регуляция самообновления es-клеток и спецификации направления дифференцировки и среда для этого

Формула изобретения

1. Применение комбинации:

(a) активатора пути передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру от рецептора морфогенного белка кости (BMP); и

(b) активатора пути передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру с участием gp130, для получения композиции для стимуляции самообновления плюрипотентных клеток в культуре.

2. Применение по п.1, где активатором путей передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру от рецептора BMP является агонист рецептора BMP.

3. Применение по п.2, где агонистом рецептора является BMP.

4. Применение по п.3, где агонистом является ВМР4.

5. Применение по любому из пп.1-4, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру является цитокин, действующий через gp130.

6. Применение по п.5, где цитокином является LIF.

7. Применение по любому из пп.1-4, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру является растворимый IL-6 в сочетании с растворимым IL-6-рецептором.

8. Применение по п.1, где ES-клетки культивируют в присутствии агента, подавляющего дифференцировку.

9. Применение по п.8, где ES-клетки культивируют в присутствии ингибитора FGF-рецептора.

10. Применение по п.9, где ингибитором FGF-рецептора является SU5402 или РD173074.

11. Применение по любому из пп.8-10, где ES-клетки сначала культивируют в присутствии агента, подавляющего дифференцировку, а затем этот агент удаляют.

12. Применение по п.1 для культуры плюрипотентных клеток, выбранных из плюрипотентных клеток млекопитающих и птиц.

13. Применение по п.12 для культуры ES-клеток, выбранных из ES-клеток млекопитающих и птиц.

14. Применение по п.12 для культуры плюрипотентных стволовых клеток, выбранных из плюрипотентных стволовых клеток грызунов, коров, свиней, овец и приматов.

15. Применение по п.13 для культуры ES-клеток, выбранных из ES-клеток грызунов, коров, свиней, овец и приматов.

16. Применение по п.12 или 13 для культуры клеток крысы или мыши.

17. Применение по п.12 или 13 для культуры клеток человека.

18. Применение по п.1, где ES-клетки культивируют в среде, не содержащей сыворотки, экстракта сыворотки, фидерных клеток и экстракта фидерных клеток.

19. Применение по п.1, где ES-клетки культивируют в среде полностью определенного состава.

20. Способ культивирования нечеловеческих ES-клеток для стимулирования самообновления ES-клеток, предусматривающий поддержание ES-клеток в среде, содержащей:

(а) активатор пути передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру от рецептора BMP; и

(b) активатор пути передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру.

21. Способ по п.20, где активатором путей передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру от рецептора BMP является агонист рецептора BMP.

22. Способ по п.20 или 21, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру является цитокин, действующий через gp130.

23. Способ по п.21, где агонистом рецептора является BMP.

24. Способ по любому из пп.20 или 21, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру является LIF или IL-6 плюс растворимый IL-6-рецептор.

25. Способ по любому из пп.20 или 21, где эта среда дополнительно содержит ингибитор FGF-рецептора.

26. Способ культивирования нечеловеческих ES-клеток, предусматривающий:

перенос отдельных ES-клеток в сосуд для культивирования; и культивирование ES-клеток в присутствии

(a) активатора пути передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру от рецептора BMP; и

(b) активатора пути передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру.

27. Способ по п.26, где сосуд для культивирования представляет собой отдельную лунку в планшете.

28. Среда для самообновления ES-клеток, содержащая:

базальную (минимальную) среду;

активатор путей передачи сигнала в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру от рецептора BMP;

активатор путей передачи сигнала с участием gp130 в направлении от первичного сигнала ко вторичному мессенджеру;

переносчик железа;

где среда не содержит сыворотку или экстракт сыворотки.

29. Среда по п.28, дополнительно содержащая инсулин или инсулиноподобный фактор роста.

30. Среда по п.28 или 29, где среда не содержит фидерных клеток или экстракта фидерных клеток.

31. Культуральная среда для ES-клеток, содержащая:

(a) агонист рецептора BMP;

(b) цитокин, действующий через gp130; и

(c) агент, подавляющий дифференцировку ES-клеток.

32. Культуральная среда для ES-клеток, содержащая:

(a) агонист рецептора BMP;

(b) цитокин, действующий через gp130;

где среда не содержит сыворотку и экстракта сыворотки.

33. Культуральная среда для ES-клеток, содержащая:

(a) агонист рецептора BMP;

(b) цитокин, действующий через gp130; и

где среда имеет полностью определенный состав.

34. Среда по п.33, дополнительно содержащая агент, подавляющий дифференцировку ES-клеток.

35. Среда по п.31 или 32, где цитокином, действующим через gp130, является LIF в концентрации по меньшей мере 10 Е/мл.

36. Среда по п.31 или 32 для культивирования плюрипотентных стволовых клеток из ткани взрослого индивидуума.

37. Способ получения дифференцированной клетки, предусматривающий (а) культивирование плюрипотентной клетки по любому из пп.20-27 для стимуляции ее самообновления, и

(b) обеспечение возможности или стимулирование дифференциации плюрипотентной клетки с получением, таким образом, дифференцированной клетки, где плюрипотентная клетка содержит селектируемый маркер, который способен к дифференциальной экспрессии в желаемую дифференцированную клетку по сравнению с другими типами клеток, включая плюрипотентные клетки, посредством чего дифференциальная экспрессия селектируемого маркера приводит к предпочтительному выделению, и/или выживанию, и/или делению желаемых дифференцированных клеток.

38. Способ по п.37, где дифференцированная клетка является стволовой клеткой или клеткой-предшественником ткани.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к условиям культуры и способам культивирования плюрипотентных стволовых клеток для стимуляции самообновления стволовых клеток и для предотвращения или регуляции дифференцировки стволовых клеток. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способы выделения и поддержания гомогенных препаратов плюрипотентных стволовых клеток. Обеспеченные способы и композиции являются пригодными для культивирования и выделения плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые (ES) клетки.

Закладка и поддержание in vitro культур плюрипотентных стволовых клеток в присутствии среды, содержащей сыворотку и ингибирующий лейкоз фактор (LIF), хорошо известны (Smith et al. (1988) Nature 336: 688-90). Такие способы использовали для поддержания плюрипотентных эмбриональных стволовых (ES) клеток из линий пермиссивных мышей на протяжении многих пассажей. Поддержание и самообновление культур плюрипотентных стволовых клеток дополнительно поддерживается при культивировании стволовых клеток в присутствии питающих клеток или их экстрактов, обычно мышиных фибробластных клеток. При таких условиях можно поддерживать ES-клетки человека в плюрипотентном состоянии на протяжении многочисленных пассажей в культуре.

Постоянной проблемой в данной области является то, что, несмотря на интенсивные прилагаемые усилия, дело обстоит так, что плюрипотентные культуры ES-клеток могут быть получены и поддержаны в течение продолжительных периодов только из немногих видов и даже в этих видах не из всех эмбрионов. В некоторых случаях плюрипотентные клетки могут быть идентифицированы, но не могут затем поддерживаться в культуре в течение достаточного времени для обеспечения возможности исследования этих клеток или их генетической манипуляции. Это имеет место, в частности, для клеток грызунов (других, чем некоторые линии мышей).

Следующей проблемой является то, что ES-клетки, которые действительно могут поддерживаться в плюрипотентном состоянии в культуре на протяжении многих пассажей, могут поддерживаться таким образом только с использованием среды, которая содержит сыворотку или экстракт сыворотки, и, следовательно, является средой неопределенного состава, или с использованием условий культуры клеток, которые требуют присутствия других клеток, таких как фибробластные питающие клетки, используемые для поддержания ES-клеток человека. Однако, когда предполагается подвергание ES-клеток последующей регулируемой дифференцировке в желаемые типы клеток, нежелательно использовать культуральную среду неопределенного состава или иметь присутствующие гетерологичные клетки.

Сыворотка, обычно используемая при культивировании плюрипотентных стволовых клеток, является фетальной телячьей сывороткой, о которой известно, что она содержит комплексную смесь цитокинов и других молекул передачи сигналов. Для регуляции путей дифференцировки нежелательно вводить неизвестные цитокины в культуральную среду, влияние которых на конечный результат дифференцировки не может быть определено количественно и может быть потенциально вредным. Далее, каждая партия сыворотки является уникальной и вводит вариацию в протоколы культивирования.

В результате, ES-клетки, полученные культивированием в таких комплексных средах, и любое их дифференцированное потомство рискуют быть загрязненными компонентами этих сред и/или клетками, такими как питающие клетки, которые требуются для поддержания этих ES-клеток. Эти факторы уменьшают возможность разработки хороших способов приготовления для терапевтических и других применений ES-клеток и их потомства.

При получении популяции дифференцированных клеток из культуры ES-клеток желательно иметь возможность превращать высокую долю ES-клеток в потомство того же самого типа, т.е. поддерживать в гомогенном виде популяцию клеток, насколько это возможно. Однако на практике, наблюдается, что после дифференцировки получают популяцию клеток, которая содержит гетерогенную смесь клеток. Таким образом, желательно иметь возможность проводить дифференцировку популяции ES-клеток с получением более чистой популяции потомства.

В ЕР для дифференцировки стромальных клеток из жировой ткани описаны способы и композиции, которые могут включать интерлейкины, FGF и сыворотку и количества TGF- , достаточные для индукции дифференцировки в гладкую мышцу.

В ЕР 0753574 описаны способы и композиции для размножения ex vivo клеток-предшественников человека. Эта культуральная среда содержит стромальные клетки, обычно преобразующиеся в фибробластные клетки.

В WO00/05344 описано поддержание стволовых клеток зародышевой линии Drosophila и размножение соматических стволовых клеток других видов при совместном культивировании с генетически сконструированными клетками Drosophila.

В WO96/40866 описана бессывороточная культура гемопоэтических клеток-предшественников и стволовых клеток человека в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, один компонент из пептона, ингибитора протеаз и экстракта гипофиза.

В US2002/0028510 описаны способы и композиции для дифференцировки плюрипотентных клеток из пуповинной крови в типы нервных клеток.

В US5750376 описаны способы и композиции для дифференцировки мультипотентных нервных стволовых клеток в культуральной среде, дополненной, по меньшей мере, одним фактором роста.

Wiles and Johansson, Exp. Cell Research, 1999 (247) pp.241-248 описывают поддержание линий недифференцированных клеток в присутствии LIF и фетальной телячьей сыворотки. При выращивании ES-клеток в бессывороточной среде они быстро теряют фенотип ES-клеток и развиваются в диапазон типов клеток, в том числе нейроэктодерму.

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение способов культивирования и культуральных сред, пригодных для плюрипотентных стволовых клеток, которые способны поддерживать самообновление указанных стволовых клеток в недифференцированном состоянии на протяжении многих пассажей. Следующей целью данного изобретения является обеспечение системы культивирования, которая позволяет поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток in vitro, пока дифференцировку этих клеток не индуцируют регулируемым образом. Следующей целью данного изобретения является обеспечение способов и композиций, которые повышают выделение плюрипотентных стволовых клеток и облегчают их выделение из организмов, которые не поддаются выделению ES-клеток или из которых плюрипотентные стволовые клетки еще не были выделены.

Данное изобретение основано на наблюдении, что культивирование плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, в бессывороточных средах, содержащих агонисты путей передачи сигналов с участием gp130 (например, LIF) и суперсемейства TGF- (например, ВМР4), стимулирует самообновление стволовых клеток в течение множественных пассажей. Таким образом, в присутствии передачи сигнала с участием gp130 агонист пути передачи сигнала с участием суперсемейства TGF- обеспечивает стимул самообновления, а не сигнал продифференцировки.

Таким образом, первый аспект данного изобретения обеспечивает применение комбинации:

(а) активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- ; и

(b) активатора пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса для стимуляции самообновления плюрипотентных клеток в культуре.

Один или несколько путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- могут быть активированы с использованием агониста рецептора суперсемейства TGF- . Примерами рецепторов являются ВМР-рецептор и TGF- -рецептор, а также рецепторы, связывающиеся с активином и белком nodal. Активация одного или нескольких путей передачи сигнала предпочтительно достигается с использованием агониста ВМР-рецептора.

Активация одного или нескольких путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от gp130 может достигаться с использованием цитокина, действующего через gp130, например цитокина или другого агониста LIF-рецептора.

Агонист рецептора суперсемейства TGF- является предпочтительно членом суперсемейства TGF- факторов передачи сигнала и предпочтительно является белком, участвующим в остеогенезе (костным морфогенетическим белком, ВМР), таким как ВМР-4. Пригодны также известные гомологи ВМР4, такие как ВМР2 и ВМР7, а также гомологи из видов, не являющихся видами млекопитающих, такие как белок decapentaplegic (dpp) из Drosophila melanogaster. Хорошие результаты были получены с использованием ВМР 4, 8 и 2. Хорошие результаты были также получены с использованием химеры ВМР4 и ВМР8, которую легче получить в секретируемой форме, чем ВМР4. Предполагается также, что термин "агонист" охватывает также миметики, слитые белки или химеры полипептидов, пути передачи сигнала с участием суперсемейства TGF- , их фрагменты, варианты и производные, способные активировать рецепторы суперсемейства TGF- .

Цитокины, способные действовать через gp130 и, следовательно, активировать трансдукцию сигнала gp130, включают LIF, CNTF, кардиотрофин, онкостатин М и IL-6 плюс sIL-6-рецептор (растворимый рецептор IL-6). Подходящие цитокины включают миметики, слитые белки или химеры, которые могут связываться с gp130 и/или активировать передачу сигнала через gp130.

Роль цитокинов, действующих через gp130 в присутствии сыворотки, хорошо установлена, но способность этих цитокинов поддерживать недифференцированные клетки в отсутствие сыворотки является ограниченной.

Прежняя информация относительно ВМР как из исследований развития in vivo, так и в ES-клетках, указывает на активность в запуске мезодермальной и эпидермальной дифференцировки. В литературе нет доказательства того, что активация пути передачи сигнала с участием ВМР может увеличивать самообновление плюрипотентных стволовых клеток.

Бессывороточная среда с определенным химическим составом для дифференцировки ES-клеток, содержащая LIF и ВМР4, была описана ранее Johansson and Wiles (Mol. Cell. Biol. (1995) 15(1): 141-51). Однако эта среда содержала также неопределенный альбуминовый компонент, и как LIF, так и ВМР4 объединяли только в культуральной среде, используемой для усиления дифференцировки ES-клеток в мезодерму и гемопоэтические клетки. Дифференцировку в клетки, экспрессирующие мезодермальный маркерный ген, Brachyury, наблюдали после 5 дней в культуре (см. стр.145, первый абзац). В отсутствие ВМР4 эта среда с химически определенным составом, дополненная гораздо более высокими концентрациями LIF, способна поддерживать ES-клетки максимально в течение трех пассажей (см. стр.143, вторую колонку). Таким образом, Johansson and Wiles описывают композицию, которая стимулирует дифференцировку, индуцируемую образованием многоклеточных агрегатов, и дифференцировку ES-клеток, но не самообновление ES-клеток.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает в одном варианте культуру ES-клеток в среде, которая может не содержать сыворотки, сывороточного экстракта, питающих клеток и экстракта таких клеток.

При применении LIF- и ВМР4-содержащей среды специфического варианта данного изобретения возможным является продолжительное пассирование ES-клеток. В одном примере мышиные ES-клетки поддерживали в течение более чем 20 пассажей на протяжении трехмесячного периода. Клетки пассировали каждые 2-4 дня в зависимости от плотности посева клеток, хотя иногда клетки пассировали после 7-10 дней после посева при низкой плотности.

Другим преимуществом данной системы культивирования является то, что дифференцировка ES-клеток уменьшается по сравнению с культурой в присутствии сыворотки. Это является важным, так как часто наиболее плюрипотентные ES-клетки имеют тенденцию значительно дифференцироваться в сыворотке, что делает проблематичными манипуляцию ими и их размножение.

ES-клетки в этих культурах испытывали, и было обнаружено, что они все еще сохраняют морфологию ES-клеток и экспрессируют маркеры ES-клеток (положительное окрашивание на щелочную фосфатазу). При использовании репортерного гена GFP под контролем специфического для ES-клеток промотора Oct-4 в ES-кетках наблюдали зеленую флуоресценцию. Подобным образом, сохранялась экспрессия -галактозидазы с промотора Sox2. Экспрессируются маркеры мРНК ES-клеток, такие как Oct4, Nanog, Rex1 и Sox2, что дополнительно подтверждает, что эти клетки являются ES-клетками. Было обнаружено, что морфологическая дифференцировка клеток в этой культуре является очень низкой и более низкой, чем в сравнительной культуре ES-клеток в содержащей сыворотку среде. Таким образом, условия культуры данного изобретения позволяют ES-клеткам самообновляться в отсутствие сыворотки.

Сообщалось об эмбриональных стволовых клетках из ряда источников-млекопитающих, в том числе мыши (Bradley, 1984) Nature 309: 255-56), Американской норки (Mol Reprod Dev (1992) Dec; 33(4): 418-31), свиньи и овцы (J Reprod Fertil Suppl (1991); 43: 255-60), хомяка (Dev Biol (1988) May; 127(1): 224-7) и коровы (Roux Arch Dev Biol (1992); 201: 134-141). Должно быть понятно, что способы и композиции данного изобретения пригодны для адаптации к культивированию культур плюрипотентных клеток других млекопитающих, в том числе ES-клеток человека, приматов, грызунов и птиц.

Конкретно, что касается ES-клеток человека, известно, что ES-клетки человека отвечают на LIF и, следовательно, среда и способы данного изобретения, в которых получают стимул самообновления в ответ на комбинацию LIF и ВМР4, могут быть применимы к ES-клеткам человека.

Подходящие плотности клеток для способов данного изобретения будут варьироваться в соответствии с используемыми плюрипотентными стволовыми клетками и характером любого желаемого потомства. Хорошие результаты были получены при культивировании эмбриональных стволовых клеток в монослойной культуре, диссоциации эмбриональных стволовых клеток и затем культивировании этих эмбриональных стволовых клеток в монослойной культуре на поверхности культуры при плотности 0,2-2,5·10 ⁴ клеток на 1 см², в частности при плотности 0,5-1,5·10⁴ клеток на 1 см². Клетки пролиферируют в виде прикрепленных монослоев и, как наблюдается, имеют время удвоения, сравнимое с временем удвоения ES-клеток, выращиваемых в содержащей сыворотку среде вместе с LIF.

Типичные поверхности для культивирования ES-клеток и их потомства в соответствии с данным изобретением являются поверхностями для культивирования, известными в данной области в качестве поверхностей, применимых для культуры клеток, и они включают в себя поверхности из пластика, металла, композиционного материала, хотя используют обычно такую поверхность, как пластиковая чашка для культуры ткани, широко коммерчески доступная. Такие чашки часто имеют лишь несколько сантиметров в диаметре. Для увеличения масштаба может быть использован этот тип чашки с гораздо большими диаметрами и многочисленные блоки повторяющихся чашек.

Обычным для этой культуральной поверхности является также то, что она содержит белок клеточной адгезии, обычно нанесенный на эту поверхность. Рецепторы или другие молекулы на этих клетках связываются с этим белком или другим субстратом культуры клеток, и это стимулирует адгезию с данной поверхностью, и предполагается, что это стимулирует рост. Обычно покрытые желатином чашки являются доступными и подходящими для данного изобретения и могут быть использованы также другие белки.

В варианте осуществления данного изобретения было показано, что включение агента, который подавляет дифференцировку, такого как ингибитор FGF-рецептора, в культуральную среду в течение, по меньшей мере, части периода культивирования, подавляет тенденцию ES-клеток к дифференцировке. В одном варианте осуществления ES-клетки культивируют в бессывороточной среде с определенным составом, содержащей LIF и ингибитор FGF-рецептора, в течение указанного периода перед тем, как этот ингибитор FGF-рецептора удаляют и заменяют агонистом пути передачи сигнала с участием ВМР (например, ВМР4). Подходящие ингибиторы FGF-рецептора включают соединения SU 5402 и PD 173074. Альтернативно, может быть использован конкурентный ингибитор FGF-рецептора, предпочтительно растворимая форма этого рецептора.

В альтернативном варианте осуществления можно не удалять ингибитор FGF-рецептора. Таким образом, ингибитор FGF-рецептора присутствует в культуральной среде в течение продолжительного периода либо в присутствии, либо в отсутствие агониста пути передачи сигнала с участием ВМР. ES-клетки могут выращиваться в культуре в течение, по меньшей мере, 20 пассажей в среде N2B27 в присутствии LIF и ингибитора FGF-рецептора в отсутствие ВМР. Если ингибитор FGF-рецептора не удаляют из среды, предпочтительно, чтобы он был специфическим ингибитором и имел низкую активность или не имел активности в отношении других рецепторов.

Второй аспект данного изобретения обеспечивает способ культивирования ES-клеток таким образом, чтобы стимулировать самообновление ES-клеток, предусматривающий поддержание ES-клеток в среде, содержащей:

(а) активатор пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- ; и

(b) активатор пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса.

В одном варианте осуществления способ культивирования ES-клеток предусматривает поддержание ES-клеток в среде, содержащей:

(а) агонист рецептора суперсемейства TGF- и

(b) цитокин, действующий через gp130.

Способы данного изобретения могут быть использованы для стимуляции самообновления ES-клеток в среде, которая не содержит сыворотку и не содержит экстракта сыворотки, причем эти клетки предварительно были пассированы в присутствии сыворотки или экстракта сыворотки. Предпочтительно, такие способы проводят также в отсутствие питающих клеток и/или экстрактов питающих клеток. Например, может проводиться культивирование ES-клеток, предусматривающее стадии:

поддержания ES-клеток в плюрипотентном состоянии в культуре, необязательно на питающих клетках, в присутствии цитокина, действующего через gp130, и сыворотки или экстракта сыворотки;

пассирования этих ES-клеток, по меньшей мере, один раз;

удаления сыворотки или экстракта сыворотки из среды и удаления питающих клеток (если они присутствуют) так, что эта среда не содержит питающих клеток, сыворотки и экстракта сыворотки; и

затем поддержания ES-клеток в плюрипотентном состоянии в присутствии активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- и активатора пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса.

Приблизительно при времени, когда сыворотку или экстракт сыворотки удаляют из среды, можно по выбору добавить к этой среде агент, который подавляет дифференцировку, например ингибитор FGF-рецептора. Можно по выбору удалить этот ингибитор дифференцировки во время поддержания этих клеток в присутствии активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- или после этого времени.

Данное изобретение обеспечивает также способ получения трансфицированной популяции ES-клеток, предусматривающий:

трансфекцию ES-клеток конструкцией, кодирующей селектируемый маркер;

посев этих ES-клеток;

культивирование ES-клеток в присутствии

(а) активатора путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- ; и

(b) активатора путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса; и отбор на ES-клетки, которые экспрессируют селектируемый маркер.

Селектируемый маркер может кодировать устойчивость к антибиотику, маркер поверхности клеток или другой селектируемый маркер, как описано, например, в ЕР-А-0695351.

В следующем варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ культивирования ES-клеток, предусматривающий стадии перенесения индивидуальной ES-клетки в культуральный сосуд, такой как индивидуальная лунка на планшете, и культивирование этой ES-клетки в присутствии активатора путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- и активатора путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса таким образом, чтобы получить клональную популяцию ES-клеток, все из которых являются потомством единственной ES-клетки.

После получения стабильной, гомогенной культуры ES-клеток условия культуры могут быть изменены для направления дифференцировки этих клеток в один или несколько типов клеток, выбранных из эктодермальных, мезодермальных или эндодермальных типов клеток. Добавление или удаление цитокинов и факторов передачи сигналов могут обеспечить возможность получения специфических популяций дифференцированных клеток с высокой эффективностью. Дифференцировка ES-клетки в направлении не нейроэктодермальных типов клеток может достигаться поддержанием ES-клетки в присутствии цитокина, действующего через gp130, и агониста ВМР-рецептора с последующим удалением цитокина при сохранении агониста ВМР-рецептора и/или добавлении молекулы передачи сигнала, способной направлять дифференцировку.

Например, подвергание действию ВМР4 в отсутствие LIF приводит к индукции мезэндодермальных типов клеток. Удаление агонистов путей передачи сигналов с участием gp130 и TGF- и/или блокада обоих путей приводит к индукции нейроэктодермального фенотипа. Альтернативно, для направления в другие пути дифференцировки к условиям культуры могут быть добавлены другие факторы передачи сигнала, например активин, sonic hedgehog (shh), Wnt и FGF.

В процессе работы к концу культивирования ES-клеток желательно удалить ВМР4 при, по меньшей мере, одном пассаже перед началом дифференцировки для гарантии того, что сигнал ВМР уменьшается и нет остатка сигнала ВМР во время последующей дифференцировки. В одном варианте осуществления к культурам добавляют антагонист FGF-рецептора в течение одного-двух пассажей при удалении ВМР из этих культур.

Следующие аспекты данного изобретения обеспечивают среды для культуры клеток для самообновления ES-клеток. Одна такая среда содержит:

базальную (минимальную) среду;

активатор путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- ;

активатор путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса;

переносчик железа;

причем эта среда не содержит сыворотку и экстракт сыворотки.

Базальная среда является средой, которая поставляет незаменимые источники углерода и/или витамины, и/или минеральные вещества для ES-клеток. Базальная среда обычно не содержит белка и не способна самостоятельно поддерживать самообновление ES-клеток. Переносчик железа обеспечивает источник железа или обеспечивает способность поглощать железо из культуральной среды. Подходящие переносчики железа включают трансферрин и апотрансферрин.

Предпочтительно, эта среда дополнительно содержит инсулин или инсулиноподобный фактор роста и не содержит питающие клетки и экстракт питающих клеток.

Данное изобретение обеспечивает также среды для культуры клеток, содержащие:

(а) агонист TGF- -рецептора и

(b) цитокин, действующий через gp130.

Эта культуральная среда необязательно дополнена ингибитором дифференцировки ES-клеток или, когда дифференцировка является желательной, факторами передачи сигналов, которые направляют дифференцировку ES-клеток в направлении конкретного фенотипа.

Предпочтительно, эта среда не содержит сыворотку или экстракт сыворотки. Наиболее предпочтительно, эта среда имеет полностью определенный состав.

В предпочтительном варианте данного изобретения эта культуральная среда содержит связывающий gp130-рецептор цитокин, LIF, в концентрации 10 Е/мл - 1000 Е/мл, более предпочтительно 50 Е/мл - 500 Е/мл, еще более предпочтительно около 100 Е/мл.

Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что на активацию путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF- могут влиять либо агонисты TGF- -рецептора выше по ходу процесса (например, лиганды рецептора), конститутивно активные рецепторы или активированные ниже по ходу процесса компоненты пути передачи сигнала, например молекулы трансдукции сигнала SMAD (внутриклеточные белки-медиаторы трансдукции сигнала от рецепторов для внеклеточных TGF- -родственных факторов). Подобным образом, эффекторы выше по ходу процесса (например, цитокины) и эффекторы ниже по ходу процесса (например, STAT, трансдукторы сигнала и активаторы транскрипции) пути трансдукции сигнала с участием gp130 также способны активировать этот путь. Таким образом, данное изобретение охватывает все композиции, содержащие молекулы, способные активировать пути передачи сигнала с участием суперсемейства TGF- -рецепторов и пути передачи сигнала с участием gp130 для стимуляции самообновления плюрипотентных стволовых клеток.

Кроме того, в соответствии с данным изобретением, предпочтительно проводить культивирование клеток в прикрепленной культуре, и в примерах данного изобретения было обнаружено, что после поддержания клеток в плюрипотентном состоянии дифференцировка может быть индуцирована с высокой степенью однородности и с высокой жизнеспособностью клеток. Прикрепленные культуры могут быть стимулированы включением белка клеточной адгезии, а в конкретных примерах данного изобретения использовали желатин в качестве покрытия для культурального субстрата.

Предпочтительным также является культивирование плюрипотентных клеток в соответствии с данным изобретением в монослойной культуре, хотя можно по выбору выращивать клетки в суспензионной культуре или в виде предварительных агрегатов клеток; клетки могут также выращиваться на гранулах или на других подходящих каркасах, таких как мембраны или другие трехмерные структуры.

Следующим компонентом среды для культуры плюрипотентных клеток в соответствии с данным изобретением, который предпочтительно должен присутствовать, является фактор стимуляции выживания и/или метаболизма этих клеток. В конкретном варианте данного изобретения клетки культивируют в присутствии инсулина. Альтернативным фактором является инсулиноподобный фактор и могут быть использованы альтернативно другие подобные стимулирующие выживание и/или метаболизм факторы.

Культуральная среда, используемая в примерах данного изобретения, предпочтительно содержит также сывороточный альбумин. Он может использоваться в очищенной или рекомбинантной форме, и, если он находится в рекомбинантной форме, это дает преимущество отсутствия потенциальных загрязняющих факторов, цитокинов и т.д. Содержание сывороточного альбумина в культуральной среде не является обязательным, и этот компонент может быть опущен или заменен другим объемным белком или синтетическим полимером (поливиниловым спиртом), как описано Wiles et al.

Особенно предпочтительной средой данного изобретения является среда с полностью определенным составом. Эта среда не содержит никаких компонентов, которые являются неопределенными, т.е. компонентов, содержание которых неизвестно, или которые могут содержать неопределенные или варьирующиеся факторы, которые не указаны. Преимущество использования среды полностью определенного состава заключается в том, что могут быть разработаны эффективные и согласующиеся протоколы для культивирования и последующей манипуляции плюрипотентных клеток. Далее, было обнаружено, что поддержание клеток в плюрипотентном состоянии может достигаться с более высокой эффективностью и большей предсказуемостью и что при индукции дифференцировки в клетках, культивируемых с использованием среды определенного состава, реакция на сигнал дифференцировки является более однородной, чем в том случае, когда используют среду неопределенного состава.

Среда данного изобретения может быть использована для культуры плюрипотентных стволовых клеток из любой ткани взрослого индивидуума.

Способы данного изобретения включают также способ получения дифференцированной клетки, предусматривающий культивирование плюрипотентной клетки, как описано выше, и обеспечение возможности или вызывание дифференцировки этой клетки, где эта клетка содержит селектируемый маркер, который способен к дифференциальной экспрессии в желаемой дифференцированной клетке, по сравнению с другими типами клеток, в том числе плюрипотентными клетками, посредством чего дифферециальная экспрессия этого селектируемого маркера приводит к предпочтительному выделению и/или выживанию и/или делению желаемых дифференцированных клеток.

Дифференцированная клетка может быть стволовой клеткой или клеткой-предшественником ткани и может быть терминально дифференцированной клеткой.

Данное изобретение обеспечивает также способ выделения плюрипотентной стволовой клетки или EG-, или ES-клетки, предусматривающий культивирование ткани из эмбриона (зародыша), плода или взрослого в среде, содержащей:

(а) цитокин, действующий через gp130; и

(b) агонист TGF- -рецептора и/или

(с) ингибитор FGF-рецептора.

Предпочтительно, эта среда является средой полностью определенного состава.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает применение комбинации:

(а) ингибитора передачи сигнала FGF-рецептора и

(b) активатора путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса

в стимуляции самообновления плюрипотентных клеток в культуре.

Способы и композиции данного изобретения проиллюстрированы в сопутствующем графическом материале, в котором:

фиг.1 показывает изображение световой микроскопии ES-кеток, выращиваемых либо при высокой, либо при низкой плотности клеток в бессывороточной среде определенного состава данного изобретения; клетки, экспрессирующие белок GFP под контролем специфического для ES-клеток промотора, Oct4, флуоресцируют;

фиг.2 показывает изображения световой микроскопии ES-кеток, стабильно трансфицированных pPCAG-tauGFP-IP, в бессывороточной среде в присутствии LIF и ВМР4;

фиг.3 показывает химерный мышиный эмбрион (в эмбриональный день 11), образованный из бластоцист, инъецированных GFP-экспрессирующими ES-клетками фиг.2;

фиг.4 показывает изображения фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии индивидуальных ES-клеток, посеянных при низкой плотности, в присутствии LIF и ВМР4, и полученных из них клональных популяций при 6 днях после посева;

фиг.5 показывает ES-клетки OS25 и Oct4GFP (пассаж 3), выращиваемые в смеси среда DMEM F12 плюс нейробазальная среда (в соотношении 1:1), дополненной IGF-1 или инсулином, апотрансферрином, прогестероном, путресцином и селенитом натрия;

фиг.6 показывает иммуноблот, демонстрирующий фосфорилирование p-STAT3, STAT3, p-Smad1 и p-Smad2 при 15 минутах и 1 часе после введения одного или нескольких компонентов, выбранных из LIF/BMP4/TGF- 1/сыворотки к ES-клеткам; и

фиг.7 показывает иммуноблот, демонстрирующий фосфорилирование ERK, p38, Smad1 и Smad2 и STAT-3 при 0, 15, 30 минутах, 1, 2, 4, 8 и 24 часах после введения LIF плюс ВМР4 плюс TGF- 1 к ES-клеткам. Распределение фосфорилирования при 1 часе после введения сравнимо с распределением фосфорилирования после введения LIF + сыворотка.

Данное изобретение иллюстрируется с использованием следующих примеров.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Способ выращивания ES-клеток в не содержащей сыворотки, не содержащей питающих клеток культуральной среде определенного состава

N2B27 (смесь 1:1 среды DMEM/F12, дополненной модифицированным N2 (25 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл апотрансферрина, 6 нг/мл прогестерона, 16 мкг/мл путресцина, 30 нМ селенита натрия и 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина) и нейробазальной среды, дополненной В27)

ES-клетки культивировали в покрытых 0,1% желатином чашках в среде N2B27, дополненной LIF (100 Е/мл) и ВМР4 (10 нг/мл). Для пассирования для диссоциации клеток использовали стандартный не содержащий белка буфер для диссоциации клеток.

Плотность клеток при посеве была приблизительно 1-5·10⁴ клеток/см² .

При закладке культуры среду дополнительно дополняли SU 5402 (5 мкМ) для подавления дифференцировки. Клетки переносили на среды без SU 5402 после двух пассажей.

ES-клетки поддерживали в этих бессывороточных условиях в течение 20 пассажей на протяжении трехмесячного периода. Клетки обычно пассировали каждые 2-4 дня в зависимости от плотности. Иногда клетки пассировали спустя 7-10 дней после посева при низкой клональной плотности.

ES-клетки сохраняли плюрипотентность после множественных пассажей. При удалении LIF и ВМР4 эти ES-клетки дифференцировались в экспрессирующие Sox1 нервные клетки-предшественники. В присутствии ВМР4, но в отсутствие LIF эти ES-клетки дифференцировались в большие плоские клетки характерной морфологии.

Пример 2

Экспрессия Oct4-GFP поддерживается в ES-клетках, культивируемых в бессывороточных условиях

ES-клетки Oct4GFP (клон С1) культивировали в среде N2B27, дополненной LIF и SU5402 (см. пример 1), в покрытых 0,1% желатином чашках. После двух пассажей клетки культивировали в среде N2B27, дополненной LIF и ВМР4. Еще после двух пассажей получали изображения световой микроскопии этих клеток под фазово-контрастным микроскопом, чтобы показать морфологию и УФ-флуоресценцию для демонстрации экспрессии GFP. Изображения микроскопии показаны на фиг.1.

Очевидно, что как морфология, так и экспрессия GFP указывает на то, что после четырех пассажей в бессывороточных средах ES-клетки сохраняют их плюрипотентный фенотип.

Пример 3

Стабильная трансфекция ES-клеток

ES-клетки Е14 TG2A культивировали в смеси среда DMEM/F12 плюс нейробазальная среда, дополненной добавками N2-B27, а также дополненной LIF и ВМР4. Эти клетки размножали на покрытых 0,1% желатином чашках, собирали и электропорировали с использованием pPCAG-tauGFP-IP. Трансфицированные клетки пересевали на чашку с диаметром 10 см при плотности 10 ⁵-10⁶ клеток на чашку. Спустя 24 часа добавляли 0,5 мкг/мл пуромицина для отбора на положительные колонии.

Спустя 8-10 дней отдельные GFP-положительные колонии выскребали и помещали каждую колонию в отдельную лунку 96-луночного планшета и эти клетки культивировали в той же самой среде, как описано выше.

Наблюдали стабильную трансфекцию ES-клеток по флуоресценции GFP и размножению морфологически недифференцированных ES-клеток, как показано на фиг.2.

Пример 4

Химерная мышь

Экспрессирующие GFP ES-клетки, полученные, как описано в примере 3 выше, инъецировали в бластоцисты. Экспрессирующие GFP клетки способствовали широкому диапазону типов клеток в химерном эмбрионе мыши, как показано на фиг.3 (эмбриональный день 11). Получали живорожденных химерных мышей, имеющих химерный наружный покров, что подтверждало, что эти клетки были истинными ES-клетками.

Пример 5

Клональное самообновление ES-клеток

Индивидуальные ES-клетки выскребали и переносили в лунки 96-луночного планшета и культивировали в среде, как описано для примера 3 выше.

Авторы изобретения обнаружили, что эффективность клонирования этих ES-клеток, предварительно выращенных в бессывороточных средах в течение, по меньшей мере, одного пассажа, является сходной с эффективностью, получаемой с использованием содержащей сыворотку среды, т.е. эффективность около 10%. Эти клоны росли и могли пассироваться и выращиваться далее в виде недифференцированных ES-клеток в присутствии LIF и ВМР4, как показано на фиг.4.

В предварительных экспериментах (данные не опубликованы) авторы изобретения обнаружили, что ES-клетки, выращенные в содержащей сыворотку среде, при переносе непосредственно в бессывороточную среду демонстрировали более низкое образование клональных колоний.

Пример 6

Рост ES-клеток в среде полностью определенного состава

ES-клетки выращивали в имеющей полностью определенный состав, не содержащей альбумина среде, содержащей среду DMEM F12 и нейробазальную среду (в соотношении 1:1), дополненной IGF-1, 10 мкг/мл (или инсулином при 5-25 мкг/мл), апотрансферрином, 100 мкг/мл, прогестероном, 6 мкг/мл, путресцином, 16 мкг/мл, и селенитом натрия, 30 нмоль.

ES-клетки Oct4GFP пассировали 6 раз (клетки пассировали каждые 6-8 дней) с использованием буфера для диссоциации клеток и пересевали после каждого пассажа при низкой плотности. Изображения микроскопии, полученные после пассажа 3, показаны на фиг.5.

Пример 7

Применение бессывороточной среды и транзиторной стимуляции фактором роста

ES-клетки выращивали исходно в среде, содержащей DMEM F12 и нефробазальную среду (в соотношении 1:1), дополненной N2-B27. ES-клетки засевали при очень низкой плотности, приблизительно 1000-10000 клеток на чашку с диаметром 3,5 см, и выращивали в той же самой среде, дополненной LIF и ВМР4.

Перемежающимся образом к культуральной среде добавляли TGF- при 1-2 нг/мл или активин А при 5 нг/мл, и клетки опять выращивали.

Авторы изобретения наблюдали увеличивающиеся количества недифференцированных ES-клеток, что указывало на увеличенную пролиферацию или увеличенное выживание ES-клеток или и на то, и на другое. Таким образом обнаружили следующий ранговый порядок эффективности:

LIF/ВМР4/активин А (5 нг/мл) > LIF/ВМР4/TGF- (1-2 нг/мл) > LIF/активин А > LIF/ВМР4 > LIF/TGF- 1 > только LIF.

После большего числа (5-6) пассажей этот ранговый порядок изменялся на следующий ранговый порядок:

LIF/ВМР4 > LIF/ВМР4/активин А > LIF/ВМР4/TGF- > LIF/активин А = только LIF.

При постоянном присутствии либо TGF- , либо активина А наблюдали прогрессирующую дифференцировку ES-клеток.

Наблюдали, что введение LIF и ВМР4 приводило к фосфорилированию SMAD, ERK и STAT3 (см. фиг.6 и 7), что указывало на то, что существует активация путей ниже по ходу процесса передачи сигнала от ВМР- и gp130-рецепторов.

Пример 8

Сравнение ES-клеток, выращиваемых в бессывороточной и содержащей сыворотку среде

Авторы культивировали ES-клетки Oct4GFP в покрытых 0,1% желатином 6-луночных чашках при плотности 4·10⁵ клеток на лунку в следующих средах: N2B27 + LIF, N2B27 + LIF + BMP4 и GMEM 10% ФТС + LIF. Результаты показаны в таблице. Для диссоциации клеток использовали буфер для диссоциации клеток. После пассажа 5 количество клеток, выращиваемых в N2B27+LIF, было недостаточным для продолжения культивирования.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает среду и способы для самообновления ES-клеток многих видов.

Таблица Сравнение ES-клеток, выращиваемых в бессывороточной и содержащей сыворотку среде
	N2B27+LIF		N2B27+LIF+BMP4		GMEM/10%FCS+LIF
	Изменение в указанное число раз	Oct4GFP%	Изменение в указанное число раз	Oct4GFP%	Изменение в указанное число раз	Oct4GFP%
P1	3,1±0,4	93,7±0,8	2,4±0,3	93,3±0,8	2,4±0,3	92,4±2,4
P2	2,3±0,5	96,1±1,6	2,2±0,3	95,5±1,0	1,8±0,3	96,8±0,4
P3	3,5±0,7	95,0±2,2	2,7±0,5	93,5±2,8	3,3±0,7	94,0±1,9
P4	2,2±0,5	91,4±2,4	3,6±0,8	95,7±1,2	1,7±0,2	90,3±0,9
P5	1,3±0,4	95,3±2,6	2,4±0,2	97,7±1,8	1,9±0,2	95,1±3,7
P6			3,2±0,3	97,2±1,0	1,5±0,3	94,2±2,4
P7			3,9±1,0	97,4±0,4	2,0±0,5	86,0±4,7
P8			3,4±0,2	95,7±0,6	2,1±0,3	91,9±6,7
ES-клетки Oct4GFP культивировали в покрытых 0,1% желатином 6-луночных чашках при плотности 4·105 клеток на лунку в указанных средах. Для диссоциации клеток использовали буфер для диссоциации клеток. После пассажа 5 количество клеток, выращиваемых в N2B27 + LIF, было недостаточным для продолжения культивирования.