набор для контроля качества тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также для определения количественного содержания антигена HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, отличающийся тем, что он включает отраслевой стандартный образец (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), полученный по п.1, и реагент 1, представляющий собой сыворотку крови человека негативную, лиофильно высушенную, приготовленную путем центрифугирования отобранных негативных сывороток крови человека, пулирования, добавления тимеросала до 0,01%, причем в обработанный пул добавляли 20-30% от его общего объема смеси для разведения, включающей 23,36 г (0,4 М) NaCl; 0,16 г (0,002 М) KCl; 0,16 г (0,001 М) КН2PO 4; 17,28 г (0,12 М) Na2HPO 4·12H2O; 10 г (1%) бычьего сывороточного альбумина; 0,5 мл (0,05%) ЭДТА-этилендиаминтетрауксусной кислоты; 0,1 мл 10% раствора тимеросала, с последующей лиофилизацией готового раствора до величины остаточной влажности не более 3%.
Описание изобретения к патенту
Отраслевой стандартный образец (ОСО) - вещество синтетического происхождения, применяемое для контроля медицинских иммунобиологических препаратов, используемых для диагностики болезней человека.
Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации и может быть использовано для определения чувствительности диагностических тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), а также для определения количественного содержания HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Сущность изобретения:
1. Набор OCO-HBsAg, включающего препарат OCO-HBsAg, который изготовлен из плазменного или рекомбинантного HBsAg разных субтипов и лиофилизирован в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA); 0,75% растворе глицина; 0,01% растворе тимеросала и имеет концентрацию 20 МЕ/мл.
Каждый компонент, входящий в состав раствора для лиофилизации антигена, добавляется из расчета необходимого объема данного раствора.
Например, на 100 мл раствора потребуется: 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA); 0,75 г глицина; 0,1 мл 10% раствора тимеросала; 100 мл дистиллированной воды.
Набор ОСО-HBsAg включает также 9 флаконов с лиофилизированной негативной сывороткой (Реагент 1), используемой для разведения ОСО.
2. Способ изготовления препарата ОСО-HBsAg, при котором препарат можно использовать неоднократно и хранить в течение длительного времени.
Преимущества изобретения:
1. Возможность приготовления необходимого количества разведений OCO-HBsAg в различных концентрациях, например 0,01; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 МЕ/мл. Для этой цели в комплект включены 9 флаконов с Реагентом 1, использовать которые можно постепенно, готовя по две-три концентрации для одной постановки ИФА.
2. Неоднократное использование препарата OCO-HBsAg благодаря возможности длительного хранения регитратированного концентрата, предварительно розлитого по аликвотам, при температуре минус 20°С в течение месяца или при минус 70°С - до конца срока годности препарата (3 года).
3. Изобретение обеспечивает возможность сравнения результатов оценки чувствительности тест-систем для выявления HBsAg различных производителей, а также результатов количественного определения HBsAg в лабораториях.
Описание изобретения
Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации и может быть использовано в биотехнологии и медицине для определения чувствительности диагностических тест-систем, предназначенных для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), а также для определения количественного содержания HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА.
Вирус гепатита В является возбудителем одной из наиболее опасных для человека инфекцией. Современные методы выявления позволяют обнаруживать HBsAg в низких концентрациях. В настоящее время активно ведутся работы по созданию и внедрению в практическое здравоохранение тест-систем, обладающих более высокой чувствительностью. В связи с этим возрастает необходимость в доступном количественном стандарте.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявленному изобретению является способ приготовления «Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, «NIBSC», United Kingdom, code number 00/588", содержащей 33IU/vial, заключающийся в следующем: плазменный антиген, выделенный из пула плазмы человека, содержащей HBsAg (негативной по анти-HCV, анти-HBs, анти-HIVI+2) в определенной концентрации растворяется в неиммунной плазме человека и лиофилизируется (Instructions for Use (Version 1, 24 February 2004)).
Недостатки данного способа:
1. Отсутствует раствор для приготовления разведений. Следовательно, каждая лаборатория вынуждена использовать для приготовления разведений имеющуюся в наличии плазму, что может повлиять на результаты и эффективность проведения анализа. Для обеспечения достоверной и объективной оценки чувствительности тест-систем необходимо для приготовления разведений использовать унифицированный раствор, прошедший надежный контроль.
2. Флакон стандарта до использования необходимо хранить при минус 20°С, а после регидратации хранение препарата не предусмотрено.
Задачей настоящего изобретения является способ изготовления OCO-HBsAg для определения чувствительности диагностических тест-систем и для определения количественного содержания поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом иммуноферментного анализа, предусматривающий длительный срок хранения и возможность неоднократного использования.
Задача решается разработанным способом изготовления отраслевого стандартного образца (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для контроля качества тест-систем, а также для определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, заключающегося в том, что в 1% водный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 0,75% глицина, 0,01% тимеросала, вносят плазменный или рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В HBsAg до концентрации 20 МЕ/мл, пипетируют, перемешивают, не допуская вспенивания, в течение 30-60 минут и лиофилизируют. Данный полученный препарат OCO-HBsAg включают в набор для контроля качества тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также для определения количественного содержания антигена HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, отличающийся тем, что он включает отраслевой стандартный образец (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), полученный по п.1, и реагент 1, представляющий собой сыворотку крови человека негативную, лиофильно высушенную.
Реагент 1 готовят путем центрифугирования отобранных негативных сывороток крови человека, пулирования, добавления тимеросала до 0,01%, причем в обработанный пул добавляли 20-30% от его общего объема смеси для разведения, включающей: 23,36 г (0,4 М) NaCl; 0,16 г (0,002 М) KCl; 0,16 г (0,001 М) КН2PO 4; 17,28 г (0,12 М) Na2HPO 4·12H2O; 10 г (1%) бычьего сывороточного альбумина; 0,5 мл (0,05%) ЭДТА - этилендиаминтетрауксусной кислоты; 0,1 мл 10% раствора тимеросала, с последующей лиофилизацией готового раствора до величины остаточной влажности не более 3%.
Технический результат заключается в увеличении длительности хранения и обеспечении возможности неоднократного использования препарата.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1.
Для изготовления препарата OCO-HBsAg может быть использован плазменный или рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Данный вид сырья может быть выделен и очищен по методике Ананьева В.А. (очистка HBsAg из сыворотки крови), или получен по оригинальной методике НПО «Диагностические системы».
План изготовления рекомбинантного HBsAg:
1. Получение дрожжевого лизата клеток-продуцентов HBsAg.
2. ПЭГ-рН осаждение осветленного лизата.
3. Получение экстракта HBsAg - обогащенной фракции.
4. Диализ полученной HBs-Ag - обогащенной фракции в буфер для НАР.
5. Адсорбционная хроматография.
6. Гель-фильтрация.
7. Ультрафильтрация.
Сырье для препарата OCO-HBsAg может быть как коммерческого, так и собственного производства.
Очищенный плазменный или рекомбинанатный HBsAg титровали на разводящем растворе одновременно с Международным стандартом (МС) на одном планшете тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg». Совместная обработка кривых титрования HBsAg и МС позволяет подобрать коэффициент разведения для получения HBsAg в концентрации 20 МЕ/мл. Если полученная концентрация не соответствует заданной, допускается корректировка в сторону увеличения введением дополнительного количества HBsAg, или в сторону уменьшения с помощью разводящего раствора. Затем готовый раствор разливали во флаконы вместимостью 3 см3.
Реагент 1 готовили следующим способом: отбирали сыворотку (плазму) крови, не содержащую HBsAg, антитела к HBsAg; антитела к ВИЧ-1,2; Treponema pallidum, HCV. Отбор исследуемых сывороток проводили с использованием иммуноферментных тест-систем. Метод отбора позволяет выбрать только те сыворотки для объединения в пул, которые адекватно взаимодействуют с антигеном, т.е. не дают реакции «гашения», подавления HBsAg.
Пример 2.
Каждую сыворотку вносили в две лунки иммуносорбента тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg», затем в одну из лунок добавляли 10 мкл препарата OCO-HBsAg (20 МЕ/мл), дальнейшую постановку проводили в соответствии с инструкцией по применению. Результат анализа оценивали по ОП сыворотки в лунке (без добавления препарата ОСО-HBsAg) и по ОП сыворотки (с внесенным препаратом ОСО-HBsAg). Критерии отбора сывороток:
1. ОП в лунке с сывороткой без добавления препарата OCO-HBsAg не должна превышать двукратное значение ОП К-тест-системы.
2. ОП в лунке каждой сыворотки с внесенным препаратом ОСО-HBsAg должна соответствовать средней ОП (исследуемых сывороток) ±20%; или ±20% значения 1 МЕ/мл OCO-HBsAg.
Отобранные сыворотки пулировали, центрифугировали, добавляли тимеросал до 0,01%. В обработанный пул добавляли 20-30% (от общего объема приготовленного пула) смеси для разведения. Для приготовления 1 л смеси для разведения пула потребуется: 23,36 г (0,4 М) NaCl; 0,16 г (0,002 М) KCl; 0,16 г (0,001 М) КН2PO4 ; 17,28 г (0,12 М) Na2HPO 4·12H2O; 10 г (1%) бычьего сывороточного альбумина; 0,5 мл (0,05%) ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; 0,1 мл 10% раствора тимеросала. Затем готовый раствор разливали по 1,0 мл во флаконы вместимостью 3 см3 (погрешность розлива не более 1%) и лиофилизировали (величина остаточной влажности не более 3%).
Комплект (набор) "OCO-HBsAg" включает:
1. Препарат OCO-HBsAg 20 МЕ/мл, лиофильно высушенный - 1 флакон.
2. Реагент 1 - сыворотка крови человека негативная, лиофильно высушенная - 9 флаконов.
Новым по сравнению с прототипом является:
- использование как плазменного, так и рекомбинанатного HBsAg;
- введение в состав комплекта разводящего раствора (Реагент 1) для приготовления разведений.
Основными аттестуемыми характеристиками ОСО являются: специфическая активность, однородность, стабильность и срок годности.
Согласно основному принципу ВОЗ, активность биологических препаратов не может быть адекватно измерена физическими методами. Эта активность определяется только в сравнении со стандартом. Количественную оценку тестируемого ОСО проводили методом параллельных линий в соответствии с методическими рекомендациями ГИСК им. Л.А.Тарасовича «Статистическая обработка результатов количественного ИФА (оценка линейности, параллельности, определение активности препарата и доверительных интервалов активности» [В.Г.Петухов, «Биопрепарат», № 1 (13), с.19-23, 2004]). Ввиду сложности расчетов и во избежание ошибок при вычислениях использовали компьютерную программу. В данном конкретном случае концентрацию препарата ОСО HBsAg определяли в сравнении с международным стандартом (Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, «NIBSC», United Kingdom, cod number 00/588) - 20±0,5 МЕ/мл при доверительной вероятности 0,95.
Активность кандидата в ОСО HBsAg (с.5) определяли в сравнении с международным стандартом, содержащим 33IU/vial. Для этого приготовили пять разведений международного стандарта и испытуемого кандидата в ОСО с.5 в трех повторностях:
Приготовление разведений международного стандарта:
Доза | Приготовление разведения |
1,6 ме | 1/20,6 раз |
0,8 ме | 1/41,2 раз |
0,4 ме | 1/82,5 раз |
0,2 ме | 1/165 раз |
0,1 ме | 1/330 раз |
Каждый образец исследовали в тест-системе «ИФА HBsAg/M» в соответствии с инструкцией по применению. С помощью компьютерной программы «Паралайн» определили наличие линейности и параллельности. Затем построили уравнение зависимости логарифмов ОП ср от логарифмов соответствующих концентраций HBsAg.
Зависимость LN(ОП) от LN активности международного стандарта:
- 1,98 | -2,3 |
- 1,27 | -1,6 |
- 0,57 | -0,91 |
0,124 | -0,223 |
0,813 | 0,47 |
Зависимость LN(ОП) от разведения кандидата в ОСО с.5 (Фиг.1):
Развед. | ОП канд | LN (ОП канд) | Ln (сод HBsAg) | сод HBsAg (МЕ)/мл |
112,5 | 2,271 | 0,82 | 0,47142 | 1,601915339 |
125 | 1,148 | 0,138 | -0,204442 | 0,815462371 |
150 | 0,576 | -0,551 | -0,887241 | 0,41188957 |
1100 | 0,283 | -1,26 | -1,58986 | 0,204129639 |
1200 | 0,139 | -1,97 | -2,29347 | 0,100963118 |
у=0,991Х-0,3412 |
Исходя из полученного содержания HBsAg (ME) в приготовленных разведениях кандидата в ОСО с.5, определили содержание HBsAg во флаконе исследуемого препарата:
Развед. | сод HBsAd (МЕ)/мл | Содерж. HBsAg (МЕ)/мл |
112,5 | 1,601915339 | 20,114 |
125 | 0,815462371 | 20,356 |
150 | 0,41188957 | 20,47 |
1100 | 0,204129639 | 20,201 |
1200 | 0,100963118 | 20,017 |
20,237 среднее значение |
В результате произведенных сравнительных исследований ОСО-HBsAg с.5 и международного стандарта установлено, что содержание HBsAg во флаконе ОСО с.5 соответствует 20±0,5 МЕ/мл.
Препарат ОСО-HBsAg исследовали на однородность, коэффициент вариации составил 11% (количество проверенных флаконов составило 1% от серии). Метод заключается в следующем.
Для исследования на однородность отобрали некоторое количество флаконов (1% от серии), из каждого флакона ОСО-HBsAg приготовили одну концентрацию (например, 1 МЕ). Затем на одном планшете с помощью ИФА исследовали каждый флакон этой концентрации в трех повторах. Получив результат, рассчитали Х среднее, сигму, коэффициент вариации.
После контроля качества лиофильно высушенных компонентов проводили определение стабильности OCO-HBsAg методом ускоренного теста в соответствии с требованиями методических рекомендаций ГИСК им. Л.А.Тарасовича «Определение стабильности отраслевых стандартных образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом» (Автор - В.Г.Петухов, Москва, 2002 г.). Срок годности ОСО - 3 года.
Пример 3.
ОСО-HBsAg с.5 | концентрация 0,5 ME | |||
Время (сут) | 65°С | 55°С | 44°C | |
0 | 100% | 100% | 100% | |
2 | 98% | |||
6 | 89% | |||
9 | 73% | 92% | ||
16 | 65% | 89% | ||
23 | 59% | 81% | ||
28 | 68% | 99% | ||
35 | 96% | |||
45 | 92% | |||
50 | 89% |
Логарифмы падения активности (Фиг.2):
0 | 4,6 | 4,6 | 4,6 | |
2 | 4,585 | |||
6 | 4,4886 | |||
9 | 4,2905 | 4,5218 | ||
16 | 4,1744 | 4,4886 | ||
23 | 4,0775 | 4,3944 | ||
28 | 4,2195 | 4,5951 | ||
35 | 4,5643 | |||
45 | 4,5218 | |||
50 | 4,4886 |
Константы скоростей дезактивации при выбранных температурах (Фиг.3):
Вывод: срок годности ОСО HBsAg с.5 составляет 3 года.
Подготовка и условия применения стандартного образца
При работе с OCO-HBsAg все измерительные приборы и устройства должны быть аттестованы и проверены.
Приготовление регидратированного Реагента 1: во флакон с сухим Реагентом 1 внести 1,0 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать до полного растворения содержимого флакона. Регидратированный раствор Реагента 1 представляет собой прозрачный бесцветный или светло-желтого цвета раствор, без осадка, допускается опалесценция. Хранить при (6±2)°С не более 1 недели.
Приготовление раствора ОСО-HBsAg, концентрация 20 МЕ/мл: во флакон с ОСО-HBsAg внести 0,8 мл рабочего раствора Реагента 1 и тщательно перемешать до полного растворения содержимого флакона. Регидратированный препарат OCO-HBsAg представляет собой прозрачный бесцветный или желтоватого цвета раствор, без осадка, допускается опалесценция. Возможно хранение раствора OCO-HBsAg, предварительно разлитого по аликвотам, при температуре не выше минус 20°С в течение 1 месяца или при минус 70°С - до конца срока годности препарата. Допускается однократное оттаивание-замораживание препарата.
Приготовление разведений OCO-HBsAg: для определения чувствительности диагностических наборов, предназначенных для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В или количественного содержания HBsAg в испытуемых образцах, готовят ряд разведений ОСО-HBsAg на регидратированном Реагенте 1 с концентрацией антигена, например, 0,05; 0,1; 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 МЕ/мл. Таких разведений готовят не менее 4-х и каждое разведение не менее чем в 3-х повторностях.
Приготовление разведений исследуемого образца: для определения количественного содержания HBsAg величина оптической плотности образца (ОП) при используемых длинах волн должна находиться строго в диапазоне от 0,1 до 2,5 оптических единиц (о.е.). Если ОП исследуемого образца выходит за рамки указанного диапазона, подбирают эмпирическим путем разведение образца, например 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000.
Готовят последовательные разведения так, чтобы оптические плотности приготовленных разведений (не менее 3-х повторностей) лежали в линейной области данного прибора.
Каждое разведение стандартного/исследуемого образца следует готовить в отдельном флаконе или пробирке. При этом каждую повторность готовят отдельно из исходного стандартного образца, чтобы оценить разброс результатов анализа при разведении стандартного/исследуемого образца.
Постановка иммунологических тестов
При определении чувствительности иммуноферментной тест-системы и количества HBsAg в исследуемом образце ИФА проводят в соответствии с требованиями, изложенными в инструкции по применению используемой тест-системы.
Для определения чувствительности иммуноферментной тест-системы разведения ОСО-HBsAg вносят не менее чем в 3 лунки иммуносорбента.
Для оценки количественного содержания HBsAg в пробе в лунки иммуносорбента исследуемый образец необходимо вносить не менее чем в 3-х повторностях, на этом же планшете параллельно аналогично исследуется каждое разведение ОСО-HBsAg.
Учет и обработка результатов
При оценке чувствительности тест-системы этот показатель соответствует среднему наименьшему количеству HBsAg, которое определяется данной тест-системой.
Для ориентировочной оценки количественного содержания HBsAg строят график, на оси абсцисс которого откладывают логарифмы концентраций ОСО-HBsAg, на оси ординат - значения логарифмов ОПср., соответствующее этим концентрациям HBsAg, и получают кривую, по которой вычисляют концентрацию HBsAg в исследуемом образце, исходя из величины логарифма его оптической плотности. Если образец предварительно разводился, то в этом случае значение концентрации, полученной на оси абсцисс, умножают на кратность разведения. При этом надо иметь в виду, что погрешность данной оценки может достигать значительных величин (до 20% и более).
Для точного количественного определения концентрации HBsAg в исследуемых образах необходимо использовать метод серийных разведений этих образцов параллельно с серийными разведениями ОСО. При этом для расчета концентрации HBsAg и ее 95%-го доверительного интервала следует использовать метод дисперсионного анализа [В.Г.Петухов, «Биопрепарат», №1 (13), с.19-23, 2004]. Ввиду сложности расчетов и во избежание ошибок при вычислениях рекомендуется использовать компьютерную программу.
Класс A61K39/29 вирус гепатита