олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii

Формула изобретения

Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющие следующую структуру:

5'-GCAGGTTAATGAATAGCGTTGGTG-3'-CimMBP1s

5'-CAAACATCAGTCCGTAATCGTGTG-3'-CimMBP2as,

комплементарные фрагменту гена МВР-1 (macrophage binding protein) C.immitis.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Кокцидиоидомикоз относят к особо опасным микозам, возбудителями которого являются диморфные грибы рода Coccidioides spp. Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК - полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ЦНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей кокцидиоидомикоза.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК - полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.

Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на основе фрагментов гена Csa сериновой протеиназы C.immitis, предложенные S.Pan и G.Cole в 1995 г. (Molecular and biochemical characterization of a Coccidioides immitis-specific antigen. Infect. Immun. 1995. Vol.63, №10. P.3994-4002). Однако данные олигонуклеотидные затравки не были протестированы для выявления возбудителей кокцидиоидомикоза при исследовании проб биологического материала и объектов окружающей среды. Кроме того, в свете изменения таксономической структуры рода Coccidioides в 2002 г. не ясна специфичность этих праймеров - являются ли они видоспецицическими для С.immitis или идентифицируют оба вида Coccidioides spp (Fisher, М.С. et al. Molecular and phenotype description of Coccidioides posadasii sp. nov., previously recognized as the non-Califomian population of Coccidioides immitis. 2002. Mycologia 94. P.73-84).

Для выявления ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза в почве D.R.Greene et al. (Soil isolation and molecular identification of Coccidioides immitis. 2000. Mycologia 92. P.406-410) были разработаны праймеры на основе нуклеотидных последовательностей ITS-области рибосомальных генов. Однако, учитывая высокую степень гомологии с близкородственными сапрофитными грибами и консервативность рибосомальных генов грибов, возможно получение ложноположительных результатов. Поэтому авторы в работе рекомендуют дополнительно использовать секвенирование для подтверждения специфичности синтезируемых в реакции ампликонов. Важно отметить, что на метод секвенирования при идентификации продуктов ПЦР при анализе клинических проб и объектов внешней среды можно будет положиться только в том случае, если ITS регионы всех грибов будут секвенированы и внесены в GenBank (Millar B.C. et al. False identification of Coccidioides immitis: do molecular methods always get it right? J. Clin. Microbiol. 2003. Vol.41, №12. P.5778-5780).

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации C.immitis и C.posadasii методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-GCAGGTTAATGAATAGCGTTGGTG-3'-CimMBP1s

5'-CAAACATCAGTCCGTAATCGTGTG-3'-CimMBP2as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), были подобраны праймеры, обозначенные CimMBP1s-CimMBF2as, комплементарные фрагменту гена МВР-1 (macrophage binding protein) для идентификации C.immitis и C.posadasii. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 597 п.н.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме C.posadasii 36 Silveira, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1х10⁶ артроспор/мл до 1×10 ⁶ артроспор/мл. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Чувствительность реакции амплификации с праймерами CimMBP1s-CimMBP2as оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза, и составила - 1×10 ²-1×10⁴ артроспор/мл. Для обнаружения возбудителей кокцидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров для анализа биологического материала (печень, селезенка, легкие) при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех белых мышей, зараженных культурой данных микромицетов, на всех сроках наблюдения.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей кокцидиоидомикоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ) для конструирования праймеров была выбрана последовательность гена C.immitis MBP-1 (macrophage binding protein), размер которой составляет 1534 п.н. (GenBank NCBI, AF326276). Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 597 п.н. (табл.1).

Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза.

Для исключения возможности неспецифического отжига праймеров до достижения заданных температурных параметров используют режим «горячего старта». «Горячий старт» обеспечивается приготовлением реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой воска. Нижний слой содержит предлагаемые праймеры и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, верхний - реакционный буфер, фермент Taq-полимеразу и ДНК-матрицу. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит на этапе предварительной денатурации ДНК при 95°С.

Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу.

Приготовление «нижней» реакционной смеси:

раствор dNTP (2,5 мМ) - 2 мкл

праймер CimMBP1s (12 пМ/ мкл) - 1 мкл

праймер CimMBP2as (12 пМ/ мкл) - 1 мкл

вода деиоинизированная - 0,6 мкл

Сверху наслаивается расплавленный воск 11 мкл.

Состав «верхней» реакционной смеси:

реакционный буфер (НПФ «ДНК-Технология», Москва) (×2,5) - 10 мкл

MgCl₂ 0,25 M - 0,2 мкл

фермент Taq-полимераза (5 ед/ мкл) - 0,2 мкл

исследуемая проба ДНК - 10 мкл.

Сверху наслаивают по 30 мкл минерального масла.

Условия проведения реакции для амплификатора «Терцик» (Москва): этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 42 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 61°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.

После этого продукты реакции разделяют путем электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. При использовании разработанного набора праймеров в реакции амплификации с ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза синтезируемые ампликоны по электрофоретической подвижности соответствуют расчетным данным (фиг.1.)

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении артроспор чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза.

Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляют, как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур C.immitis и C.posadasii Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1×10 ²-1×10⁴ артроспор/мл. С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.

В качестве примера на фиг.2 показана электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении чувствительности сконструированных праймеров с ДНК различных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза.

Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителей кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.