экспрессионная плазмидная днк р-вмс-gag(a)-hum для экспрессии белка р55 вич-1 в клетках эукариот

Формула изобретения

Экспрессионная плазмидная ДНК p-BMC-gag(A)-hum для экспрессии белка р55 ВИЧ-1 в клетках эукариот, отличающаяся тем, что она содержит искусственный ген gag(A)-hum, имеющий последовательность нуклеотидов, представленную на фиг.1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано в медицине и смежных отраслях для повышения экспрессии белков, в частности, кодируемых геном gag вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А белков р17, р24, р7/р9 и р6, в виде общего белка-предшественника р55 или его фрагментов в эукариотических клетках.

Одной из глобальных проблем, стоящих перед биотехнологией, является повышение выхода веществ, продуцируемых клетками прокариот и эукариот. Для решения указанных задач, как правило, клетки подвергают воздействию различных внешних факторов: повышению температуры выше 42°С, уменьшению количества питательных веществ, например фосфатов или азота, до уровня, лежащего ниже того, который требуется для выживания микроорганизмов, токсическое воздействие, например использование красителей, кислот или эксудатов растений, метаболическое разрушение клеток в результате изменения уровня содержания ионов, воздействующих на способность микроорганизмов к осморегуляции, или уровня содержания витаминов или кофакторов, которые способны вызвать прекращение метаболизма (RU 2179980, 2002).

Однако, т.к. воздействие вышеперечисленных факторов на выход конкретных продуцентов характеризуется высокой видоспецифичностью, то для каждого конкретного случая необходимо проведение большого объема исследований.

Наиболее сложно вопросы стимулирования экспрессии решаются в случае получения вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), для изготовления которых необходимо научиться добиваться экспрессии вирусных белков в клетках эукариот без введения вируса, что позволило бы выработать в организме необходимый иммунный ответ. Проблема связана с особенностями последовательностей генов вируса иммунодефицита человека, в частности с использованием в вирусных генах кодонов, не характерных для интенсивно экспрессирующихся генов млекопитающих, в частности человека.

Одним из подходов к решению этой проблемы является использование геномов ретровирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов в качестве стимуляторов для экспрессии протективных антигенов патогенных вирусов в клетках млекопитающих.

Наиболее детально исследования проводились с использованием вируса осповакцины (ВОВ). В частности, были сконструированы рекомбинантные ВОВ, экспрессирующие отдельно индивидуальные белки ВИЧ-1: gp160, gp120. Tat и обратную транскриптазу (Moss В. and Flexner С. // Ann. Rev. Immunol, 1987, v.5, p.305; Moss В. // Seminars in Virology, 1992, v.3, p.277; Falkner F.G. et al. // Virology, 1988, v.164, p.450; Flexner C. et al. // Virology, 1988, v.166, p.339; Takahashi H. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85,p.3105; Walker B.D. et al. // Science, 1988, v.240, p.64; Willey R.L. et al. // J. Virol, 1988, v.62, p.139). Полученные рекомбинантные BOB были использованы для иммунизации лабораторных животных и выявления белков ВИЧ-1, способных вызывать индукцию вирус-нейтрализующих антител. Однако с помощью рекомбинантных ВОВ не удалось индуцировать полноценный протективный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции. По-видимому, это обусловлено низкой иммуногенностью индивидуальных вирусных белков (RU 2194075, 2002).

Для решения проблемы получения иммунного ответа на белки ВИЧ был создан белок TBI, который включает в свой состав несколько клеточных эпитопов ВИЧ-1. Однако при его использовании не удается получить весь спектр целевых продуктов. Кроме того, степень экспрессии получаемых белков недостаточно высока (пат. РФ №2237089, 2005).

Известно использование для экспрессии белков рекомбинантной ДНК pATLG 579, обеспечивающей синтез в клетках E.coli гибридного белка, кодируемого фрагментом гена gag Т-лимфотропного вируса человека (HTLV) и обладающего антигенными свойствами по отношению к антителам против указанного вируса I и II типа.

Гибридный белок, кодируемый данной плазмидой, состоит из 579 аминокислот, из которых 234 аминокислоты представляют собой полипептид, кодируемый геном gag HTLV, участок длиной в 341 аминокислоту является фрагментом бета-галактозидазы и еще 4 аминокислоты кодируются полилинкером вектора. Кроме того, в состав данной плазмиды входит фрагмент вектора pUR290 размером 5,2 т.п.н., содержащий служебные последовательности: промотор, обеспечивающий экспрессию гибридного белка в клетках Escherichia coli, бактериальный репликатор и ген устойчивости к ампициллину, используемый в качестве селективного маркера. Для получения данной плазмиды на матрице промежуточной плазмиды pSma 2131 с помощью полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, содержащими на своих концах сайты рестрикции BamH I и Cla I, амплифицируют фрагмент гена gag, который очищают при помощи электрофореза в агарозе, гидролизуют рестрикгазами BamH I и Cla I и лигируют с обработанным данными рестрикгазами вектором pUR 290. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli с последующим отбором трансформированных клонов по способности расти на питательной среде с ампициллином. Далее осуществляют культивирование трансформированных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде с последующей очисткой из полученной биомассы гибридного белка, обладающего антигенными свойствами HTLV I/II (RU 2149876, 2002; RU 2241752, 2005).

Данное техническое решение позволяет осуществлять синтез полипептида, кодируемого геном gag, в виде гибридного белка в бактериальных клетках. Однако синтез белков, кодируемых геном gag, в клетках высших эукариот не осуществляется.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является стимулирование экспрессии белков р17, р24, р7/р9 и р6 в виде общего белка-предшественника р55 введением в клетку высших эукариот экспрессионной плазмидной ДНК, содержащей кодируемый ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленного на фиг.1 (RU 2241752, 2004). Недостатком указанного изобретения являлся недостаточно высокий выход целевого продукта.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание стимулятора синтеза белка р55, позволяющего повысить его выход.

Технический результат был получен в результате использования в качестве стимулятора экспрессионной плазмидной ДНК, содержащей модифицированный ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, названный gag(A)mod, последовательность которого представлена на фиг.1.

В основу изобретения были положены представления о том, что в генах вируса имеются так называемые ингибирующие участки (INS), в которых много аденина и тимина и редко встречаются гуанин и цитозин. Содержание в составе мРНК таких участков приводит к преждевременному распаду мРНК в клеточном ядре (Для транспорта вирусных мРНК из ядра в цитоплазму вирус использует свой вирусный белок Rev. Пока Rev не синтезировался и не проник в ядро, вирусные мРНК будут находиться в ядре и там распадаться. Появившийся в ядре Rev связывается со специфической последовательностью в мРНК вируса (RRE- Rev Responsible Element) и переносит мРНК в цитоплазму, где затем синтезируются вирусные белки.

В результате проведенных авторами исследований было установлено, что при устранении из гена gag ингибирующих участков удается в 6-10 раз повысить выход белка р55.

Согласно настоящему изобретению новый стимулятор был получен по следующей методике. Был осуществлен анализ кодонов в составе гена gag ВИЧ-1 субтипа А. Все кодоны с высоким содержанием аденина и тимина были заменены на синонимичные кодоны со сниженным содержанием аденина и тимина и, соответственно, более высоким содержанием гуанина и цитозина, при этом в состав гена предпочтительно включали кодоны, характерные для интенсивно экспрессирующихся генов человека. В результате с помощью автоматизированного химического синтеза был получен искусственный ген gag(A)-hum, который был вставлен в вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-gag(A)-hum.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:

На фиг.1а-1б - последовательность нуклеотидов гена gag(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов гена gag(A)mod (прототип);

На фиг.2а-2в - последовательность нуклеотидов искусственного гена gag(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов природного гена gag(A).

Нуклеотиды, одинаковые для двух генов, выделены черным полем, а различающиеся нуклеотиды выделены белым полем. Ген gag(A)-hum длиной 1494 нуклеотида отличается от прототипа по 245 нуклеотидам и по 329 нуклеотидам отличается от природного гена gag(A).

Промышленная применимость заявляемого стимулятора иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК, экспрессирующей искусственный ген gag(A)-hum. Искусственный ген gag(A)-hum, последовательность которого представлена на фиг.1, получали при помощи химического синтеза перекрывающихся фрагментов с последующим отжигом и лигированием. Собранный ген вставляли по общепринятой методике в плазмидный вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-gag(A)-hum. Полученной плазмидой pBMC-gag(A)-hum трансформировали клетки Escherichia coli для ее последующей наработки.

Пример 2. Изучение синтеза белка р55 Gag в эукариотических клетках. Культуру клеток человека линии 293 трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды pBMC-gag(A)-hum. В качестве контроля параллельную культуру клеток 293 трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMCgag(A)-mod. Трансформированные культуры клеток инкубировали в питательной среде в течение 48 часов при температуре 37°С и содержании СО₂ в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку-предшественнику белков gag, р55, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК pBMC-gag(A)-hum, синтез белка р55, кодируемого геном gag, не менее чем в 10 раз выше, чем в клетках, трансформированных контрольной плазмидой pBMC-gag(A)mod.

Пример 3. Изучение накопления белка р55 в культуральной среде. Клетки человека линии 293 трансформировали плазмидами pBMC-gag(A)mod, pBMC-gag(A)-hum и pBMC-gag(A), содержащей природный ген gag вируса иммунодефицита человека и инкубировали в течение 72 часов в условиях, приведенных в примере 2, после чего содержание белка р24 (продукта созревания белка-предшественника р55) в культуральной среде определяли с помощью иммуноферментного анализа. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Концентрация антигена р24 в культуратьной среде клеток линии 293Т, трансформированных плазмидами, экспрессирующими белок р55, после 72 часов культивирования
Плазмида	Концентрация р24, пикограммов/миллилитр
pBMC-gag(A)-hum	759±34,5
pBMC-gag(A)mod	61±8,8
pBMC-gag(A)	5,3±1,5

Пример 4. Использование плазмидной ДНК pBMC-gag(A)-hum для иммунизации. Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидной ДНК pBMC-gag(A)-hum, контрольной группе мышей вводили аналогичные дозы pBMC-gag(A)mod. Через 6 недель в сыворотках крови животных определяли титры антител к белку gag известным способом. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных плазмидными ДНК pBMCgag(A)-hum и pBMCgag(A)mod
Доза плазмидной ДНК (мкг/мышь)	10	25
Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMCgag(A)-hum	1:256	1:4096
Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMCgag(A)mod	1:32	1:512

Полученные результаты показали, что использование в качестве стимулятора синтеза белка р55 в клетках эукариот искусственного гена gag(A)-hum позволяет примерно в 10-12 раз повысить выход целевого продукта.