ультразвуковые контрастные вещества и способ их получения

Формула изобретения

1. Способ получения лиофилизованной матрицы, которая после контакта с водной жидкостью-носителем и газом может быть восстановлена в суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированную преимущественно фосфолипидом, причем указанный способ включает стадии:

a) приготовление водно-органической эмульсии, содержащей i) водную среду, включающую воду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) эмульгирующий состав амфифильных материалов, содержащий более 50 вес.% фосфолипида и iv) лиопротективный агент;

b) лиофилизацию указанной эмульгированной смеси с получением лиофилизованной матрицы, содержащей указанный фосфолипид.

2. Способ по п.1, в котором стадия а) приготовления эмульсии включает следующие стадии:

а1) приготовление суспензии путем диспергирования эмульгирующего состава и лиопротективного агента в водной среде;

а2) смешение полученной суспензии с органическим растворителем;

а3) регулируемое перемешивание смеси с получением эмульсии.

3. Способ по п.1, в котором растворимость органического растворителя в воде составляет менее 10 г/л.

4. Способ по п.3, в котором растворимость органического растворителя в воде составляет 0,001 г/л или меньше.

5. Способ по п.1, в котором органический растворитель выбран из разветвленных или прямых алканов, алкенов, циклоалканов, ароматических углеводородов, простых алкиловых эфиров, кетонов, галогенированных углеводородов, перфторированных углеводородов и их смесей.

6. Способ по п.5, в котором растворитель выбран из пентана, гексана, гептана, октана, нонана, декана, 1-пентена, 2-пентена, 1-октена, циклопентана, циклогексана, циклооктана, 1-метилциклогексана, бензола, толуола, этилбензола, 1,2-диметилбензола, 1,3-диметилбензола, дибутилового эфира и диизопропилкетона, хлороформа, четыреххлористого углерода, 2-хлор-1-(дифторметокси)-1,1,2-трифторэтана (энфлюрана), 2-хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифторэтана (изофлюрана), тетрахлор-1,1-дифторэтана, перфторпентана, перфторгексана, перфторгептана, перфторнонана, перфторбензола, перфтордекалина, метилперфторбутилового эфира, метилперфторизобутилового эфира, этилперфторбутилового эфира, этилперфторизобутилового эфира и их смесей.

7. Способ по одному из предыдущих пунктов, в котором количество органического растворителя составляет от примерно 1 до примерно 50 об.% от количества воды.

8. Способ по п.1, в котором лиопротективный агент выбран из углеводородов, сахарных спиртов, полигликолей и их смесей.

9. Способ по п.8, в котором лиопротективный агент выбран из глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, лактозы, амилозы, амилопектина, циклодекстрина, декстрана, инулина, растворимого крахмала, гидроксиэтилкрахмала (HES), эритрита, маннита, сорбита, полиэтиленгликолей и их смесей.

10. Способ по п.1, в котором количество лиопротективного агента составляет от примерно 1 до примерно 25 вес.% от веса воды.

11. Способ по п.1, в котором фосфолипид выбран из дилауроилфосфатидилхолина (DLPC), димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), диарахидоилфосфатидилхолина (DAPC), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (Этил-DSPC), дипентадеканоилфосфатидилхолина (DPDPC), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатидилхолина (МРРС), 1-пальмитоил-2-миристоилфосфатидилхолина (РМРС), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолина (PSPC), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолина (SPPC), 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилхолина (РОРС), 1-олеил-2-пальмитоилфосфатидилхолина (ОРРС), дилауроилфосфатидилглицерина (DLPG) и его солей с щелочными металлами, диарахидоилфосфатидилглицерина (DAPG) и его солей с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG) и его солей с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG) и его солей с щелочными металлами, дистеароилфосфатидилглицерина (DSPG) и его солей с щелочными металлами, диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG) и его солей с щелочными металлами, димиристоилфосфатидной кислоты (DMPA) и ее солей с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидной кислоты (DPPA) и ее солей с щелочными металлами, дистеароилфосфатидной кислоты (DSPA), диарахидоилфосфатидной кислоты (DAPA) и ее солей с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE), диарахидоилфосфатидилэтаноламина (DAPE), дилинолеилфосфатидилэтаноламина (DLPE), модифицированного полиэтиленгликолем димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE-ПЭГ), модифицированного полиэтиленгликолем дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE-ПЭГ), модифицированного полиэтиленгликолем дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE-ПЭГ), модифицированного полиэтиленгликолем диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE-ПЭГ), модифицированного полиэтиленгликолем диарахидоилфосфатидилэтаноламина (DAPE-ПЭГ), модифицированного полиэтиленгликолем дилинолеилфосфатидилэтаноламина (DLPE-ПЭГ), димиристоилфосфатидилсерина (DMPS), диарахидоилфосфатидилсерина (DAPS), дипальмитоилфосфатидилсерина (DPPS), дистеароилфосфатидилсерина (DSPS), диолеоилфосфатидилсерина (DOPS), дипальмитоилсфингомиелина (DPSP), дистеароилсфингомиелина (DSSP) и их смесей.

12. Способ по п.1, в котором эмульгирующий состав амфифильных материалов содержит фосфолипид, несущий суммарный ненулевой заряд, или амфифильный материал, несущий суммарный ненулевой заряд.

13. Способ по п.1, в котором количество фосфолипида составляет от примерно 0,005 до примерно 1,0 вес.% от полного веса эмульгированной смеси.

14. Способ по п.13, в котором количество фосфолипида составляет от 0,01 до 1,0 вес.% от полного веса эмульгированной смеси.

15. Способ по п.1, в котором фосфолипид включает нацеливающий лиганд или защитную реакционноспособную группу, способную взаимодействовать с нацеливающим лигандом.

16. Способ по п.1, в котором эмульсия дополнительно содержит амфифильный материал, выбранный из лизолипидов, жирных кислот и их соответствующих солей с щелочью или щелочными металлами, полимеров, несущих липиды; сульфированных моно-, ди-, олиго- или полисахаридов, несущих липиды; липидов, связанных с жирными кислотами простой или сложноэфирной связью; полимеризованных липидов; диацетилфосфата; дицетилфосфата; стеариламина; церамидов; полиоксиэтилированных сложных эфиров жирных кислот; полиоксиэтилированных жирных спиртов; полиоксиэтилированных простых эфиров жирных спиртов; полиоксиэтилированных сложных эфиров сорбита и жирных кислот; модифицированного полиэтиленгликолем глицеринрицинолеата; этоксилированных стеринов соевых бобов; этоксилированного касторового масла; блок-сополимеров этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО); стериновых сложных эфиров сахарных кислот; сложных эфиров сахаров с алифатическими кислотами;

сложных эфиров глицерина с (C₁₂-C ₂₄) дикарбоновыми жирными кислотами и их соответствующими солями с щелочами или солями щелочных металлов; сапонинов; длинноцепочечных (С₁₂-С₂₄)-спиртов; 6-(5-холестен-3 -илокси)-1-тио- -D-галактопиранозида; дигалактозилдиглицерида; 6-(5-холестен-3 -илокси) гексил-6-амино-6-деокси-1-тио- -D-галактопиранозида; 6-(5-холестен-3 -илокси)гексил-6-амино-6-деоксил-1-тио- -D-маннопиранозида; 12-(((7'-диэтиламинокумарин-3-ил)карбонил)метиламино)-октадекановой кислоты; N-[12-(((7'-диэтиламинокумарин-3-ил)карбонил)метиламино)октадеканоил]-2-аминопальмитиновой кислоты; N-сукцинилдиолеилфосфатидилэтаноламина; 1-гексадецил-2-пальмитоилглицерофосфоэтаноламина; пальмитоилгомоцистеина; алкиламмониевых солей, содержащих по меньшей мере одну (С₁₀-С ₂₀) алкильную цепь; солей третичного или четвертичного аммония, содержащих по меньшей мере одну (С₁₀ -С₂₀)-ацильную цепь, соединенную с атомом N через (С₃-С₆)-алкиленовый мостик, и их смесей или комбинаций.

17. Способ по п.1, в котором водно-органическую эмульсию со стадии а) подвергают стадии промывки перед стадией лиофилизации b).

18. Способ по п.1, в котором водно-органическую эмульсию со стадии а) подвергают стадии микрофильтрации перед стадией лиофилизации b).

19. Способ по п.1, который включает дополнительно добавление водной суспензии, содержащей дополнительное амфифильное соединение, в водно-органическую эмульсию, полученную согласно стадии а), перед стадией лиофилизации b), с получением, таким образом, второй водно-органической эмульсии, содержащую указанное дополнительное амфифильное соединение.

20. Способ по п.19, который включает дополнительно нагрев смеси указанной водной суспензии и указанной водно-органической эмульсии.

21. Способ по п.19, в котором указанную смесь нагревают при температуре от примерно 40°С до примерно 80°С.

22. Способ по п.19, в котором указанное амфифильное соединение является ПЭГ-модифицированным фосфолипидом, причем ПЭГ-модифицированный фосфолипид имеет реакционноспособный компонент, или ПЭГ-модифицированный фосфолипид имеет нацеливающий лиганд.

23. Способ по п.1, который включает дополнительно до стадии лиофилизации b), регулируемый нагрев водно-органической эмульсии.

24. Способ по п.19, который включает дополнительно до стадии лиофилизации b), регулируемый нагрев водно-органической эмульсии.

25. Способ по п.23 или 24, в котором указанный регулируемый нагрев осуществляют при температуре от примерно 60°С до 125°С.

26. Способ по п.25, в котором указанную эмульсию помещают в запаивающийся флакон.

27. Способ получения пригодного для инъекций контрастного вещества, содержащего жидкую водную суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированную преимущественно фосфолипидом, который включает стадии

получения лиофилизированной матрицы в соответствии со способом по одному из пп.1-24;

контактирование указанной лиофилизованной матрицы с биосовместимым газом и

восстановление указанной лиофилизованной матрицы путем растворения ее в физиологически приемлемой водной жидкости-носителе, с получением суспензии наполненных газом микропузырьков, стабилизированной преимущественно указанным фосфолипидом.

28. Способ по п.27, в котором биосовместимый газ выбран из воздуха, азота, кислорода, двуокиси углерода, водорода, закиси азота, инертных газов, низкомолекулярного углеводорода, в том числе (С₁-С₇ )-алкана, (C₄-С₇)-циклоалкана, (С₂-С₇)-алкена и (С₂-С₇)-алкина, простого эфира, кетона, сложного эфира, галогенированного (С ₁-С₇)углеводорода, кетона или простого эфира, или смесей любых из вышеупомянутых веществ.

29. Способ по п.28, в котором галогенированный углеводородный газ является перфторированным углеводородом или гексафторидом серы.

30. Способ по п.29, в котором перфорированный углеводородный газ является перфторметаном, перфторэтаном, перфторпропаном, перфторбутаном, перфторпентаном, перфторгексаном, перфторгептаном; перфторпропеном, перфторбутеном, перфторбутадиеном, перфторбут-2-ином, перфторциклобутаном, перфторметилциклобутаном, перфтордиметилциклобутаном, перфтортриметилциклобутаном, перфторциклопентаном, перфторметилциклопентаном, перфтордиметилциклопентаном, перфторциклогексаном, перфторметилциклогексаном, перфторметилциклогексаном и их смесями.

31. Пригодное для инъекции контрастное вещество, включающее жидкую водную суспензию наполненных газом микропузырьков, полученное в соответствии со способом по п.27, причем указанные микропузырьки имеют среднечисленный диаметр (D_N) менее 1,70 мкм и медианный диаметр объемного распределения (D_V50) такой, что отношение D_V50/D _N составляет примерно 2,00 или меньше.

32. Контрастное вещество по п.31, в котором указанные микропузырьки имеют значение D_N 1,60 мкм или меньше, предпочтительно 1,50 мкм или меньше, более предпочтительно 1,30 мкм или меньше.

33. Контрастное вещество по п.31, в котором указанные микропузырьки имеют отношение D_V50/D_N примерно 1,80 или меньше, предпочтительно примерно 1,60 или меньше, более предпочтительно примерно 1,50 или меньше.

34. Контрастное вещество для применения в диагностической интроскопии, где контрастное вещество определено в любом из пп.31-33.

35. Способ диагностической интроскопии, включающий введение пациенту улучшающего контрастность количества контрастного вещества по любому из пп.31-33 и получение изображения по меньшей мере части указанного пациента.

36. Способ по п.35, который включает обработку ультразвуком указанного пациента с помощью ультразвукового прибора, генерирующего ультразвуковые волны с заранее установленной выходной частотой, определяющей соответствующий резонансный размер микропузырьков, и введение контрастного вещества, содержащего наполненные газом микропузырьки с узким распределением по размерам и средним размером, близким к половине резонансного размера.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу получения сухой или лиофилизованной композиции, пригодной для получения газа, содержащего контрастное вещество, пригодное для использования в диагностической интроскопии, и к способу получения указанного газа, содержащего контрастное вещество.

Изобретение включает также сухие композиции, полученные этим способом, которые могут быть восстановлены с образованием суспензий контрастного вещества, пригодных в диагностической интроскопии. Кроме того, изобретение включает суспензии наполненных газом микропузырьков, пригодных в диагностической интроскопии, полученных с использованием сухих композиций согласно изобретению, а также контейнеров или двухкомпонентных наборов, содержащих сухие композиции изобретения.

Предпосылки изобретения

В результате быстрого развития ультразвуковых контрастных веществ в последние годы был создан ряд различных композиций, пригодных для ультразвуковой визуализации органов и тканей тела человека или животных. Эти вещества предназначены для использования прежде всего как внутривенные или внутриартериальные инъекции в связи с применением медицинского эхографического оборудования, в котором используется, например, формирование двумерных изображений (на основе пространственного распределения свойств обратного рассеяния тканей) или обработка доплеровского сигнала (на основе обработки ультразвуковых эхосигналов в режиме незатухающих волн или в импульсном доплеровском режиме) для определения параметров тока крови или жидкостей.

Класс пригодных для инъекций композиций, пригодных в качестве ультразвуковых контрастных веществ, включает суспензии пузырьков газа с диаметром несколько микрон, диспергированных в водной среде.

Применение суспензий пузырьков газа в жидкости-носителе как эффективных ультразвуковых отражателей хорошо известно в уровне техники. Развитие микропузырьковых суспензий как эхофармацевтиков для улучшения ультразвуковой визуализации последовало за ранними наблюдениями, что быстрые внутривенные инъекции водных растворов могут вызывать выход растворенных газов из раствора, образуя пузырьки. Было обнаружено, что из-за существенного различия их акустического сопротивления и сопротивления крови эти внутрисосудистые пузырьки газа являются прекрасными отражателями ультразвука. Инъекция суспензий пузырьков газа в жидкости-носителе в кровоток живого организма существенно интенсифицирует ультразвуковую эхографическую визуализацию, улучшая тем самым визуализацию внутренних органов. Поскольку получение изображений органов и глубоко находящихся тканей может быть решающим при установлении медицинского диагноза, много усилий было направлено на создание стабильных суспензий высококонцентрированных пузырьков газа, которые в то же самое время были бы просты в приготовлении и приеме, содержали бы минимум неактивных соединений и были бы способны в долгому хранению и простому распространению.

Однако простое распределение свободных пузырьков газа в водной среде имеет ограниченный практический интерес, так как эти пузырьки, как правило, недостаточно стабильны, чтобы быть пригодными в качестве ультразвуковых контрастных веществ.

Соответственно, был проявлен интерес к способам стабилизации газовых пузырьков для эхографии и других ультразвуковых исследований, например, путем использования эмульгаторов, масел, загустителей или сахаров или путем включения или инкапсулирования газа или его прекурсора в различные системы. Эти стабилизированные пузырьки газа в уровне техники обычно называют "микровезикулами", и их можно разделить на две основные категории.

Первую категорию стабилизированных пузырьков, или микровезикул, обычно в данной области называют "микропузырьками", сюда относятся водные суспензии, в которых пузырьки газа удерживаются на границе раздела газ/жидкость очень тонкой пленкой, содержащей ПАВ (т.е. амфифильный материал), расположенный на границе раздела газа и жидкости. Вторую категорию микровезикул обычно в уровне техники называют "микросферами " или "микрокапсулами", к ней относятся суспензии, в которых пузырьки газа окружены оболочкой из твердого материала, образованного из натуральных или синтетических полимеров. Примеры микросфер и их получение описаны, например, в Европейской патентной заявке EP 0458745. Другой вид ультразвукового контрастного вещества включает суспензии пористых микрочастиц из полимера или других твердых частиц, которые несут пузырьки газа захваченными в порах микрочастиц. Настоящее изобретение относится, в частности, к контрастным веществам для диагностической интроскопии, включающим водную суспензию микропузырьков газа, т.е. микровезикул, которые стабилизированы в основном слое амфифильного материала.

Микропузырьковые суспензии обычно готовят путем приведения порошкообразных амфифильных материалов, например осушенных сублимацией заранее готовых липосом или осушенных сублимацией или распылением фосфолипидных суспензий, в контакт с воздухом или другим газом и затем с водным носителем, перемешивая для создания микропузырьковой суспензии, которую затем нужно будет принимать вскоре после ее приготовления.

Примеры водных суспензий микропузырьков газа и их получение можно найти, например, в документах US 5271928, US 5445813, US 5413774, US 5556610, 5597549, US 5827504.

В патенте WO 97/29783 раскрывается альтернативный способ получения суспензий микропузырьков газа, включающий образование дисперсии микропузырьков газа в подходящей водной среде, содержащей фосфолипиды, после этого дисперсию подвергают лиофилизации для получения сухого восстанавливаемого продукта. Приготовленные таким образом сухие продукты могут быть восстановлены в водных средах при необходимости лишь минимального перемешивания. Как упомянуто в указанном документе, размер образованных таким образом микропузырьков может всегда воспроизводиться и на практике не зависит от количества энергии смешения, прикладываемой для восстановления, а определяется размером микропузырьков, образованных в исходной микропузырьковой дисперсии. Заявитель, однако, обнаружил, что количество энергии перемешивания, приложенной для создания дисперсии микропузырьков газа в водной среде, содержащей фосфолипиды, может быть излишне высоким, в частности, когда должны быть получены микропузырьки малого диаметра (например, 23000 об/мин в течение 10 минут для получения дисперсии пузырьков средним по объему диаметром примерно 3 мкм). Эта высокая энергия перемешивания может вызвать локальный перегрев в водной дисперсии микропузырьков, что может, в свою очередь, вызвать деградацию фосфолипидов, содержащихся в водной среде. Кроме того, влияние излишне высокой энергии перемешивания обычно трудно контролировать, и это может привести к неконтролируемому распределение конечных микропузырьков по размерам. Кроме того, этот процесс предусматривает постоянный поток газа в водную среду при образовании микропузырьков, что требует, таким образом, применения больших количеств газов.

В документе WO 94/01140 описан следующий способ получения суспензий микровезикул, восстанавливаемых в водной среде, который включает лиофилизацию водных эмульсий, содержащих парантерально приемлемые эмульгаторы, неполярные жидкости и жидкие структурообразователи, растворимые в липидах или не растворимые в воде. В качестве парантерально приемлемых эмульгаторов упоминались полоксамеры и фосфолипиды, а смеси двух из них применялись в рабочих примерах. Холестерин является предпочтительным водонерастворимым структурообразователем, который применяется в рабочих примерах. Затем лиофилизованный продукт восстанавливают в воде, чтобы получить водную суспензию наполненных газом микровезикул. Наполненные газом микровезикулы, полученные в результате стадии восстановления, являются, таким образом, ограниченными оболочкой из различных материалов, в том числе эмульгаторов, таких как полоксамеры, и водонерастворимых структурообразователей, таких как холестерин.

Указано, что процесс приводит к эмульсии с размером частиц менее 4 мкм, предпочтительно менее 2 мкм и до 0,5 мкм. Однако заявитель отметил, что хотя этап восстановления может в конечном счете привести к микровезикулам, имеющим среднечисленный диаметр менее 2 мкм, тем не менее соответствующее распределение популяции микровезикул по размерам является относительно широким. Кроме того, стадия превращения из микрочастиц эмульсии, полученной в вышеуказанном процессе, в газовые микропузырьки дает в итоге довольно низкий выход.

Теперь заявитель обнаружил, что может быть получено намного более узкое распределение микропузырьков по размерам, если в качестве основного эмульгатора в вышеуказанной эмульсии использовать фосфолипид и если вышеуказанный процесс проводить по существу при отсутствии вышеуказанных водонерастворимых структурообразователей. Кроме того, почти полное отсутствие указанных водонерастворимых структурообразователей позволяет существенно увеличить степень превращения микрочастиц эмульсии в газовые микропузырьки. Кроме того, заявитель обнаружил, что вышеуказанный процесс может привести к еще более узкому распределению микропузырьков по размерам и к увеличенному выходу, если фосфолипид является по существу единственным эмульгатором, присутствующим в эмульсии.

Заявитель нашел также, что прилагая достаточно низкую энергию перемешивания к водно-органической эмульсии во время процесса, какой описан выше, можно получить микропузырьки, имеющие очень маленький диаметр и более узкое распределение по размерам.

Суть изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизованной матрицы, которая при контакте с водной жидкостью-носителем и газом может быть восстановлена в суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированную преимущественно фосфолипидом, причем указанный способ включает стадии:

a) приготовление водно-органической эмульсии, содержащей i) водную среду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) эмульгирующий состав амфифильных материалов, содержащий более 50 вес.% фосфолипида, и iv) лиопротективный агент;

b) лиофилизация указанной эмульгированной смеси с получением лиофилизованной матрицы, содержащей указанный фосфолипид.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения впрыскиваемого контрастного вещества, содержащего жидкую водную суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированных преимущественно фосфолипидом, который включает стадии:

a) приготовление водно-органической эмульсии, содержащей i) водную среду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) эмульгирующий состав амфифильных материалов, содержащий более 50 вес.% фосфолипида, и iv) лиопротективный агент;

b) лиофилизация указанной эмульсии для получения лиофилизованной матрицы, содержащей указанный фосфолипид;

c) контактирование указанной лиофилизованной матрицы с биосовместимым газом;

d) восстановление указанной лиофилизованной матрицы путем растворения ее в физиологически приемлемой водной жидкости-носителе с получением суспензии наполненных газом микропузырьков, стабилизированных преимущественно указанным фосфолипидом.

Предпочтительно стадия a) приготовления эмульсии включает:

a1) приготовление суспензии путем диспергирования эмульгирующего состава амфифильных материалов и лиопротективного агента в водной среде;

a2) смешивание полученной суспензии с органическим растворителем;

a3) регулируемое перемешивание смеси с получением эмульсии.

Предпочтительно регулируемое перемешивание согласно стадии a3) получается при применении гомогенизатора высокого давления или, более предпочтительно, роторно-статорного гомогенизатора.

Следующий аспект изобретения относится к впрыскиваемому контрастному веществу, содержащему суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированных стабилизирующим слоем, преимущественно содержащим фосфолипид в водной жидкости-носителе, причем указанные микропузырьки имеют среднечисленный диаметр (D_N) менее 1,70 мкм и медианный диаметр объемного распределения (D _V50) такой, что отношение D_V50/D _N составляет примерно 2,00 или меньше.

Подробное описание изобретения

Как указано выше, один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизованной матрицы восстанавливаемой суспензии наполненных газом микропузырьков, стабилизированных преимущественно фосфолипидом, причем указанный способ включает приготовление водно-органической эмульсии, содержащей: i) водную среду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) фосфолипид и iv) лиопротективный агент, и последующую лиофилизацию указанной эмульсии.

Водная среда предпочтительно является физиологически приемлемым носителем. Термин "физиологически приемлемый" включает любое соединение, материал или композицию, которые могут приниматься пациентом в выбранном количестве без негативного воздействия или без существенного изменения здоровья или нормального функционирования его организма (например, без фиксирования какого-либо статуса неприемлемой токсичности, вызывающей любой экстремальный или неконтролируемый аллергический отклик, или без установления каких-либо ненормальных патологических условий или состояния болезни).

Подходящими водными жидкими носителями являются вода, обычно стерильная, не содержащая пирогенов вода (чтобы предотвратить по возможности загрязнение промежуточного лиофилизованного продукта), водные растворы, такие как солевые растворы (которые могут быть преимущественно сбалансированы так, чтобы конечный продукт для инъекций не был гипотоническим), или водные растворы одной или более субстанций, регулирующих тонус, как соли или сахара, сахарные спирты, гликоли или другие неионные полиоловые материалы (например, глюкоза, сахароза, сорбит, маннитол, глицерин, полиэтиленгликоли, пропиленгликоли и им подобные).

Органический растворитель

Используемый здесь термин "по существу не смешиваемый с водой", относящийся к органическому растворителю, означает, что когда указанный растворитель смешан с водой, образуются две отдельные фазы. Не смешиваемые с водой растворители обычно известны в уровне техники как аполярные или неполярные растворители, в отличие от полярных растворителей (таких, как вода). Не смешиваемые с водой растворители, как правило, почти не растворимы в воде. Для целей настоящего изобретения органическими растворителями, подходящими для эмульгирования с водным растворителем, являются растворители с растворимостью в воде менее примерно 10 г/л. Предпочтительно растворимость указанного растворителя в воде составляет примерно 1,0 г/л или меньше, более предпочтительно примерно 0,2 г/л или меньше и, намного более предпочтительно, примерно 0,01 г/л или меньше. Особенно предпочтительными растворителями являются растворители с растворимостью в воде 0,001 г/л или меньше. В частности, нерастворимые органические растворители (например, перфторуглероды) могут иметь растворимость вплоть до примерно 1,0·10^-6 г/л (например, перфтороктан 1,66·10^-6 г/л).

Органический растворитель предпочтительно является лиофилизуемым, т.е. указанный растворитель имеет достаточно высокое давление пара при температурах лиофилизации, например, между -30°C и 0°C, чтобы позволить эффективное и полное испарение/сублимацию в пределах приемлемых времен, например 24-48 часов. Предпочтительно давление пара органического растворителя выше примерно 0,2 кПа при 25°C.

Органический растворитель может быть выбран из широкого круга растворителей любой химической природы, то есть не смешиваемых с водой и лиофилизуемых, как указано выше, и которые предпочтительно являются жидкими при комнатной температуре (25°C). Если используется растворитель с точкой кипения ниже, чем комнатная температура, емкость, содержащая эмульгирующую смесь, может преимущественно быть охлаждена ниже точки кипения указанного растворителя, например, до 5°C или 0°C. Поскольку указанный растворитель будет полностью удален во время стадии лиофилизации, не существует никаких особых ограничений, за исключением того, что он не должен содержать загрязняющих веществ, которые не могут быть удалены путем лиофилизации или которые неприемлемы для применения в составах для инъекций.

Подходящие органические растворители включают, без ограничений, алканы, такие как разветвленные или предпочтительно прямые (C ₅-C₁₀)-алканы, например пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан; алкены, такие как (C ₅-C₁₀)-алкены, например, 1-пентен, 2-пентен, 1-октен; циклоалканы, такие как (C₅ -C₈)-циклоалканы, возможно замещенные одной или двумя метильными группами, например циклопентан, циклогексан, циклооктан, 1-метилциклогексан; ароматические углеводороды, такие как бензол и производные бензола, замещенные одной или двумя метильными или этильными группами, например бензол, толуол, этилбензол, 1,2-диметилбензол, 1,3-диметилбензол; простые алкиловые эфиры и кетоны, такие как дибутиловый эфир и диизопропилкетон; галогенированные углеводороды или простые эфиры, такие как хлороформ, четыреххлористый углерод, 2-хлор-1-(дифторметокси)-1,1,2-трифторэтан (энфлюран), 2-хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифторэтан (изофлюран), тетрахлор-1,1-дифторэтан и, в частности, перфторированные углеводороды или простые эфиры, такие как перфторпентан, перфторгексан, перфторгептан, перфторметилциклогексан, перфтороктан, перфторнонан, перфторбензол и перфтордекалин, метилперфторбутиловый эфир, метилперфторизобутиловый эфир, этилперфторбутиловый эфир, этилперфторизобутиловый эфир и их смеси.

Количество растворителя обычно составляет от примерно 1 до примерно 50 об.% от количества воды, используемой для эмульсии. Предпочтительно указанное количество равно от примерно 1% до примерно 20%, более предпочтительно от примерно 2% до примерно 15% и еще более предпочтительно от примерно 5% до примерно 10%. При желании можно использовать смесь двух или более перечисленных выше органических растворителей, причем полное количество органического растворителя в эмульгирующей смеси находится в вышеуказанном диапазоне.

Лиопротективный агент

Термин лиопротективный агент или "лиопротектор" относится к соединению, которое, будучи включено в лиофилизуемую композицию, будет защищать химические соединения от отрицательных воздействий замораживания и вакуумирования, таких как воздействия, обычно сопровождающие лиофилизацию, например повреждение, адсорбция и потери от вакуума, применяемого в лиофилизации. Кроме того, после стадии лиофилизации указанный лиопротективный агент предпочтительно дает в результате твердую матрицу ("массу"), которая держит лиофилизованный фосфолипид.

Настоящее изобретение не ограничено применением конкретного лиопротектора; примеры подходящих лиопротекторов включают, без ограничений, углеводороды, такие как сахариды, моно-, ди- или полисахариды, например глюкозу, галактозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, лактозу, амилозу, амилопектин, циклодекстрины, декстран, инулин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал (HES), сахарные спирты, например маннитол, сорбит и полигликоли, такие как полиэтиленгликоли. Основательный список веществ с лиопротективным действием приведен в публикации Acta Pharm. Technol. 34 (3), pp. 129-139 (1988), содержание которого введено здесь ссылкой. Указанные лиопротективные агенты могут применяться по отдельности или как смеси одного или более соединений.

Предпочтительные лиопротекторы включают маннитол и полисахариды, такие как декстраны (в частности, с молекулярным весом более 1500 дальтон), инулин, растворимый крахмал и гидроксиэтилкрахмал.

Превосходные результаты дают также смеси маннитола или полисахаридов, таких как декстраны, инулин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал, с сахаридами, такими как глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза и эритритол.

Также настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным количеством используемого лиопротектора. Однако оптимальная весовая концентрация лиопротективных агентов в эмульсии до лиофилизации составляет от примерно 1 до примерно 25%, предпочтительно от примерно 2 до примерно 20% и еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 10%.

Более высокое количество может применяться, если лиофилизованному продукту необходимо также придать желаемую "массу".

Лиопротективный агент предпочтительно добавляют в водно-органическую смесь перед ее эмульгированием, следовательно, в этом случае эмульгирование водно-органической смеси проводится в присутствии лиопротективных агентов. Альтернативно, лиопротектор может быть добавлен в водно-органическую смесь после ее эмульгирования. В первом случае лиопротектор предпочтительно добавляют в водную среду перед смешиванием ее с органическим растворителем. При желании можно также комбинировать оба способа, например, добавляя часть лиопротективного агента в водную фазу, используемую для получения эмульсии, а часть - в полученную таким образом эмульсию. При желании в эмульсию могут, кроме того, добавляться также криозащитные агенты, такие как глицерин, для защиты химических соединений от отрицательного воздействия замораживания.

Фосфолипиды

В соответствии с настоящим описанием и формулой изобретения подразумевается, что термин фосфолипид охватывает любое амфифильное фосфолипидное соединение, молекулы которого способны образовывать пленку материала (типично в виде мономолекулярного слоя) на поверхности раздела газ-вода в конечной суспензии микропузырьков. Соответственно эти материалы обозначаются в уровне техники также "пленкообразующими фосфолипидами". Аналогично, в эмульгированной смеси эти амфифильные соединения обычно расположены на границе раздела между водной средой и органическим растворителем, по существу не растворимым в воде, тем самым стабилизируя эмульгированные микрокапли растворителя. Пленка, образованная этими соединениями на границе раздела газ-вода или вода-растворитель, может быть непрерывной или дискретной. Однако в последнем случае разрывы в пленке не должны быть такими, чтобы ухудшать стабильность (например, сопротивление давлению, устойчивость к коалесценции и т.д.) суспендированных микропузырьков или эмульгированных микрокапель соответственно.

Термин "амфифильное соединение", как он используется здесь, включает соединения, имеющие молекулу с гидрофильной полярной головкой (например, полярную или ионную группу), способную взаимодействовать с водной средой, и гидрофобную органическую хвостовую часть (например, углеводородную цепь), способную взаимодействовать, например, с органическим растворителем. Следовательно, эти соединения действуют, как правило, как "поверхностно-активное вещество", т.е. как соединения, которые способны стабилизировать смеси материалов, по-иному обычно несмешивающихся, таких как смеси двух несмешивающихся жидкостей (например, вода и масло), смеси жидкостей с газами (например, микропузырьки газа в воде) или смеси жидкостей с нерастворимыми частицами (например, металлические наночастицы в воде).

Амфифильные фосфолипидные соединения обычно содержат по меньшей мере одну фосфатную группу и по меньшей мере одну, предпочтительно две липофильные длинноцепочечные углеводородные группы.

Примеры подходящих фосфолипидов включают сложные эфиры глицерина с одним или предпочтительно двумя (одинаковыми или разными) остатками жирных кислот и с фосфорной кислотой, причем остаток фосфорной кислоты, в свою очередь, присоединен к гидрофильной группе, такой как холин (фосфатидилхолины - PC), серин (фосфатидилсерины - PS), глицерин (фосфатидилглицерины - PG), этаноламин (фосфатидилэтаноламины - PE), инозитол (фосфатидилинозитол) и им подобным группам. Сложные эфиры фосфолипидов с единственным остатком жирной кислоты обычно называют в уровне техники "лизо"-формами фосфолипида. Жирнокислотные остатки, присутствующие в фосфолипидах, являются обычно длинноцепочечными алифатическими кислотами, обычно содержащими от 12 до 24 атомов углерода, предпочтительно от 14 до 22; алифатическая цепь может содержать одну или более ненасыщенность или предпочтительно является полностью насыщенной. Примерами подходящих жирных кислот, содержащихся в фосфолипидах, являются, например, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахидоновая кислота, бегеновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота. Предпочтительно применяются насыщенные жирные кислоты, такие как миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и арахидоновая кислота.

Дальнейшими примерами фосфолипидов являются фосфатидные кислоты, т.е. сложные диэфиры глицерина и фосфорной кислоты с жирными кислотами; сфинголипиды, такие как сфингомиелины, т.е. такие аналоги фосфатидилхолина, в которых остаток диэфира глицерина и жирных кислот замещен церамидной цепью; кардиолипины, т.е. сложные эфиры 1,3-дифосфатидилглицерина и жирной кислоты, гликолипиды, такие как ганглиозиды GM1 (или GM2) или цереброзиды, глюколипиды, сульфатиды и гликосфинголипиды.

Используемый здесь термин фосфолипиды включает встречающиеся в природе полусинтетические либо синтетические продукты, которые могут применяться по отдельности или как смеси.

Примерами встречающихся в природе фосфолипидов являются натуральные лецитины (производные фосфатидилхолина (PC)), такие как, обычно, соевые бобы или лецитины яичного желтка.

Примерами полусинтетических фосфолипидов являются частично или полностью гидрогенизированные производные природного лецитина. Предпочтительными фосфолипидами являются сложные диэфиры жирных кислот и фосфатидилхолина, этилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина или сфингомиелина.

Примерами предпочтительных фосфолипидов являются, например, дилауроилфосфатидилхолин (DLPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диарахидоилфосфатидилхолин (DAPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DSPC), дипентадеканоилфосфатидилхолин (DPDPC), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (MPPC), 1-пальмитоил-2-миристоилфосфатидилхолин (PMPC), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин (PSPC), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (SPPC), 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилхолин (POPC), 1-олеил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (OPPC), дилауроилфосфатидилглицерин (DLPG) и его соли с щелочными металлами, диарахидоилфосфатидилглицерин (DAPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) и его соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG) и его соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG) и его соли с щелочными металлами, диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидная кислота (DMPA) и ее соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидная кислота (DPPA) и ее соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидная кислота (DSPA), диарахидоилфосфатидная кислота (DAPA) и ее соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), диарахидоилфосфатидилэтаноламин(DAPE), дилинолеилфосфатидилэтаноламин (DLPE), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), диарахидоилфосфатидилсерин (DAPS), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), дипальмитоилсфингомиелин (DPSP), дистеароилсфингомиелин (DSSP).

Термин фосфолипид включает, кроме того, модифицированный фосфолипид, например фосфолипиды, где гидрофильная группа соединена, в свою очередь, с другой гидрофильной группой. Примерами модифицированных фосфолипидов являются фосфатидилэтаноламины, модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.е. фосфатидилэтаноламины, в которых гидрофильная этаноламиновая часть связана с молекулой ПЭГ различного молекулярного веса, например от 300 до 5000 дальтон, такие как DPPE-ПЭГ или DSPE-ПЭГ, т.е. DPPE (или DSPE), к которым присоединен полимер ПЭГ. Например, DPPE-ПЭГ2000 означает DPPE, к которому присоединен полимер ПЭГ со средним молекулярным весом примерно 2000. Как подробно поясняется далее, эти ПЭГ-модифицированные фосфолипиды предпочтительно применяются в комбинации с немодифицированными фосфолипидами.

Как нейтральные, так и заряженные фосфолипиды, а также их смеси могут удовлетворительно применяться в способе согласно настоящему изобретению. Как он используется здесь и в предшествующем уровне, термин "заряженный" в отношении "фосфолипидов" означает, что индивидуальные молекулы фосфолипида имеют суммарный ненулевой заряд, положительный или, чаще, отрицательный.

Примерами фосфолипидов, несущих суммарный отрицательный заряд, являются производные, в частности, жирнокислотных сложных диэфиров фосфатидилсерина, такие как DMPS, DPPS, DSPS; фосфатидной кислоты, такие как DMPA, DPPA, DSPA; фосфатидилглицерина, такие как DMPG, DPPG и DSPG. Также в качестве отрицательно заряженных молекул могут применяться модифицированные фосфолипиды, в частности ПЭГ-модифицированные фосфатидилэтаноламины, такие как DMPE-ПЭГ750, DMPE-ПЭГ1000, DMPE-ПЭГ2000, DMPE-ПЭГ3000, DMPE-ПЭГ4000, DMPE-ПЭГ5000, DPPE-ПЭГ750, DPPE-ПЭГ1000, DPPE-ПЭГ2000, DPPE-ПЭГ3000, DPPE-ПЭГ4000, DPPE-ПЭГ5000, DSPE-ПЭГ750, DSPE-ПЭГ1000, DSPE-ПЭГ2000, DSPE-ПЭГ3000, DSPE-ПЭГ4000, DSPE-ПЭГ5000, DAPE-ПЭГ750, DAPE-ПЭГ1000, DAPE-ПЭГ2000, DAPE-ПЭГ3000, DAPE-ПЭГ4000 или DAPE-ПЭГ5000. Также в качестве отрицательно заряженного соединения могут с успехом применяться лизоформы вышеуказанных фосфолипидов, такие как производные лизофосфатидилсерина (например, лизо-DMPS, -DPPS или -DSPS), производные лизофосфатидной кислоты (например, лизо-DMPA, -DPPA или -DSPA) и производные лизофосфатидилглицерина (например, лизо-DMPG, -DPPG или -DSPG).

Примерами фосфолипидов, несущих суммарный положительный заряд, являются производные этилфосфатидилхолина, в частности сложные эфиры этилфосфатидилхолина и жирных кислот, такие как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DSPC или DSEPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DPPC или DPEPC).

Предпочтительно применяются смеси двух или более фосфолипидов, по меньшей мере одного незаряженного и по меньшей мере одного с суммарным ненулевым зарядом. Более предпочтительно применяются смеси двух или более фосфолипидов, по меньшей мере одного незаряженного и по меньшей мере одного с отрицательным суммарным зарядом. Количество заряженного фосфолипида может изменяться от примерно 95 до примерно 5 вес.% от полного количества фосфолипида, предпочтительно от 80 до 20 вес.%. Присутствие по меньшей мере небольших количеств, таких как от 5 до 20 вес.% от полного веса фосфолипида, (отрицательно) заряженного фосфолипида может помочь предотвратить агрегацию пузырьков или капель эмульсии. Однако можно использовать и один фосфолипид, нейтральный или заряженный, или смесь двух или более фосфолипидов, из которых все являются нейтральными или все имеют суммарный ненулевой заряд.

Предпочтительными фосфолипидами являются DAPC, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS, DPPE, DSPE, DSPG, DPPG и Этил-DSPC. Наиболее предпочтительны DSPA, DPPS или DSPS.

Предпочтительными смесями фосфолипидов являются смеси DPPS с DPPC, DSPC или DAPC (от 95/5 до 5/95 вес./вес.), смеси DSPA с DSPC или DAPC (от 95/5 до 5/95 вес./вес.), смеси или DSPG, или DPPG с DSPC, или смеси DSPC с Этил-DSPC. Наиболее предпочтительны смеси DPPS/DSPC (от 50/50 до 10/90 вес./вес.) или DSPA/DSPC (от 50/50 до 20/80 вес./вес.).

Количество фосфолипида обычно составляет от примерно 0,005 до примерно 1,0 вес.% от полного веса эмульгированной смеси. Конечно, могут применяться и более высокие количества, но принимая во внимание, что конечный продукт является впрыскиваемым контрастным веществом, предпочтительно не применять избыточное количество добавок, только если это не является строго необходимым для получения стабильного и пригодного продукта. Вообще, при использовании большего количества фосфолипида, чем указанное в качестве верхнего предела вышеуказанного диапазона, не наблюдается никакого или очень незначительное улучшение с точки зрения популяции пузырьков, распределения пузырьков по размерам и стабильности пузырьков. Обычно более высокие количества фосфолипида требуются, когда используются повышенные объемы органического растворителя. Таким образом, когда объем органического растворителя доходит до примерно 50% объема водной фазы, в эмульсию может быть с успехом добавлено примерно 1% (вес./вес.) фосфолипида. Предпочтительно количество фосфолипида составляет от 0,01 до 1,0 вес.% от общего веса эмульгированной смеси, более предпочтительно от примерно 0,05 до 0,5 вес.%.

Как указано выше, микропузырьки, полученные согласно способу изобретения, стабилизированы преимущественно фосфолипидом, как определенный выше. В частности, оболочка, окружающая наполненные газом микропузырьки, образована более чем на 50% (вес./вес.), предпочтительно по меньшей мере на 80% и намного более предпочтительно по меньшей мере на 90% из фосфолипидного материала, как определенный выше. Обычно стабилизирующая оболочка микропузырьков по существу полностью образована фосфолипидом.

Однако с фосфолипидом могут быть смешаны другие амфифильные материалы, образующие стабилизирующую оболочку наполненных газом микропузырьков, в количестве менее 50% от полного веса эмульгирующего состава.

Примеры подходящих дополнительных стабилизирующих оболочку амфифильных материалов включают, например, лизолипиды; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, арахидиновая кислота, арахидоновая кислота, бегеновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота или линоленовая кислота и их соответствующие соли с щелочами или щелочными металлами; липиды, несущие полимеры, такие как хитин, гиалуроновая кислота, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль (ПЭГ), называемые также "пегилированными липидами"; липиды, имеющие сульфированные моно-, ди-, олиго- или полисахариды; липиды с жирными кислотами, связанными простой или сложноэфирной связью; полимеризованные липиды; диацетилфосфат; дицетилфосфат; стеариламин; церамиды; полиоксиэтилированные сложные эфиры жирной кислоты (такие, как полиоксиэтилированные стеараты жирных кислот); полиоксиэтилированные жирные спирты; полиоксиэтилированных простые эфиры жирных спиртов; полиоксиэтилированные сложные эфиры сорбита и жирной кислоты, модифицированный полиоксиэтиленом глицеринрицинолеат; этоксилированные стерины соевых бобов; этоксилированное касторовое масло; блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО); стериновые сложные эфиры сахарных кислот, в том числе глюкурониды холестерина, глюкорониды ланостерина, 7-дегидрохолестеринглюкоронид, эргостеринглюкоронид, холестеринглюконат, ланостеринглюконат или эргостеринглюконат; сложные эфиры сахарных кислот и спиртов, в том числе лаурилглюкоронид, стеарилглюкоронид, миристоилглюкоронид, лаурилглюконат, миристоилглюконат или стеароилглюконат; сложные эфиры сахаров с алифатическими кислотами, в том числе лаурат сахарозы, лаурат фруктозы, пальмитат сахарозы, стеарат сахарозы, глюкуроновая кислота, глюконовая кислота или полиуроновая кислота; сложные эфиры глицерина с (C ₁₂-C₂₄)-, предпочтительно (C ₁₄-C₂₂)-дикарбоновыми жирными кислотами и их соответствующими солями с щелочью или солями с щелочными металлами, такие как 1,2-дипальмитоил-sn-3-сукцинилглицерин или 1,3-дипальмитоил-2-сукцинилглицерин; сапонины, в том числе сарсасапогенин, смилагенин, гедерагенин, олеаноловая кислота или дигитоксигенин; длинноцепочечные (C_l2-C ₂₄)-спирты, в том числе н-дециловый спирт, лауриловый спирт, миристиловый спирт, цетиловый спирт или н-октадециловый спирт; 6-(5-холестен-3 -илокси)-1-тио- -D-галактопиранозид; дигалактозилдиглицерид; 6-(5-холестен-3 -илокси)-гексил-6-амино-6-деокси-1-тио- -D-галактопиранозид; 6-(5-холестен-3 -илокси)гексил-6-амино-6-деоксил-1-тио- -D-маннопиранозид; 12-(((7'-диэтиламинокумарин-3-ил)карбонил)метиламино)-октадекановая кислота; N-[12-(((7'-диэтиламинокумарин-3-ил)карбонил)метиламино)октадеканоил]-2-аминопальмитиновая кислота; N-сукцинил-диолеилфосфатидилэтаноламин; 1-гексадецил-2-пальмитоилглицерофосфоэтаноламин; пальмитоилгомоцистеин; алкиламмониевые соли, содержащие по меньшей мере одну (C₁₀-C₂₀ ), предпочтительно (C₁₄-C ₁₈)-алкильную цепь, такие как, например, стеариламмонийхлорид, гексадециламмонийхлорид, диметилдиоктадециламмонийбромид (DDAB), гексадецилтриметиламмонийбромид (CTAB); соли третичного или четвертичного аммония, содержащие один или предпочтительно два (C ₁₀-C₂₀)-, предпочтительно (C ₁₄-C₁₈)-остатка ацилового сложного эфира, такие как, например, 1,2-дистеароил-3-триметиламмонийпропан (DSTAP), 1,2-дипальмитоил-3-триметиламмонийпропан (DPTAP), 1,2-олеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP), 1,2-дистеароил-3-диметиламмонийпропан (DSDAP) и их смеси или комбинации.

Небольшие количества жирных кислот и лизоформ фосфолипидов могут также образовываться как продукты разложения исходных фосфолипидных продуктов, например, вследствие нагрева эмульсии.

Предпочтительными дополнительными стабилизирующими оболочку амфифильными материалами являются также соединения, которые содержат один или два жирнокислотных остатка в своей молекуле, в частности одну или две линейные (C ₁₀-C₂₀)-ацильные, предпочтительно (C₁₄-C₁₈)-ацильные цепи, такие как, например, вышеперечисленные жирные кислоты, их соответствующие соли и производные.

Особенно предпочтительными дополнительными стабилизирующими оболочку амфифильными материалами являются также соединения, способные дать суммарный ненулевой заряд стабилизирующей оболочке, т.е. соединения, несущие суммарный положительный или отрицательный заряд. Примерами подходящих положительно или отрицательно заряженных соединений являются, например, лизофосфолипиды, т.е. лизоформы вышеуказанных фосфолипидов, такие как производные лизофосфатидилсерина (например, лизо-DMPS, -DPPS или -DSPS), производные лизофосфатидной кислоты (например, лизо-DMPA, -DPPA или -DSPA) и производные лизофосфатидилглицерина (например, лизо-DMPG, -DPPG или -DSPG); соли желчных кислот, такие как соли холевой кислоты, соли деоксихолевой кислоты или соли гликохолевой кислоты; соли (C₁₂-C₂₄)-, предпочтительно (C₁₄-C₂₂ )-жирных кислот, такие как, например, соль пальмитиновой кислоты, соль стеариновой кислоты, соль 1,2-дипальмитоил-sn-3-сукцинилглицерина или соль 1,3-дипальмитоил-2-сукцинилглицерина; соли алкиламмония с галогеновым противоионом (например, хлором или бромом), содержащие по меньшей мере одну (C₁₀-C ₂₀)-алкильную цепь, предпочтительно (C₁₄ -C₁₈)-алкильную цепь, такие как, например, стеариламмонийхлорид, гексадециламмонийхлорид, диметилдиоктадециламмонийбромид (DDAB), гексадецилтриметиламмонийбромид (CTAB); соли третичного или четвертичного аммония с галогеновым противоионом (например, хлором или бромом), содержащие одну или предпочтительно две (C ₁₀-C₂₀)-ацильные цепи, предпочтительно (C₁₄-C₁₈)-остаток ацилового эфира, такие как, например, 1,2-дистеароил-3-триметиламмонийпропан (DSTAP), 1,2-дипальмитоил-3-триметиламмонийпропан (DPTAP), 1,2-олеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP), 1,2-дистеароил-3-диметиламмонийпропан (DSDAP).

Если желательно получить ультразвуковые контрастные вещества-"мишени", т.е. контрастные вещества, содержащие микропузырьки, которые могут избирательно присоединяться к конкретному месту после приема in vitro или in vivo, согласно способу настоящего изобретения возможно также исходить непосредственно из фосфолипида, по меньшей мере часть которого была модифицирована введением выбранного соответствующим образом нацеливающего лиганда, или, альтернативно и предпочтительно, исходя из фосфолипида, по меньшей мере часть которого содержит реакционноспособную группу, возможно защищенную, способную на более поздней стадии связываться с соответствующим образом выбранным нацеливающим лигандом, содержащим дополнительную реакционноспособную функциональную группу, (например, связь авидин-биотин).

Таким образом, в этом конкретном контексте подразумевается, что термин "фосфолипид" охватывает как модифицированные, так и немодифицированные фосфолипиды, таким образом, включая фосфолипиды, модифицированные путем связывания нацеливающего лиганда или защитной реакционноспособной группы с амфифильной молекулой фосфолипида.

Термин "нацеливающий лиганд" охватывает своим значением любое соединение, участок или остаток, имеющий направленную активность микропузырьков согласно изобретению или способный направить эту активность к любому биологическому или патологическому месту в живом организме. Материалы или вещества, которые могут служить нацеливающими лигандами, включают, например, но без ограничений, белки, в том числе антитела, фрагменты антител, рецепторные молекулы, молекулы, связывающиеся с рецепторами, гликопротеины и лектины; пептиды, в том числе олигопептиды и полипептиды; пептидомиметики; сахариды, в том числе моно- и полисахариды; витамины; стероиды, аналоги стероидов, гормоны, кофакторы, биологически активные вещества и генетический материал, в том числе нуклеозиды, нуклеотиды и полинуклеотиды. Мишени, с которыми могут ассоциироваться нацеливающие лиганды, включают ткани, такие как, например, ткани миокарда (в том числе миокардиальные клетки и кардиомицеты), мембранные ткани (в том числе эндотелий и эпителий), пластинки, соединительные ткани (в том числе интерстиций) или опухоли; кровяные сгустки; и рецепторы, такие как, например, рецепторы клеточной поверхности для пептидных гормонов, нейромедиаторы, антигены, фрагменты комплемента и рецепторы иммуноглобулина и цитоплазматические рецепторы для стероидных гормонов.

Примеры подходящих мишеней и нацеливающих лигандов раскрыты, например, в патенте США № 6139819, который введен здесь ссылкой.

В одном предпочтительном варианте исполнения нацеливающие лиганды могут быть присоединены к амфифильным молекулам, образуя стабилизирующую оболочку путем ковалентной связи.

В таком случае конкретный реакционноспособный компонент, который должен присутствовать в фосфолипиде или липидной молекуле, когда желают получить целевую амфифильную молекулу, будет зависеть от конкретного нацеливающего лиганда, который должен к ней присоединяться. Для примера, если нацеливающий лиганд может быть присоединен к амфифильной молекуле через аминогруппу, подходящими реакционноспособными компонентами для амфифильной молекулы могут быть изотиоцианатные группы (которые будут образовывать тиомочевинную связь), реакционноспособные сложные эфиры (для образования амидной связи), альдегидные группы (для образование иминовой связи, которая будет восстановлена в алкиламиновую связь) и т.д.; если нацеливающий лиганд может быть присоединен к амфифильной молекуле через тиоловую группу, подходящие дополняющие реакционноспособные компоненты амфифильной молекулы включают галоацетильные производные или малеимиды (для образования тиоэфирной связи); и если нацеливающий лиганд может быть присоединен к амфифильной молекуле через карбоксильную группу, подходящими реакционноспособными компонентами амфифильной молекулы могли бы быть амины и гидразиды (для образования амидных или алкидамидных связей). Реакционноспособные компоненты могут быть присоединены либо напрямую к фосфолипидной молекуле, либо к модифицирующему компоненту (например, ПЭГ), соединенному с фосфолипидом.

Как указано выше, в предпочтительном варианте исполнения, когда желательно контрастное вещество, содержащее микропузырьки-мишени, по меньшей мере часть исходного фосфолипида будет содержать подходящий реакционноспособный компонент, и нацеливающий лиганд, содержащий дополняющую функциональность, будет соединен с ней либо на любой стадии до лиофилизации, путем добавления нацеливаюшего лиганда, содержащего дополнительную функциональность, в фазу, содержащую функционализированные фосфолипиды/липиды, либо перед, во время или после образования эмульсии или непосредственно перед этапом восстановления. В этом последнем случае было бы возможным полностью использовать гибкость системы, так как микропузырьки, содержащие по меньшей мере часть пленкообразующих фосфолипидов или ассоциированных липидов, соответствующим образом функционализованных, могли бы затем быть соединены с любым желательным нацеливающим лигандом, разделяя эту реакционноспособную дополнительную группу.

Однако нет необходимости, чтобы нацеливающий лиганд соединялся с амфифильными молекулами ковалентной связью. Нацеливающие лиганды могут также быть соответствующим образом связаны с микропузырьками путем взаимодействий физического и/или электростатического типа. Для примера, функциональный компонент, имеющий высокое сродство и селективность к дополняющему компоненту, может быть введен в молекулу фосфолипида, а дополняющий компонент будет присоединен к нацеливающему лиганду. Например, компонент авидин (или стрептавидин), имеющий высокое сродство к биотину, может быть ковалентно связан с фосфолипидом, стабилизирующим микропузырьки, а дополняющий биотиновый компонент может быть введен в подходящий нацеливающий лиганд, например пептид или антитело. Меченный биотином нацеливающий лиганд будет, таким образом, ассоциирован с меченным авидином микропузырьком посредством связующей системы авидин-биотин. Согласно альтернативному варианту осуществления, биотин-содержащий фосфолипид может быть использован как соединение для образования стабилизирующей оболочки микропузырька; в таком случае биотин-содержащий фосфолипид, внедренный в стабилизирующую оболочку, реагирует сначала с авидином (или нейтравидином) и затем с биотин-содержащим лигандом. Примеры введения меток биотин/авидин в фосфолипиды и пептиды изложены также в цитированном выше документе US 6139819. Альтернативно, нацеливающий лиганд и амфифильная молекула могут ассоциироваться или соединяться путем взаимодействия Ван-дер-Ваальса, путем электростатических взаимодействий и путем других ассоциативных процессов.

Примерами подходящих конкретных мишеней, на которые могут быть направлены микропузырьки согласно изобретению, являются, например, фибрин, _{v 3}-рецептор или рецептор GPIIbIIIa на активированных тромбоцитах. Фибрин и тромбоциты фактически всегда присутствуют в "тромбах", т.е. сгустках, которые могут образовываться в кровотоке и вызывать закупорку сосудов. Подходящие связывающие пептиды раскрыты, например, в цитированном выше документе US 6139819. Другие связывающие пептиды, специфические для фибриновых мишеней, раскрыты, например, в международной патентной заявке WO 02/055544, которая введена здесь ссылкой.

Другие примеры важных мишеней включают рецепторы в чувствительных бляшках и тумор-специфические рецепторы, такие как участки домена киназы (KDR) и комплекс VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия)/KDR. Связывающие пептиды, подходящие для KDR или комплекса VEGF/KDR, раскрыты, например, в международных патентных заявках WO 03/74005 и WO 03/084574, обе введены здесь ссылкой.

Процесс

Стадия эмульгирования a) способа согласно настоящему изобретению может проводиться путем подвергания водной среды и основного растворителя в присутствии по меньшей мере одного фосфолипида любому подходящему методу создания эмульсии, известному в уровне техники, такому как, например, обработка ультразвуком, взбалтывание, гомогенизация при высоком давлении, микросмешение, мембранное эмульгирование, интенсивное перемешивание или смешение с высоким сдвигом, например, применяя роторно-статорный гомогенизатор. Например, применяется такой роторно-статорный гомогенизатор, как Polytrone^® PT3000. Скорость перемешивания роторно-статорного гомогенизатора может быть выбрана в зависимости от компонентов эмульсии, объема эмульсии и диаметра емкости, содержащей эмульсию, и желательного конечного диаметра микрокапель растворителя в эмульсии. Вообще, было найдено, что при применении роторно-статорного гомогенизатора, имеющего насадку диаметром примерно 3 см, погруженную в 50-80 мл смеси, содержащейся в лабораторном стакане диаметром 3,5-5 см, обычно достаточна скорость перемешивания примерно 8000 об/мин для получения микрокапель, имеющих значительно сниженный среднечисленный диаметр, чтобы получить после лиофилизации и восстановления лиофилизованной матрицы наполненные газом микропузырьки с диаметром менее примерно 1,8 мкм. Путем увеличения скорости перемешивания до примерно 12000 об/мин обычно можно получить наполненные газом микропузырьки со среднечисленным диаметром менее примерно 1,5 мкм, тогда как при скорости перемешивания примерно 14000-15000 об/мин могут быть, как правило, получены наполненные газом микропузырьки со среднечисленным диаметром примерно 1,0 мкм или меньше. Было обнаружено, что обычно при увеличении скорости перемешивания выше примерно 18000 об/мин получается незначительное дальнейшее снижение размера микропузырьков.

Альтернативно, для эмульгирования смеси может также применяться техника микросмешения. Как известно, ммикросмеситель обычно содержит по меньшей мере два входных отверстия и по меньшей мере одно выходное отверстие. Таким образом, органический растворитель вводят в смеситель через первое входное отверстие (со скоростью подачи, например, 0,05-5 мл/мин), а водную фазу вводят через второе входное отверстие (например, со скоростью подачи 2-100 мл/мин). Затем выходное отверстие микросмесителя соединяют с сосудом, содержащим водную фазу, так что водная фаза, удаленная из указанного сосуда в следующие моменты времени и введенная в микросмеситель, содержит повышенное количество эмульгированного растворителя. Когда будет добавлен весь объем растворителя, эмульсию из контейнера можно держать в условиях рециркуляции в микросмесителе в течение дальнейшего, заранее определенного периода времени, например, 5-120 минут, для завершения образования эмульсии.

В зависимости от техники эмульгирования органический растворитель можно вводить постепенно в течение стадии эмульгирования или целиком перед началом стадии эмульгирования. Альтернативно водную среду можно добавлять постепенно в не смешиваемый с водой растворитель на стадии эмульгирования или целиком перед началом стадии эмульгирования. Предпочтительно, фосфолипид диспергируют в водной среде до того, как этот последний будет смешан с органическим растворителем. Альтернативно, фосфолипид может быть диспергирован в органическом растворителе или его можно добавлять отдельно в водно-органическую смесь перед или во время стадии эмульгирования.

Эмульгирование стадии a) обычно проводится при комнатной температуре, например при температуре 22±5°C, или при более высоких температурах, например 50-60°C (например, в случае основного растворителя с высокими точками кипения), или при более низких температурах, например 0-10°C (например, в случае основного растворителя с точкой кипения, близкой к комнатной температуре). Температуру предпочтительно удерживают ниже температуры кипения органического растворителя, предпочтительно по меньшей мере на 5°C ниже указанной температуры, более предпочтительно по меньшей мере на 10°C ниже. Поскольку длительное воздействие на смесь высоких температур (например, 90°C или более) может вызвать возможную деградацию фосфолипидов с последующим образованием соответствующих лизо-производных, обычно предпочтительно избегать такого продолжительного нагрева при высоких температурах.

При необходимости водную среду, содержащую фосфолипиды, можно подвергать регулируемому нагреву, чтобы облегчить ее диспергирование. Например, фосфолипид, содержащий водную суспензию, можно нагревать при примерно 60-70°C в течение примерно 15 минут и затем оставлять охлаждаться до температуры, при которой затем проводят стадию эмульгирования.

Как упоминалось ранее, в эмульгирующую смесь, содержащую фосфолипид, также могут быть введены дополнительные амфифильные материалы, такие как перечисленные ранее. Количество указанных дополнительных амфифильных соединений предпочтительно не выше, чем примерно 50 вес.% от полного веса амфифильного материала, более предпочтительно не выше 20 вес.% и вплоть до количества, например, примерно в 0,1%.

При желании водная среда может содержать, кроме того, один или более наполнителей.

Используемый здесь термин "наполнитель" относится к любой добавке, пригодной в настоящем изобретении, такой как добавки, применяемые для увеличения стабильности эмульсии или промежуточного лиофилизата и/или чтобы получить фармацевтически приемлемые и стабильные конечные композиции.

Типичными наполнителями в этом отношении являются, например, усилители вязкости и/или улучшители растворимости для фосфолипидов.

Усилителями вязкости и улучшителями растворимости, которые могут подходящим образом применяться, являются, например, моно- или полисахариды, такие как глюкоза, лактоза, сахароза и декстраны, алифатические спирты, такие как изопропиловый спирт и бутиловый спирт, полиолы, такие как глицерин, 1,2-пропандиол, и подобные агенты. Однако, вообще говоря, заявители нашли, что вводить такие добавки, как усилители вязкости, обычно применяемые во многих существующих композициях контрастных веществ, в контрастные вещества согласно настоящему изобретению нет необходимости. Это представляет собой следующее преимущество настоящего изобретения, так как число компонентов, устанавливаемых для тела объекта, сохраняется минимальным, и вязкость контрастных веществ поддерживается как можно более низкой.

Как отмечалось ранее, заявитель нашел по существу ненужным добавлять в эмульгирующую смесь водонерастворимые структурообразователи, такие как холестерин. Собственного говоря, было найдено, что количество холестерина в 0,05% (вес./вес. от полного веса эмульгирующей смеси) заметно снижает степень превращения микрокапель в наполненные газом микровезикулы, приводя далее к широкой дисперсии размеров везикул. Таким образом, количество водонерастворимых соединений в эмульгирующей смеси, в частности соединений, не содержащих один или два жирнокислотных остатка в своей структуре, предпочтительно меньше, чем 0,050%, более предпочтительно меньше, чем примерно 0,030 вес.% от полного веса эмульсии.

Эмульсии, произведенные согласно стадии a), могут преимущественно подвергаться одной или более стадиям промывки до лиофилизации на стадии b), чтобы удалить избыток фосфолипидов в водной фазе (не соединенных с эмульсией) и отделить и удалить возможные добавки, такие как усилители вязкости и улучшители растворимости, а также нежелательный материал, такой как коллоидные частицы и нежелательные и/или с завышенным размером капли эмульсии. Такая промывка может быть проведена известным самим по себе способом, причем эмульсию разделяют, используя такие методы, как декантация, флотация, центрифугирование, фильтрация в поперечном потоке и тому подобное.

Если предусмотрена стадия промывки, и если лиопротективный агент присутствовал в первоначальной водной фазе до образования эмульсии, указанные стадии промывки могут быть осуществлены в водных растворах, содержащих один или более лиопротективных агента, чтобы заменить количество лиопротективных агентов, частично удаленных во время промывания. С другой стороны, если лиопротектора в эмульгированной водно-органической смеси не было, образованная эмульсия может быть промыта водным раствором, содержащим лиопротектор, чтобы ввести лиопротектор в эмульгированную смесь, или альтернативно лиопротектор может быть добавлен после стадий промывки, до лиофилизации.

При желании эмульсию (либо как есть, либо после стадии промывки) можно подвергнуть стадии ультрафильтрации или микрофильтрации перед лиофилизацией, чтобы еще снизить количество микропузырьков большого размера в конечной восстановленной суспензии. При микрофильтрации, например, с фильтром 5 мкм или 3 мкм микрокапли большого размера фактически удерживаются на фильтре и отделяются от остальных микрокапель малого размера, предотвращая тем самым образование микропузырьков большого размера при восстановлении лиофилизованного материала. Микрофильтрация может быть осуществлена обычными методами, такими как положительная фильтрация, вакуумная фильтрация или инлайновая фильтрация. Фильтрационными мембранами могут быть мембраны из нейлона, стекловолокна, целлюлозы, бумаги, поликарбоната или полиэфира (Nuclepore^®).

Согласно альтернативному варианту осуществления, дополнительное амфифильное соединение может быть добавлено после образования эмульсии согласно вышеуказанной доктрине, без стадий промывки или с ними. В частности, чтобы добавить указанное соединение к стабилизирующей оболочке, водную суспензию желательного соединения добавляют в образованную эмульсию предпочтительно при перемешивании и нагреве (предпочтительно при менее 80°C, например 40-80°C, в частности 50-70°C). Этот альтернативный вариант осуществления особенно подходит для последующего введения в стабилизирующий слой амфифильных соединений, которые в противном случае могут отрицательно повлиять на свойства конечного продукта, если их вводить в начальную смесь эмульсии. Примерами амфифильных соединений, которые могут быть легко введены в таком случае как дополнительные компоненты стабилизирующей оболочки после приготовления начальной эмульсии, являются, например, ПЭГ-модифицированные фосфолипиды, в частности ПЭГ-модифицированные фосфатидилэтаноламины, такие как DMPE-ПЭГ750, DMPE-ПЭГ1000, DMPE-ПЭГ2000, DMPE-ПЭГ3000, DMPE-ПЭГ4000, DMPE-ПЭГ5000, DPPE-ПЭГ750, DPPE-ПЭГ1000, DPPE-ПЭГ2000, DPPE-ПЭГ3000, DPPE-ПЭГ4000, DPPE-ПЭГ5000, DSPE-ПЭГ750, DSPE-ПЭГ1000, DSPE-ПЭГ2000, DSPE-ПЭГ3000, DSPE-ПЭГ4000, DSPE-ПЭГ5000, DAPE-ПЭГ750, DAPE-ПЭГ1000, DAPE-ПЭГ2000, DAPE-ПЭГ3000, DAPE-ПЭГ4000 или DAPE-ПЭГ5000. Аналогично, затем согласно этому способу могут быть обычно введены также ПЭГ-модифицированные фосфолипиды, несущие реакционноспособные компоненты или нацеливающие лиганды (например, содержащие биотин, малеимид или малеимид-пептид). Кроме того, этот метод также может быть использован для позднейшего добавления в композицию стабилизирующего слоя других компонентов, таких как липопептиды или полимерные ПАВы. Примерами полимерных ПАВов, которые могут обычно быть введены после образования эмульсии, являются, например, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, такие как плюроник F68, плюроник F108, плюроник F-127 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); полиоксиэтилированные простые алкиловые эфиры, такие как Brij^® 78 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); полиоксиэтилированные сложные эфиры жирных кислот, такие как Myrj^® 53 или Myrj^® 59 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты, такие как Tween^® 60 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); или полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир, такой как Triton^® X-100 (Sigma Aldrich, Missouri, USA).

Фактически заявитель обнаружил, что применение смеси, содержащей ограниченное количество (например, менее 10 вес.%) ПЭГ-модифицированного фосфолипида (например, DSPE-ПЭГ или DPPE-ПЭГ) вместе с пленкообразующим фосфолипидом (например, DPPS или смесью DAPC/DPPS 50:50) для получения эмульсии согласно способу изобретения, может вызвать существенное расширение распределения конечного продукта по размерам по сравнению с распределением по размерам микропузырьков, полученных из эмульсии, содержащей только пленкообразующий фосфолипид. С другой стороны, если сначала готовили эмульсию, содержащую только пленкообразующий фосфолипид, а затем в полученную эмульсию добавляли водную суспензию ПЭГ-модифицированного фосфолипида (например, при перемешивании в течении 1 часа, при температуре примерно 60°C), было обнаружено, что в стабилизирующую оболочку может быть введено достаточно высокое количество (типично более 30 вес.%) ПЭГ-модифицированного фосфолипида без существенного влияния на распределение конечного продукта по размерам.

Согласно предпочтительному варианту исполнения, перед стадией лиофилизации эмульсию подвергают обработке регулируемым дополнительным нагревом. Дополнительный нагрев эмульсии предпочтительно проводят в герметично закрытом контейнере. Тепловая обработка может длиться от примерно 15 минут до примерно 90 минут при температурах, составляющих от примерно 60°C до примерно 125°C, предпочтительно от примерно 80°C до примерно 120°C. Вообще, чем выше температура, тем короче время тепловой обработки. Во время нагрева эмульсию можно при желании продолжать перемешивать.

Как обнаружил заявитель, хотя эта дополнительная тепловая обработка может привести к частичной деградации фосфолипидов (например, с содержанием примерно 5-20% вес./вес. лизолипидов в конечном продукте, когда эмульсию нагревают до примерно 100-120°C в течение примерно 30 мин), тем не менее ее большим преимуществом является возможность существенного сужения распределения по размерам и увеличения полного числа микропузырьков в конечной суспензии, независимо от рабочих условий на начальной стадии эмульгирования (например, тип органического растворителя, метод эмульгирования, возможные стадии промывки и т.д.).

Термически обработанную эмульсию можно затем подвергать лиофилизации, обычно без необходимости дальнейших стадий промывки.

Лиофилизация эмульсии согласно стадии b) может быть проведена путем первоначального замораживания эмульсии с последующей лиофилизацией замороженной эмульсии широко известными сами по себе способами и устройствами. Поскольку высушенный лиофилизованный продукт будет в норме восстановлен до приема посредством добавления жидкости-носителя, эмульсию перед лиофилизацией можно с успехом наливать в запаивающиеся флаконы, с тем чтобы получить флаконы, каждый из которых содержит надлежащее количество, например однократную дозу, лиофилизованного сухого продукта для восстановления в пригодную для инъекций форму. Благодаря проведению лиофилизации эмульсии в индивидуальных флаконах, а не в массе, предотвращается обращение с деликатной ячеистой структурй лиофилизованного продукта и риск по меньшей мере частичной деградации этой структуры.

После лиофилизации вакуум из лиофилизатора может быть удален путем введения желательного газа для образования микропузырьков в конечной композиции контрастного вещества. Это позволит заполнить свободное пространство флакона желательным газом и затем герметично закрыть флакон подходящим укупорочным средством. Альтернативно, флакон можно оставлять под вакуумом и герметично закрывать, а газ добавлять на более поздней стадии, например, непосредственно перед приемом, например, когда газ является радиоактивным или гиперполяризованным.

Полученный таким путем лиофилизованный продукт в присутствии подходящего газа может сохраняться стабильным в течение нескольких месяцев перед тем, как быть восстановленным путем растворения в водной жидкости-носителе для получения суспензии наполненных газом микропузырьков.

Чтобы наполнить вышеуказанные микровезикулы, может применяться любой биосовместимый газ, прекурсор газа или их смесь, причем газ выбирают в зависимости от выбранного метода воздействия.

Газ может содержать, например, воздух, азот, кислород, двуокись углерода, водород, закись азота, благородный или инертный газ, такой как гелий, аргон, ксенон или криптон, радиоактивный газ, такой как ¹³³Xe или ⁸¹Kr, гиперполяризованный благородный газ, такой как гиперполяризованный гелий, гиперполяризованный ксенон или гиперполяризованный неон, низкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 атомов углерода), например алкан, такой как метан, этан, пропан, бутан, изобутан, пентан или изопентан; циклоалкан, такой как циклобутан или циклопентан; алкен, такой как пропен, бутен или изобутен; или алкин, такой как ацетилен; простой эфир; кетон; сложный эфир; галогенированные газы, предпочтительно фторированные газы, такие как галогенированные, фторированные или перфторированные низкомолекулярные углеводороды (например, содержащие до 7 атомов углерода); или смесь любого из вышеупомянутого. Если используется галогенированный углеводород, то предпочтительно по меньшей мере несколько, более предпочтительно все атомы галогена в указанном соединении являются атомами фтора.

Предпочтительны фторированные газы, в частности перфторированные газы, особенно в области ультразвуковой визуализации. Фторированные газы включают материалы, которые содержат по меньшей мере один атом фтора, такие как, например, фторированные углеводороды (органические соединения, содержащие один или более атомов углерода и фтора); гексафторид серы; фторированные, предпочтительно перфторированные, кетоны, такие как перфторацетон; и фторированные, предпочтительно перфторированные, простые эфиры, такие как перфтордиэтиловый эфир. Предпочтительными соединениями являются перфторированные газы, такие как SF₆ или перфторуглероды (перфторированные углеводороды), т.е. углеводороды, в которых все атомы водорода замещены атомами фтора, которые, как известно, образуют особенно стабильные микропузырьковые суспензии, как раскрыто, например, в документе EP 0554 213, который введен здесь ссылкой.

Термин перфторуглерод включает насыщенные, ненасыщенные и циклические перфторуглероды. Примерами биосовместимых, физиологически приемлемых перфторуглеродов являются: перфторалканы, такие как перфторметан, перфторэтан, перфторпропаны, перфторбутаны (например, перфтор-н-бутан, возможно в смеси с другими изомерами, такими как перфторизобутан), перфторпентаны, перфторгексаны или перфторгептаны; перфторалкены, такие как перфторпропены, перфторбутены (например, перфторбут-2-ен) или перфторбутадиен; перфторалкины (например, перфторбут-2-ин) и перфторциклоалканы (например, перфторциклобутан, перфторметилциклобутан, перфтордиметилциклобутаны, перфтортриметилциклобутаны, перфторциклопентан, перфторметилциклопентан, перфтордиметилциклопентаны, перфторциклогексан, перфторметилциклогексан и перфторциклогептан). Предпочтительные насыщенные перфторуглероды имеют формулу C _nF_n+2, где n меняется от 1 до 12, предпочтительно от 2 до 10, наиболее предпочтительно от 3 до 8, еще более предпочтительно от 3 до 6. Подходящие перфторуглероды включают, например, CF₄, C ₂F₆, C₃F ₈, C₄F₈, C ₄F₁₀, C₅F ₁₂, C₆F₁₂, C₆F₁₄, C ₇F₁₄, C₇F ₁₆, C₈F₁₈ и C₉F₂₀.

Особенно предпочтительными газами являются SF₆ или перфторуглероды, выбранные из CF₄, C ₂F₆, C₃F ₈, C₄F₈, C ₄F₁₀ или их смесей; особенно предпочтительны SF₆, C₃F ₈ или C₄F₁₀ .

Также может быть выгодным использовать смесь любых из вышеуказанных газов в любом отношении. Например, смесь может содержать обычный газ, такой как азот, воздух или двуокись углерода, и газ, образующий стабильную микропузырьковую суспензию, такой как гексафторид серы или перфторуглерод, как указанный выше. Примеры подходящих газовых смесей могут быть найдены, например, в патенте WO 94/09829, который введен здесь ссылкой. Особенно предпочтительны следующие комбинации: смесь газов (A) и (B), в которых газ (B) является фторированным газом, предпочтительно выбранным из SF₆, CF₄ , C₂F₆, C ₃F₆, C₃F ₈, C₄F₆, C ₄F₈, C₄F ₁₀, C₅F₁₀, C₅F₁₂ или их смесей, а (A) выбран из воздуха, кислорода, азота, двуокиси углерода или их смесей. Количество газа (B) может составлять от примерно 0,5% до примерно 95% об./об. от полной смеси, предпочтительно от примерно 5% до 80%.

В некоторых случаях может быть желательным включать в газовую субстанцию прекурсор (т.е. материал, который способен превращаться в газ in vivo). Предпочтительно прекурсор газа и газ, произведенный из него, являются физиологически приемлемыми. Газовый прекурсор может быть pH-активируемым, фотоактивируемым, термоактивируемым и т.д. Например, определенные перфторуглероды могут использоваться как термоактивируемые прекурсоры газа. Эти перфтоуглероды, такие как перфторпентан или перфторгексан, имеют температуру фазового перехода жидкость/газ выше комнатной температуры (или температуры, при которой производятся и/или хранятся эти агенты), но ниже температуры тела; таким образом, они испытывают фазовый переход жидкость/газ и превращаются в газ внутри человеческого тела. Кроме того, термин "газ", как он используется здесь, включает смеси, находящиеся при нормальной температуре человеческого тела 37°C в паровой форме. В этом случае для получения смеси, которая при 37°C находится в паровой фазе, в смеси с другими газообразными соединениями также могут в ограниченных количествах использоваться соединения, которые при температуре 37°C являются жидкими.

Биосовместимые газ или газовая смесь для ультразвуковой эхографии предпочтительно выбраны из воздуха, азота, двуокиси углерода, гелия, криптона, ксенона, аргона, метана, галогенированных углеводородов (в том числе фторированных газов, таких как перфтоуглероды и гексафторид серы) или их смесей. С успехом могут использоваться перфтоуглероды (в частности, C ₄F₁₀ или C₃ F₈) или SF₆, возможно в смеси с воздухом или азотом.

Для применения в МР-томографии микропузырьки должны предпочтительно содержать гиперполяризованный благородный газ, такой как гиперполяризованный неон, гиперполяризованный гелий, гиперполяризованный ксенон или их смеси, возможно, в смеси с воздухом, CO₂, кислородом, азотом, гелием, ксеноном или любым из галогенированных углеводородов, какие определены выше.

Для применения в гамма-томографии микропузырьки согласно изобретению должны предпочтительно содержать радиоактивные газы, такие как ¹³³Xe или ⁸¹ Kr, или их смеси, возможно, в смеси с воздухом, CO ₂, кислородом, азотом, гелием, криптоном или любым из галогенированных углеводородов, какие определены выше.

Затем лиофилизованная композиция в контакте с газом может быть легко восстановлена путем добавления соответствующей стерильной водной пригодной для инъекций и физиологически приемлемой жидкости-носителя, такой как стерильная не содержащая пирогена вода для инъекций, водный раствор, такой как соляной раствор (который может преимущественно быть сбалансированным так, чтобы конечный продукт для инъекции не был гипотоничным), или водный раствор одной или более субстанций, регулирующих тонус, таких как соли (например, катионы плазмы с физиологически приемлемыми противоионами), или сахара, сахарные спирты, гликоли и другие неионные полиоловые материалы (например, глюкоза, сахароза, сорбит, маннитол, глицерин, полиэтиленгликоли, пропиленгликоли и им подобные), требующие лишь минимального перемешивания, такого, какое может, например, быть обеспечено легким ручным встряхиванием.

Как было обнаружено заявителем, полученные таким путем восстановленные микропузырьки имеют обычно среднечисленный диаметр, который немного меньше, чем среднечисленный диаметр, измеренный для микрокапель эмульсии. Среднечисленный диаметр микропузырьков обычно составляет от примерно 60% до примерно 90% от среднечисленного диаметра микрокапель эмульсии. В большинстве случаев наблюдался среднечисленный диаметр микропузырьков примерно 70-75% от среднечисленного диаметра микрокапель.

Если высушенный продукт содержится во флаконе, тот обычно герметически закрыт перегородкой, через которую может впрыскиваться жидкость-носитель, используя шприц, возможно, наполненный заранее; альтернативно высушенный продукт и жидкость-носитель могут подаваться вместе в двухкамерное устройство, такое как шприц с двумя отделениями. Может быть выгодным перемешивать или легко встряхивать продукт после восстановления. Однако, как отмечено выше, в стабилизированных контрастных веществах согласно изобретению размер микропузырьков газа может быть по существу независим от количества энергии смешения, прилагаемой для восстановления сухого продукта. Следовательно, для получения воспроизводимых продуктов с совместимым размером микропузырьков может потребоваться всего лишь легкое ручное встряхивания.

Микропузырьковые суспензии, образованные при восстановлении в воде или водном растворе, могут быть стабильны в течение по меньшей мере 12 часов, давая таким образом значительную гибкость в отношении времени, когда восстанавливать сухой продукт до инъекции.

Лиофлизованный остаток, за исключением случая, когда он содержит гиперполяризованный газ, который, как известно, требует специальных условий хранения, может храниться и транспортироваться без необходимости температурного контроля его среды, и, в частности, он может поставляться в больницы и врачам для приготовления на месте готовой к употреблению суспензии, не требуя от таких пользователей наличия специальных складов.

В таком случае он предпочтительно может поставляться в виде двухкомпонентного комплекта.

Указанный двухкомпонентный комплект может включать два отдельных контейнера или двухкамерный контейнер. В первом случае контейнер предпочтительно является обычным перегороженным перегородкой флаконом, причем флакон, содержащий лиофилизованный остаток со стадии b), герметично закрыт перегородкой, через которую может быть впрыснута жидкость-носитель с помощью шприца, возможно, наполненного заранее. В таком случае шприц, использованный как контейнер для второго компонента, применяется затем также для инъекции контрастного вещества. В последнем случае двухкамерный контейнер предпочтительно является шприцем с двумя отделениями, и, как только лиофилизат был восстановлен и затем соответствующим образом смешан или мягко встряхнут, контейнер может использоваться непосредственно для инъекции контрастного вещества. В обоих случаях обеспечиваются средства, направляющие энергию или позволяющие приложить достаточно энергии к содержимому контейнера для образования пузырьков. Однако, как отмечено выше, в стабилизованных контрастных веществах согласно изобретению размер газовых микропузырьков по существу не зависит от количества энергии смешения, приложенной к восстанавливаемому сухому продукту. Соответственно, обычно требуется не более чем мягкое ручного встряхивание, чтобы получить восстанавливаемые продукты с соответствующим размером микропузырьков.

Специалисты среднего уровня в данной области могут понять, что другие двухкамерные системы для восстановления, способные соединять сухой порошок с водным раствором стерильным способом, также находятся в границах настоящего изобретения. В таких системах особенно выгодно, если водная фаза может быть помещена между водонерастворимым газом и окружающей средой, чтобы увеличить срок хранения продукта. Если материал, необходимый для образования контрастного вещества, уже не присутствует в контейнере (например, нацеливающий лиганд, который должен быть связан с фосфолипидом при восстановлении), он может быть упакован с другими компонентами комплекта, предпочтительно в форме или контейнере, приспособленном для облегчения легкого соединения с другими компонентами набора.

Не требуется никаких особых контейнеров, флаконов или соединяющих систем; в настоящем изобретении могут использоваться обычные контейнеры, флаконы и переходные устройства. Единственным требованием является хорошая герметичность между пробкой и контейнером. Качество уплотнения, таким образом, становится вопросом первой важности; любое ухудшение целостности уплотнения может позволить нежелательным субстанциям попасть в пузырек. Кроме того, для обеспечения стерильности в случае продуктов, закупоренных при атмосферном или пониженном давлении, важно сохранение вакуума для обеспечения надежного и должного восстановления. Что касается пробки, она может быть соединением или многокомпонентной композицией на основе эластомера, такого как полиизобутиленовый или бутиловый каучук.

Контрастные вещества, получаемые по способу настоящего изобретения, могут применяться во многих методах диагностической визуализации, в том числе, в частности, для ультразвукового и магнитного резонанса. Возможные другие приложения диагностической визуализации включают гамма-томографию, световую визуализацию и рентгеновское исследование, в том числе рентгеноконтрастное исследование.

Их применение в диагностической ультразвуковой визуализации и в магнитно-резонансной томографии, например, в качестве чувствительных контрастных веществ и в качестве гиперполяризованных пузырьков газа составляет предпочтительные характеристики изобретения. В ультразвуковых приложениях могут применяться самые разные методы визуализации, например, включая фундаментальную и гармоническую двухмерную визуализацию, визуализацию в импульсном режиме или режиме инверсии фаз и доплеровскую визуализацию, основную и с обработкой гармонических сигналов; при желании можно применять трехмерные методы визуализации.

Ультразвуковые тесты in vivo на кроликах, собаках и свиньях показали, что контрастные вещества согласно изобретению могут увеличивать интенсивность сигнала обратного рассеяния от миокарда на 15-25 дБ после внутривенной инъекции дозы всего лишь до 0,001 мл/кг веса тела. Сигналы могут наблюдаться даже при меньших дозах при использовании более чувствительных методов, таких как цветное доплеровское картрирование или инверсии импульса. При этих малых дозах было найдено, что ослабление в наполненных кровью отделениях, таких как камер сердца, является достаточно низким, чтобы позволить визуализацию интересующих областей сердечно-сосудистой системы. Тесты показали также, что такие введенные внутривенно контрастные вещества распределены по всему пулу крови, усиливая тем самым эхогенность всех васкуляризированных тканей, и рециркулируют. Было также обнаружено, что они пригодны как усилители полного доплеровского сигнала и могут дополнительно быть полезны в ультразвуковой компьютерной томографии и в инициируемой физиологически визуализации или визуализации в прерывистом режиме.

Для ультразвуковых приложений, таких как эхокардиография, чтобы позволить свободное прохождение через легочную систему и достичь резонанса при предпочтительных частотах визуализации примерно 0,1-15 МГц, обычно применяются микропузырьки со средним размером 0,1-10 мкм, например 0,5-7 мкм. Как описано выше, контрастные вещества согласно изобретению могут быть получены с очень узким распределением по размерам в микропузырьковой дисперсии, в интервале, предпочтительном для эхокардиографии, тем самым заметно усиливая их эхогенность, а также их безопасность in vivo и придавая контрастным веществам особые преимущество в таких приложениях, как измерения давления крови, мониторинг кровотока и ультразвуковая томография.

В ультразвуковых приложениях контрастные вещества изобретения могут, например, приниматься в таких дозах, что количество впрыснутого фосфолипида лежит в интервале 0,1-200 мкг/кг веса тела, обычно 10-200 мкг/кг в отсутствие стадии промывки для эмульсии и 0,1-30 мкг/кг, если эмульсию до лиофилизации промывали. Следует принять во внимание, что применение таких низких уровней фосфолипида является существенным достоинством, так как минимизируются возможные токсичные побочные эффекты. Кроме того, низкие уровни фосфолипидов, присутствующих в эффективных дозах, могут позволить увеличение дозировки для увеличения времени наблюдения без вредных эффектов.

Согласно предпочтительному варианту исполнения изобретения, способ изобретения позволяет получить наполненные газом микропузырьки малого диаметра, имеющие чрезвычайно узкое распределение по размерам. Таким образом, выбирая соответствующим образом компоненты смеси и, в частности, количество энергии смешения, прилагаемой для эмульгирования водно-органической смеси, можно получить наполненные газом микропузырьки с желаемым среднечисленным диаметром и распределением по размерам.

В частности, применяя способ согласно настоящему изобретению, можно получить контрастные вещества, содержащие стабилизированные фосфолипидом газовые микропузырьки малого размера, отличающиеся относительно малыми средними размерами и в частности, подходящим узким и контролируемым распределением по размерам.

Как известно специалистам в данной области, размеры микро/наночастиц и их соответствующее распределение по размерам может характеризоваться рядом параметров, наиболее часто используются среднечисленный диаметр D_N, медианный диаметр числового распределения D_N50, среднеобъемный диаметр D_V и медианный диаметр объемного распределения D_V50. Если численные диаметры указывают среднечисленные размеры частиц, объемный диаметр дает информацию о том, как распределен полный объем частиц по популяции в целом. Так как присутствие очень малого количества частиц большого объема в популяции частиц в основном малого объема может вызвать сдвиг соответствующего значения D_V в сторону больших значений, иногда для оценки распределения популяции частиц значение D_V50 более удобно использовать. D_V50 является расчетной величиной, показывающей, что половина внутреннего объема частиц находится в частицах, имеющих диаметр ниже D_V50; это позволяет снизить влияние образованных случайно частиц большого объема при оценке распределения по размерам. Очевидно, монодисперные частицы имеют одинаковые значения D_N, D _N50, D_V и D_V50 . С другой стороны, расширение распределения частиц приводит к большей разнице между этими различными величинами при соответствующем изменении их соответствующих отношений (например, увеличение отношения D_V/D_N). Например, популяции частиц, содержащих главным образом малые частицы (например, частицы с диаметром около 2 мкм) с тем не менее малой процентной долей больших частиц (например, частицы с диаметром выше 8 мкм), имеют более высокие значения D _V или D_V50 по сравнению со значением D_N при соответственно более высоких отношениях D_V/D_N или D _V50/D_N.

Таким образом, способ настоящего изобретения оказался особенно подходящим для получения микропузырьков со среднечисленным диаметром (D _N) менее 1,70 мкм и медианным диаметром объемного распределения (D_V50) таким, что отношение D _V50/D_N составляет примерно 2,30 или меньше, предпочтительно менее 2,10. Предпочтительно указанное значение D_N составляет 1,60 мкм или меньше, более предпочтительно 1,50 мкм или меньше, намного более предпочтительно 1,30 мкм или меньше. Микропузырьки с более низкими значениями D_N, например примерно 1 мкм или даже ниже, например 0,85 мкм и до 0,80 мкм, могут легко быть получены способом согласно изобретению. Отношение D_V50/D _N предпочтительно составляет примерно 1,80 или меньше, более предпочтительно примерно 1,60 или меньше, намного более предпочтительно примерно 1,50 или меньше. Легко могут быть получены микропузырьки с более низкими значениями отношения D _V50/D_N, например 1,20, и даже ниже, например 1,05.

Кроме того, в суспензиях микропузырьков малого размера с узким распределением, получаемых согласно способу изобретения, было обнаружено, что количество микропузырьков с диаметром более 3 мкм (выраженное как процентная доля частиц от общего числа частиц), в частности для микропузырьков с D _N менее чем примерно 1,5 мкм и отношением D _V50/D_N менее примерно 2,00, обычно ниже, чем примерно 3% от полного числа микропузырьков в суспензии, предпочтительно ниже, чем примерно 2%, более предпочтительно ниже, чем примерно 1%. Концентрация микропузырьков в восстановленной суспензии обычно составляет по меньшей мере 1х10 ⁸ частиц на миллилитр, предпочтительно по меньшей мере 1x10⁹ частиц на миллилитр.

Вышеуказанные значения D_V50, D_N и число микропузырьков относятся к измерению, сделанному на счетчике Культера, аппарат Mark II, снабженному апертурой 30 мкм с диапазоном измерений от 0,7 до 20 мкм.

Эта особая категория контрастных веществ особенно ценна в ультразвуковом отображении, в частности, для техники визуализации, основанной на нелинейном рассеянии микропузырьков, как объясняется ниже.

Наиболее современные способы ультразвуковой контрастной визуализации используют нелинейные характеристики рассеяния ультразвуковых контрастных веществ. Из литературы (например, Eatock et al., Journal of the Acoustical Society of America, vol. 77(5), pp. 1692-1701, 1985) известно, что нелинейное рассеяние существенно только для микропузырьков, которые меньше, чем резонансный размер, или близки к нему. В частности, обычно могут применяться микропузырьки с размерами половины резонансного размера. "Половина резонансного размера" является размером микропузырька с резонансной частотой, равной удвоенной центральной частоте проходящей ультразвуковой волны (которая для конкретных приложений может составлять до примерно 60 МГц). При получении изображения объема, содержащего ультразвуковое контрастное вещество на основе микропузырьков, обнаружительная способность эхосигналов микропузырька от эхосигналов ткани усиливается путем повышения уровня нелинейного рассеяния микропузырьками и снижается при ослаблении, вызванном микропузырьками, находящимися между зондом и интересующей областью. Ослабление вдоль пути передачи уменьшает ультразвуковую энергию, доступную для генерации нелинейного отклика на пузырек; ослабление вдоль пути приема уменьшает эхо-энергию, способную достичь ультразвуковой зонд. В случае суспензии, содержащей пузырьки с широким диапазоном размеров, микропузырьки при резонансном размере и больше, чем резонансный размер, вносят вклад в основном в приемопередающее ослабление, не внося большого вклада в нелинейные эхосигналы. Следовательно, полный акустический отклик на нелинейную визуализацию сильно выигрывает от использования калиброванного множества микропузырьков, имеющих узкое распределение по размерам и средний размер, близкий к половине резонансного размера. Предпочтительно применяются микропузырьковые препараты с распределение по размерам, соответствующим отношению D_V50/D_N примерно 2,30 или меньше, более предпочтительно 2,10 или меньше и намного более предпочтительно 2,00 или меньше. Предпочтительно средний размер применяемых микропузырьков отличается от половины резонансного размера не более чем примерно на ±10%, более предпочтительно не более чем на примерно ±5%.

Еще один дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу диагностической интроскопии, который включает прием объектом усиливающего контрастность количества контрастного вещества, содержащего наполненные газом микропузырьки с определенными выше размером и распределением по размерам, и получение изображения по меньшей мере части указанного объекта. В частности, указанная диагностическая визуализация включает облучение ультразвуком указанного объекта с помощью ультразвукового устройства, генерируя ультразвуковые волны с заранее определенной частотой пропускания, которая определяет соответствующий резонансный размер микропузырьков, и прием контрастного вещества, содержащего наполненные газом микропузырьки с узким распределением по размерам и средним размером, близким к половине резонансного размера. Предпочтительно узкое распределение по размерам и средний размер микропузырьков являются такими, как определено выше. Например, в методе диагностической интроскопии может использоваться ультразвуковая машина HDI 5000 производства Philips (например, в режиме импульсной инверсии, с зондом L7-4 и механическим индексом 0,07). Согласно этому методу, указанный объект является позвоночным, и указанное контрастное вещество вводится в сосудистую систему или в полость тела указанного позвоночного. Указанное контрастное вещество может поставляться как комплект, такой как описанные ранее, содержащий лиофилизованный продукт в контакте с газом и водной средой для восстановления.

Следующие неограничивающие примеры даны для лучшей иллюстрации изобретения.

ПРИМЕРЫ

В следующих примерах были использованы следующие материалы.

ФОСФОЛИПИДЫ:

DPPS	дипальмитоилфосфатидилсерин (Genzyme) IUPAC: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин
DPPG	натриевая соль дипальмитоилфосфатидилглицерина (Genzyme) IUPAC: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-[фосфо-рац-(1-глицерин)]
DSPA	натриевая соль дистеароилфосфатидной кислоты (Genzyme) IUPAC: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфат
DSPG	натриевая соль дистеароилфосфатидилглицерина (Genzyme) IUPAC: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфосерин
DSPC	дистеароилфосфатидилхолин (Genzyme) IUPAC: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин
DSEPC	дистеароилэтилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids) IUPAC: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин
DAPC	диарахидоилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids) IUPAC: 1,2-диарахидоил-sn-глицеро-3-фосфохолин
DSTAP	1,2-дистеароил-3-триметиламмонийпропанхлорид (Avanti Polar Lipids)
DSPE-ПЭГ2000	дистеароилфосфатидилэтаноламин, модифицированный ПЭГ2000, натриевая соль (Nektar Therapeutics)
DSPE-ПЭГ5000	дистеароилфосфатидилэтаноламин, модифицированный ПЭГ5000, натриевая соль (Nektar Therapeutics)
DSPE-ПЭГ2000-малеимид	дистеароилфосфатидилэтаноламин, модифицированный ПЭГ2000-малеимидом (Avanti Polar Lipids)
SATA	N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (Pierce)
КПВ-4С	H-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-NH 2 (AnaSpec Inc.)

РАСТВОРИТЕЛИ:

Перфтор-н-гексан (C₆F ₁₄), Fluka

Перфторметилциклогексан (CF ₃-цикло-C₆F₁₁ ), Fluka

Перфтор-н-гептан (C₇F ₁₆), Fluka

Перфтор-н-нонан (C₉ F₂₀), Aldrich

Перфтордекалин, Aldrich

Циклогексан, Fluka

Циклооктан, Fluka

н-Декан, Fluka

н-Октан, Fluka

Метаксилен, Fluka

Диизопропилкетон, Fluka

CCl₄, Fluka

ЛИОПРОТЕКТОРЫ:

Манноза, Fluka

Глюкоза, Fluka

Сорбит, Fluka

Маннитол, Fluka

Мальтоза, Fluka

Декстран 6000, Fluka

Декстран 15000, Fluka

Декстран 40000, Fluka

Инулин, Fluka

ХАРАКТЕРИЗОВАНИЕ МИКРОКАПЕЛЬ И МИКРОПУЗЫРЬКОВ

Распределение по размерам микрокапель эмульсии было определено:

a) с помощью счетчика Культера (аппарат Counter Mark II, снабженного апертурой 30 мкм с диапазоном измерения от 0,7 до 20 мкм), когда эмульсию подвергали стадии промывки; 10 мкл эмульсии разбавляли в 100 мл соляного раствора при комнатной температуре и оставляли уравновешиваться на 3 минуты до измерения;

b) с помощью анализатора размеров частиц лазерным светорассеянием (Malvern Mastersizer, разбавление 200x, фокусное расстояние 45 мм, стандартные характеристики), если эмульсию не подвергали стадии промывки.

Распределение по размерам, объемные концентрации и число микропузырьков (после лиофилизации и восстановления в водной фазе) определяли, используя аппарат Coulter Counter Mark II, снабженный апертурой 30 мкм с диапазоном измерений от 0,7 до 20 мкм; 50 мкл образцов микропузырьков разбавляли в 100 мл соляного раствора при комнатной температуре и оставляли уравновешиваться на 3 минуты перед измерением.

Количество фосфолипидов в конечных препаратах (эмульсия микропузырьковой суспензии) было определено ВЭЖХ-МС анализом со следующими параметрами: хроматограф Agilent 1100 LC, колонка MN CC 125/2 мм-5 C8 от Maherey Nagel, детектор Agilent MSD G1946D.

ЛИОФИЛИЗАЦИЯ

Методология и аппаратура для лиофилизации были следующими. Эмульсию (возможно, после стадии промывки, если она есть) сначала замораживают при -45°C на 5 минут и затем сушат сублимацией (лиофилизируют) при комнатной температуре и давлении 0,2 мбар, используя сублимационную установку Christ-Alpha 2-4.

ПРИМЕР 1 (ПРЕПАРАТЫ 1а-1n)

10 мг DPPS добавляют к примерно 10 мл 10%-ного (вес./вес.) водного раствора маннитола; суспензию нагревают при 65°C в течение 15 минут и затем охлаждают при комнатной температуре (22°C). В эту водную фазу добавляют перфторгептан (8% об./об.) и эмульгируют в лабораторном стакане диаметром примерно 4 см, используя высокоскоростной гомогенизатор (Polytron T3000, диаметр насадки 3 см) в течение 1 минуты при скорости, указанной в таблице 1. Полученные в результате медианный диаметр объемного распределения (D_V50) и среднечисленный диаметр (D_N) микрокапель эмульсии показаны в таблице 1. Затем эмульсию центрифугируют (800-1200 об/мин в течение 10 минут, центрифуга Sigma 3K10), чтобы устранить избыток фосфолипида, и отделенные гранулы (микрокапли) выделяют и снова суспендируют в том же начальном объеме 10%-ного водного раствора маннитола.

Затем промытую эмульсию собирают в 100-миллилитровый баллон для лиофилизации, замораживают и затем сушат сублимацией согласно вышеуказанной стандартной процедуре. Затем лиофилизат выставляют в атмосферу, содержащую 35% перфтор-н-бутана и 65% азота, и затем диспергируют в объеме воды, вдвое большем, чем первоначальный, путем легкого ручного встряхивания. Микропузырьковую суспензию, полученную после восстановления с дистиллированной водой, анализируют, используя счетчик Культера. Концентрация микропузырьков в полученных суспензиях была примерно 1x10 ⁹ частиц на 1 мл. Соответствующие медианный диаметр объемного распределения микропузырьков (D_V50), среднеобъемный диаметр (D_V), среднечисленный диаметр (D _N), количество микропузырьков с диаметром более 3 мкм (процент от общего числа микропузырьков) приведены в таблице 1. Если проводилось более одного примера при одной и той же скорости перемешивания, значения, указанные в таблице 1, относятся к рассчитанному усредненному значению каждого параметра.

Таблица 1
Пр.	Эмульсия			Наполненные газом микропузырьки
	Перемешивание (об/мин)	DV50 (мкм)	D N (мкм)	DV50 (мкм)	DV (мкм)	DN (мкм)	DV50/DN	>3 мкм (%)
1a	8000	4,58	1,77	2,92	3,33	1,51	1,93	5,44
1b	9000	4,66	1,94	3,19	3,45	1,53	2,08	6,61
1с	10000	3,04	1,74	2,16	2,53	1,33	1,62	1,88
1d	11000	3,05	1,80	2,17	3,33	1,32	1,65	1,55
1e	12000	2,84	1,69	1,86	2,17	1,24	1,50	0,93
1f	12500	2,79	1,68	1,75	2,05	1,22	1,44	0,65
1g	14000	2,20	1,52	1,39	2,45	1,08	1,29	0,23
1h	14500	2,00	1,38	1,19	1,39	1,01	1,19	0,06
1i	15000	1,88	1,39	1,22	2,20	1,01	1,21	0,06
1j	15500	2,19	1,48	1,24	1,46	1,02	1,22	0,11
1k	16000	1,83	1,32	1,27	3,08	0,99	1,28	0,10
1l	17000	1,40	1,12	0,91	1,03	0,87	1,05	0,01

ПРИМЕР 2 (ПРЕПАРАТЫ 2а-2j)

Следовала та же процедура, что и принятая для примера 1, с той только разницей, что фосфолипид являлся смесью DPPS (20% вес./вес.) и DSPC (80% вес./вес.), причем полное количество фосфолипида оставалось неизменным. Результаты сведены в таблице 2.

Таблица 2
Пр.	ЭМУЛЬСИЯ			Наполненные газом микропузырьки
	Перемешивание (об/мин)	DV50 (мкм)	DN (мкм)	D V50 (мкм)	D V (мкм)	DN (мкм)	DV50 /DN	>3 мкм (%)
2a	6000	8,75	3,07	7,55	9,05	2,27	3,33	21,81
2b	10000	3,54	1,90	3,00	3,71	1,47	2,04	5,05
2c	12000	3,04	1,83	2,45	3,73	1,32	1,85	2,15
2d	12500	2,85	1,76	2,21	3,24	1,27	1,74	1,57
2e	13000	2,98	1,83	2,25	3,04	1,28	1,76	1,76
2f	13500	2,91	2,05	1,88	2,46	1,20	1,57	0,87
2g	14000	2,45	1,67	1,82	2,66	1,16	1,57	0,57
2h	14500	2,18	1,55	1,58	3,04	1,09	1,44	0,38
2i	15000	1,94	1,42	1,34	1,96	1,04	1,28	0,31
2j	16000	1,81	1,38	1,35	2,30	1,03	1,31	0,14

ПРИМЕР 3 (ПРЕПАРАТЫ 3a-3p)

Следовала та же процедура, что и принятая для примера 2, с той только разницей, что весовое отношение DPPS/DSPC менялось, как указано в таблице 3. Результаты сведены в таблице 3.

Таблица 3
Пр.	Отношение DPPS/ DSPC	ЭМУЛЬСИЯ			Наполненные газом микропузырьки
		Перемешивание (об/мин)	D V50 (мкм)	D V (мкм)	DV50 (мкм)	DN (мкм)	DV50/ DN	>3 мкм (%)
3a	80/20	12000	2,44	1,54	1,68	1,19	1,41	0,48
3b	75/25	12000	2,53	1,66	1,73	1,18	1,47	0,62
3c	60/40	11000	3,53	1,86	2,75	1,45	1,90	4,00
3d	60/40	12000	2,62	1,60	1,78	1,21	1,47	0,72
3e	60/40	14000	2,36	1,60	1,59	1,13	1,41	0,36
3f	50/50	12000	2,81	1,68	2,28	1,30	1,75	2,05
3g	40/60	11000	3,00	1,72	2,44	1,32	1,85	2,31
3h	40/60	12000	2,88	1,75	2,07	1,27	1,63	1,45
3i	40/60	13000	2,61	1,69	1,76	1,16	1,52	0,57
3j	40/60	14000	2,06	1,43	1,41	1,07	1,31	0,23
3k	40/60	14500	2,39	1,67	1,64	1,15	1,43	0,49
3l	30/70	11000	3,12	1,75	2,64	1,37	1,93	2,76
3m	30/70	12000	3,08	1,81	2,38	1,34	1,78	2,45
3n	25/75	11000	3,15	1,85	2,46	1,31	1,88	2,15
3o	10/90	11000	3,72	2,26	3,14	1,47	2,13	4,60
3p	5/95	11000	4,53	2,23	4,08	1,54	2,65	6,35

Пример 4

Следовала та же процедура, что и принятая для примера 2, с той только разницей, что готовились смеси DSPA и DPPS с различными весовыми отношениями.

Результаты сведены в таблице 4.

Таблица 4
Пр.	Отношение DSPA/DPPS	Эмульсия			Наполненные газом микропузырьки
		Перемешивание (об/мин)	DV50 (мкм)	DV (мкм)	D V50 (мкм)	D N (мкм)	DV50 /DN	>3 мкм (%)
4a	25/75	12000	2,61	1,63	1,94	1,24	1,56	1,07
4b	50/50	11000	2,81	1,86	2,35	1,39	1,69	2,67
4c	50/50	12000	2,35	1,57	1,84	1,19	1,55	0,74
4d	75/25	12000	2,50	1,65	2,11	1,27	1,66	1,45

ПРИМЕР 5 (ПРЕПАРАТЫ 5a-5i)

Следовала та же процедура, что и принятая для примера 1, с той только разницей, что применялась фосфолипидная смесь DPPG и DSPC в отношении 1/1 (вес./вес.) (полная концентрация 1,0 мг/мл) в смеси с 10% вес./вес. (от общего веса фосфолипида) пальмитиновой кислоты. Результаты сведены в таблице 5.

Таблица 5
Пр.	ЭМУЛЬСИЯ			Наполненные газом микропузырьки
	Перемешивание (об/мин)	DV50 (мкм)	DV (мкм)	D V50 (мкм)	D N (мкм)	DV50 /DN	>3 мкм (%)
5a	6000	10,02	2,64	6,87	2,07	3,32	18,00
5b	8000	5,31	2,49	3,73	1,62	2,30	7,97
5c	9000	5,04	2,69	3,20	1,55	2,06	6,22
5d	10000	3,82	2,02	2,85	1,38	2,07	2,65
5e	10500	3,36	1,96	2,51	1,32	1,89	2,44
5f	11000	3,22	1,87	2,31	1,28	1,81	1,41
5g	12000	2,69	1,61	1,74	1,14	1,53	0,52
5h	13000	2,28	1,56	1,56	1,07	1,46	0,23
5i	14000	2,00	1,44	1,30	1,00	1,30	0,26

ПРИМЕР 6

Следовала та же процедура, что и принятая для примера 1, с той только разницей, что в качестве фосфолипида применялся DSEPC, а в качестве органического растворителя - перфторгексан. Использованная скорость вращения составляет 11000 об/мин. Размеры, распределение по размерам и процент микропузырьков с диаметром более 3 мкм были следующими:

DV50 (мкм)	DN (мкм)	D V50/DN	>3 мкм (%)
1,65	1,11	1,49	0,30

ПРИМЕР 7 (ПРЕПАРАТЫ 7a-7l)

Дистиллированную воду (10 мл), содержащую DPPS (10 мг) в качестве фосфолипида, нагревают до 70°C в течение 15 минут и затем охлаждают до комнатной температуры. 0,8 мл Органического растворителя, как определенный в следующей таблице 6, было эмульгировано в этой водной фазе, используя высокоскоростной гомогенизатор (Polytron T3000) при 10000 об/мин в течение 1 минуты. Эмульсию добавляют к 10 мл 15%-ного раствора декстрана 15000, замораживают и лиофилизуют (0,2 мбар, 24 часа). После лиофилизации в лиофилизатор вводят воздух. Микропузырьковую суспензию, полученную после восстановления с дистиллированной водой, анализируют, используя счетчик Культера. В таблице 6 суммированы результаты в терминах размеров и распределения микропузырьков по размерам.

Таблица 6
Пр.	Растворитель	D V50 (мкм)	D N (мкм)	DV50 /DN
7a	C6F14	2,77	1,44	1,92
7b	CF 3-цикло-C6F11	2,24	1,30	1,72
7c	C 7F16	2,48	1,40	1,77
7d	C9 F20	2,46	1,36	1,81
7e	Перфтордекалин	3,76	1,52	2,47
7f	Циклогексан	2,61	1,41	1,85
7g	Циклооктан	2,43	1,35	1,80
7h	Декан	2,01	1,12	1,79
7i	Октан	2,87	0,96	2,99
7j	Метаксилен	2,45	1,21	2,02
7k	Диизопропилкетон	1,83	1,05	1,74
7l	CCl 4	1,90	1,27	1,50

ПРИМЕР 8

Вышеуказанный пример 7 повторяют с той же методологией, используя перфторгексан как органический растворитель и другие лиопротективные агенты при различных концентрациях, как указано в таблице 7. В таблице 7 суммированы полученные результаты в терминах размеров и распределения микропузырьков по размерам.

Таблица 7
Пр.	Лиопротектор и концентрация (вес./вес.)	DV50 (мкм)	DN (мкм)	DV50/DN
8a	Манноза 5%	4,35	1,90	2,29
8b	Глюкоза 5%	2,59	0,96	2,70
8c	Сорбит 5%	3,84	1,40	2,74
8d	Маннитол 10%	2,22	1,22	1,82
8e	Маннитол 5%	2,24	1,21	1,85
8f	Маннитол 4%	2,54	1,45	1,75
8g	Мальтоза 5%	3,42	0,99	3,45
8h	Декстран 6000 7,5%	3,30	1,48	2,23
8j	Декстран 15000 5%	2,55	1,31	1,95
8k	Декстран 15000 7,5%	2,77	1,44	1,92
8i	Декстран 40000 7,5%	2,54	1,32	2,29
8l	Инулин 5%	3,58	1,43	2,70

ПРИМЕР 9 (ПРЕПАРАТЫ 9a-9e)

Повторяют пример 1, эмульгируя смесь при скорости 10000 об/мин. Кроме того, тот же пример повторяют, добавляя в водную фазу до эмульгирования различные количества плюроника F68 (полоксамер, соответствующий полоксамеру 188), как указано в таблице 8. В таблице 8 показаны результаты сравнительного эксперимента в терминах распределения по размерам и степени превращения микропузырьков. Степень превращения дана как процент наполненных газом микропузырьков, образованных после восстановления лиофилизованной матрицы, относительно числа микрокапель, измеренных в эмульсии.

Таблица 8
Пример	Плюроник* (мг/мл)	DV50 (мкм)	DN (мкм)	DV50/DN	Степень превращения (%)
9a	0	2,42	1,38	1,75	28,0
9b	0,25	4,64	1,97	2,36	18,8
9c	0,5	13,85	1,38	10,04	7,3
9d	1,0	12,59	1,49	8,45	3,2
9e	2,0	15,80	1,23	12,85	0,5
*Концентрация относится к объему водной фазы

Вышеуказанные результаты показывают, что концентрация полоксамера, соответствующая половине концентрации фосфолипида (т.е. примерно 33% от полного количества ПАВов в смеси), отрицательно повлияла и на степень превращения, и на распределение микропузырьков по размерам.

ПРИМЕР 10 (ПРЕПАРАТЫ 10a-10d)

Повторяют пример 9, но вместо добавления плюроника F68 к водной фазе до эмульгирования добавляют различные количества холестерина (от Fluka) в органическую фазу, как указано в таблице 9. В таблице 9 показаны результаты сравнительного эксперимента в терминах распределения по размерам и степени превращения микропузырьков (из микрокапель эмульсии).

Таблица 9
Пример	Холестерин* (мг/мл)	DV50 (мкм)	DN (мкм)	DV50/D N	Степень конверсии (%)
10a	0	2,42	1,38	1,75	28,0
10b	0,10	3,79	1,31	2,89	17,8
10c	0,25	1,35	1,05	1,28	5,7
10d	0,50	14,02	1,70	8,25	0,8
*Концентрация относится к объему водной фазы

Приведенные выше результаты показывают, что концентрация холестерина в водной фазе, равная 0,050% (вес./вес.), очень отрицательно влияет как на степень превращения, так и на распределение микропузырьков по размерам. Концентрация 0,025%, хотя и может обеспечить приемлемые размеры и распределение микропузырьков по размерам, все же приводит к относительной низкой степени превращения.

ПРИМЕР 11

Дистиллированную воду (30 мл), содержащую 60 мг DPPS и 3 г маннитола, нагревают до 70°C в течение 15 минут, затем охлаждают до комнатной температуры.

Перфторгептан эмульгируют в этой водной фазе, применяя высокоскоростной гомогенизатор (Polytron^®, 12500 об/мин, 1 минута).

Полученную эмульсию с медианным диаметром объемного распределения (D_V50) 2,3 мкм и среднечисленным диаметром (D_N) 2,0 мкм один раз промывают при центрифугировании, повторно суспендируют в 30 мл 10%-ного раствора маннитола в дистиллированной воде и затем разделяют на три порции (3x10 мл).

Первую порцию (A) используют как есть для последующей стадии лиофилизации. Вторую порцию (B) набирают в шприц и впрыскивают вручную через 5-микронный фильтр Nuclepore® (47 мм - поликарбонат). Третью порция (C) фильтруют через 3-микронный фильтр Nuclepore® (47 мм - поликарбонат) по тому же методу.

Эмульсии замораживали в 100-миллилитровом баллоне (-45°C в течение 5 минут), затем сушили сублимацией (0,2 мбар, 72 часа).

Атмосферное давление восстанавливали введением смеси C₄F ₁₀ и воздуха в отношении 35/65. Соответствующие лиофилизаты диспергировали в дистиллированной воде (10 мл). Полученные таким образом микропузырьковые суспензии анализировали, используя счетчик Культера, результаты приведены в следующей таблице.

	D V50	DN	DV50/DN
Часть A	1,71	1,12	1,53
Часть B	1,65	1,12	1,47
Часть C	1,57	1,09	1,44

Как показывают приведенные выше результаты, дополнительная стадия фильтрации позволяет еще более уменьшить размер микропузырьков и сузить соответствующее распределение по размерам.

ПРИМЕР 12

Повторяли пример 1, используя 10 мг смеси DSPC/DSTAP в отношении 7/3 (вес./вес.), при скорости перемешивания 11000 об/мин.

Характеристики капель эмульсии и микропузырьков были следующими:

Капли эмульсии		Наполненные газом микропузырьки
DV50	D N	DV50	DN	> 3 мкм
2,36	1,48	2,10	1,12	0,63

Пример 13

Повторяли получение примера 1, эмульгируя смесь при скорости 10000 об/мин (пример 13a).

Указанное получение повторяли, добавляя далее примерно 0,9 мг DSPE-ПЭГ2000 (примерно 8,3% от полного количества диспергированных фосфолипидов) в исходную водную суспензию (пример 13b).

Ни в одном из двух приготовлений промывку при центрифугировании не проводили.

В таблице 10 показаны характеристики этих двух препаратов, как эмульсии, так и микропузырьковой суспензии.

Таблица 10
	Эмульсия		Микропузырьки
Пример	DV50 (мкм)	DN (мкм)	D V50 (мкм)	D N (мкм)	DV50 /DN	степень превращения (%)
13a	3,19	1,66	2,66	1,33	2,00	29,5
13b	4,32	1,43	5,81	1,18	4,92	18,8

Приведенные выше результаты показывают, что концентрация DSPE-ПЭГ менее 10 вес.% (от общего количества фосфолипидов) отрицательно влияет и на степень превращения, и на распределение микропузырьков по размерам.

ПРИМЕР 14

Повторяют получение примера 11, заменяя DPPS тем же количеством смеси DAPC/DPPS в отношении 1:1 (вес./вес.).

Полученную эмульсию разделяют на три порции по 10 мл, не промывая при центрифугировании.

Водные суспензии DSPE-ПЭГ2000 и DSPE-ПЭГ5000 готовят отдельно, диспергируя 25 мг соответствующего DSPE-ПЭГ в 5 мл 10%-ного раствора маннитола в условиях обработки ультразвуком (ультразвуковой зонд 3 мм, сонификатор Branson 250, выход 30%, в течение 5 минут).

Затем в первую порцию эмульсии добавляют аликвоту 2,5 мл 10%-ного раствора маннитола (пример 14a).

Во вторую порцию эмульсии добавляют аликвоту 2,5 мл приготовленной суспензии DSPE-ПЭГ2000 (пример 14b).

В третью порцию эмульсии добавляют аликвоту 2,5 мл приготовленной суспензии DSPE-ПЭГ5000 (пример 14c).

Все три смеси нагревают при 60°C при перемешивании в течение часа. После охлаждения при комнатной температуре определяют размер микрокапель с помощью анализатора размеров Malvern Mastersizer. Результаты приведены в таблице 11.

Затем эмульсии сушат сублимацией согласно процедуре примера 11. Атмосферное давление восстанавливают введением смеси C₄F ₁₀ и воздуха при отношении 35/65. Соответствующие лиофилизаты диспергировали в дистиллированной воде (10 мл). Полученные таким образом микропузырьковые суспензии анализировали, используя счетчик Культера (смотри таблицу 11).

Затем микропузырьковые суспензии дважды промывали дистиллированной водой при центрифугировании (180 г/10 мин) и снова лиофилизовали согласно вышеуказанной процедуре. Количество DSPE-ПЭГ в высушенной композиции определяли с помощью ВЭЖХ-МС. Результаты приведены в следующей таблице 11.

Таблица 11
	Эмульсия		Микропузырьки
Пример	DV50 (мкм)	DN (мкм)	D V50 (мкм)	D N (мкм)	DSPE-ПЭГ (% вес/вес)
14a	2,6	2,3	1,9	1,1	0,0
14b	2,5	2,3	3,4	1,3	35,5
14c	2,5	2,3	2,2	1,2	37,9

Как можно заключить из приведенных выше результатов, последовательное добавление суспензии DSPE-ПЭГ к образованной эмульсии позволяет ввести в состав стабилизирующего слоя относительно высокие количества DSPE-ПЭГ (в данном случае более 30% от полного веса фосфолипидов, образующих стабилизирующую оболочку), не влияя негативно на конечные свойства микропузырьков.

Сходные результаты были получены с другими ПЭГ-модифицированными фосфолипидами, в частности DSPE-ПЭГ2000-биотин или DSPE-ПЭГ2000-малеимид, и с фосфолипидами, несущими пептиды, в частности DSPE-ПЭГ2000-малеимид-SATA-RGD4C. Этот последний фосфолипид, несущий пептиды, может быть получен согласно известным методам путем реакции пептида RGD-4C с SATA, удалением защиты с тиоловой группы SATA и реакции незащищенного RGD4C-SATA с DSPE-ПЭГ2000-малеимидом. Обычно может применяться способ приготовления, описанный в работе "Development of EGF-conjugated liposomes for targeted delivery of boronated DNA-binding agents", by Bohl Kullberg et al., Bioconjugate chemistry 2002, 13, 737-743 (описывается внедрение белка EGF в молекулу DSPE-ПЭГ-малеимида).

ПРИМЕР 15

10 мг смеси DPPS/DSPC в отношении 1:1 (вес./вес.) добавляют к примерно 10 мл 10%-ного (вес./вес.) водного раствора маннитола.

Смесь нагревают при 70°C в течение 15 минут и затем охлаждают при комнатной температуре (22°C). При скорости подачи 0,2 мл/мин через входное отверстие микросмесителя (стандартный микросмеситель с прорезями Interdigidital, корпус SS 316Ti с вкладками никель-на-меди, 40 мкм x300 мкм, Institut fur Microtechnik Mainz GmbH) в водную фазу, циркулирующую при 20 мл/мин при комнатной температуре, добавляют циклооктан до полного количества органического растворителя 7,4% (об./об.). По завершении добавления органического растворителя эмульсия дополнительно циркулирует в микросмесителе еще 20 минут.

Затем эмульсию разделяют на пять аликвот по 2 мл каждая и вводят в пять ампул DIN8R. Четыре ампулы герметично закрывают и нагревают в течение 30 минут при температурах 60, 80, 100 и 120°C соответственно, как указано в таблице 12, а пятую не нагревают.

Затем эмульсии охлаждают до комнатной температуры и содержимое пяти ампул подвергают лиофилизации согласно следующей процедуре. 1 мл Каждой эмульсии собирают в ампулу DIN8R и замораживают при -5°C; температуру снижают до -45°C в течение 1 часа и затем эмульсию сушат сублимацией при -25°C и 0,2 мбар в течение 12 часов (лиофилизатор Telstar Lyobeta35), с конечной стадией сушки при 30°C и 0,2 мбар в течение 5 часов.

Затем лиофилизованный продукт выставляют в атмосферу, содержащую 35% перфтор-н-бутана и 65% азота, и затем диспергируют в объеме воды, вдвое превышающем начальный объем, путем легкого встряхивания вручную. В таблице 12 показаны результаты определения характеристик конечной суспензии микропузырьков.

Таблица 12
Нагрев	DV50	DN	D V50/DN	Число микропузырьков на мл эмульсии
Без нагрева	10,45	1,63	6,41	5,34x10 7
60°°C	4,85	1,32	3,67	7,83x107
80°C	5,34	1,29	4,14	8,51x10 7
100°C	6,96	1,66	4,19	4,92x108
120°C	3,05	1,50	2,03	8,69x10 8

Из приведенных выше результатов видно, что тепловая обработка образованной эмульсии позволяет сузить распределение по размерам конечной микропузырьковой суспензии при увеличении также полного числа микропузырьков. В частности, увеличивая температуру нагрева выше 100°C, возможно получить относительно узкое распределение микропузырьков по размерам также в отсутствие стадии промывки эмульсии, а также увеличение полного числа микропузырьков в суспензии.

ПРИМЕР 16

Дистиллированную воду (10 мл), содержащую 10 мг DPPS и 1 г маннитола, нагревают до 70°C в течение 15 минут, затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют DPPE-MPB (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[4-(p-малеимидофенил)бутирамид], натривая соль, Avanti Polar Lipids) (4,8 вес.% - 0,5 мг). Этот фосфолипид диспергируют в водной фазе, используя ультразвуковую баню (Branson 1210 - 3 минуты).

Перфторгептан (0,8 мл от Fluka) эмульгируют в этой водной фазе (охлажденной на ледяной бане), используя высокоскоростной гомогенизатор (Polytron ^® T3000, 15000 об/мин, 1 минута).

Полученная эмульсия имеет медианный диаметр объемного распределения (D _V50) 2,3 мкм и среднечисленный диаметр (D _N) 2,1 мкм, как определено с помощью анализатора размеров Malvern Mastersizer.

Эмульсию дважды промывают при центрифугировании и затем повторно суспендируют в 9,5 мл 10%-ного раствора маннитола в дистиллированной воде. Промытую эмульсию замораживают (-45°C, 5 минут), затем сушат сублимацией (при 0,2 мбар в течение 24 часов).

Атмосферное давление восстанавливают путем введения смеси C₄F₁₀ и воздуха в отношении 35/65. Лиофилизат диспергируют в дистиллированной воде (20 мл), микропузырьки один раз промывают при центрифугировании и затем повторно диспергируют в 4 мл ЭДТА, содержащем соляной раствор, буферированный фосфатом (мольный состав: 10 мМ фосфата, 2,7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), содержащий 3,4 мг тиоацетилированного авидина, к незащищенной тиоловой группе тиоацетилированного авидина добавляли 400 мкл раствора гидроксиламина (13,92 мг в PBS 50 мМ, pH: 7,5).

Суспензию перемешивают инверсией на дисковом вращающем устройстве (Fisher Scientific) в течение 2 часов. Затем добавляют 150 мкл 1 н. NaOH.

Полученные таким образом микропузырьки, меченные авидином, дважды промывали PBS при центрифугировании (10000 об/мин, 10 минут, центрифуга 3K10 от Sigma). Полученную микропузырьковую суспензию анализировали на счетчике Культера, она показала диаметр D_V50 1,6 мкм и D _N 1,2 мкм.

Эффективность микропузырьковой композиции-мишени проверяли как in vitro, так и in vivo.

Эксперимент in vitro:

Чтобы проверить эффективность связывания ацетилированного авидина с поверхностью микропузырьков, было приготовлено два набора лунок, содержащих фибрин. В первом наборе находилась только поверхность фибрин. Во втором наборе фибрин предварительно обрабатывали антифибриновым пептидом, меченным биотином (DX-278, описан в документе WO 02/055544). В лунки добавляли микропузырьковые суспензии, приготовленные, как описано выше (5x10⁸ микропузырьков на лунку). После 2 часов инкубирования (вверх дном) и нескольких промывок поверхности фибрина в двух наборах лунок рассматривали с помощью оптического микроскопа. Тогда как в лунках без биотинилированного антифибринового пептида по существу не наблюдалось микропузырьков, в лунках, содержащих биотинилированный антифибриновый пептид, наблюдали сплошное покрытие микропузырьков.

Эксперимент in vivo:

Образовывали тромб в брюшной аорте двух кроликов по методу FeCl₃ (Lockyer et al, 1999, Journal of Cardiovascular Pharmacology, vol 33, pp 718-725).

Эхо-сигналы получали с помощью ультразвуковой машины HDI 5000 (Philips), режим импульсной инверсии, зонд L7-4, MI: 0,07.

Затем двум кроликам внутривенно впрыскивали ботинилированное антитело (CD41, специфический для рецептора GPIIB/IIIA активированных тромбоцитов).

Через 30 минут первому кролику внутривенно впрыскивали микропузырьковую суспензию, содержащую меченные авидином микропузырьки (1х10 ⁹ микропузырьков/мл). Через пятнадцать минут после инъекции наблюдалась сильное затемнение тромба для суспензии. Это затемнение оставалось видимым после по меньшей мере одного часа после инъекции.

Такое же количество микропузырьковой суспензии без меченных авидином микропузырьков впрыскивают внутривенно второму кролику. Наблюдалось лишь легкое затемнение тромба.