двухфазная питательная среда для выделения бруцеллезного микроба

Формула изобретения

Двухфазная питательная среда для выделения бруцеллезного микроба, содержащая плотную фазу, включающую соответственно, г/л:

Патока рафинадная	18,0-22,0
Натрия хлорид	4,0-6,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный	3,0-5,0
Дрожжевой экстракт	8,0-12,0
Микробиологический агар	16,0-20,0
Водопроводная вода	остальное

и жидкую фазу, представленную, г/л:

Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (СПБ)	13,0-17,0
Лимоннокислый натрий	4,0-6,0
Глюкоза	8,0-12,0
Дистиллированная вода	остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробиологии, и может быть использовано для выделения и культивирования бруцеллезного микроба.

Известна питательная среда плотная следующего состава: мясная вода, 1% пептона, 0,5% поваренной соли и 2% агар-агара.

Известна питательная среда жидкая следующего состава: мясная вода, 1% сухого пептона и 0,5% поваренной соли.

В каждый флакон заливают 25-30 мл стерильного мясопептонного бульона, пробкуют и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин и выдерживают в термостате 2-3 дня после чего в каждый флакон с плотной средой вливают стерильно мясопептонный бульон и затем используют для культивирования бруцелл. (Ф.К.Черкес, Л.Б.Богоявленская, Н.А.Вельская. Микробиология, 1986. с.105; 346-347).

Недостаток данной питательной среды является то, что результат высева необходимо ждать месяц.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению относится двухфазная среда включающая:

Е-агар, состоящий, г/л: папаиновый гидролизат соевой муки USP 20 г; натрия хлорида 5 г; агар 10, деионизированная вода 1000 мл (плотная фаза).

Е-бульон, состоящий, г/л: папаиновый гидролизат соевой муки USP 20 г; натрия хлорида 5 г; глюкоза 5 г; феноловый красный, 2%-ный водный раствор 2 мл: деионизированная вода 1000 мл (жидкая фаза). Для получения данной среды в стерильные пробирки с завинчивающими крышками с соблюдением правил асептики разливают по 3 мл Е-гара, после затвердения на среду наслаивают 3 мл Е-бульона и хранят пробирки при комнатой температуре. (Ф.Герхард. Методы общей бактериологии, том 1. С.-331-332. Москва, МИР, 1983.

Недостатком данной питательной среды является наличие в ее составе дорогого и мало распространенного компонента - папаинового гидролизата соевой муки USP, и долгий срок результата высева - месяц.

Целью изобретения является получение качественной двухфазной питательной среды растительного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства бруцеллезного микроба на 2-3 сутки.

Цель достигается тем, что предлагаемая двухфазная питательная среда содержит плотную фазу, содержащую соответственно, г/л:

Патока рафинадная	20.0
Натрия хлорид	5.0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный	4.0
Дрожжевой экстракт	10.0
Микробиологический агар	18.0
Водопроводная вода	остальное

Патока рафинадная (ОСТ 18-233-75) в своем составе содержит не менее 45% сахарозы.

Биологическая ценность мелассы свекловичной (патоки рафинадной), являющейся отходом свеклосахарного производства, состоит в наличии углеводов, биологически активных веществ, аминокислот, витаминов, микроэлементов. В мелассе обнаружено 17 аминокислот, что составляет 31,0% от количества общего азота (0,5-2,1%). Комплекс термоустойчивых биологически активных веществ, накопленных свеклой в период вегетации и обладающих ростовыми свойствами, полностью переходит в мелассу. К ним относятся витамины В ₃, В₈ и Н. (Петрухин И.В. Корма и кормовые добавки: Справочник. М.: Росагропромиздат, 1989. 526 с.)

Использование патоки рафинадной с натрием фосфорнокислым двузамещенным и дрожжевым экстрактом на водопроводной воде в качестве основы является отличительным признаком плотной фазы предлагаемой питательной среды.

И жидкую фазу, представленную питательным бульоном для культивирования микроорганизмов сухим (СПБ), состоящую из панкреатического гидролизата кильки и натрия хлорид (производство МИКРОГЕН ФГУП НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ Россия, 115088, г.Москва ул. 1-я Дубровская, д.15), в которую добавили лимоннокислый натрий как консервант, и глюкозу как стимулятор роста при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (СПБ)	15.0
Лимоннокислый натрий	5.0
Глюкоза	10.0
Дистиллированная вода	остальное

Использование в качестве источника азотистого питания питательного бульона (СПБ), в качестве стимулятора роста - глюкозы, в качестве консерванта - лимоннокислого натрия - отличительные признаки жидкой фазы заявляемой питательной среды.

В отличие от прототипа предлагаемая среда экономична, выгодна и обеспечивает оптимальные условия для размножения бруцелл за 2-3 суток.

Посев изучаемых культур материала осуществляют в двухфазную среду, завальцованную во флаконы (V 100 мл) по 30 мл плотной среды и 10 мл жидкой среды, стерильную.

Приготовление двухфазной питательной среды для выделения бруцеллезного микроба включает два этапа.

Плотная фаза питательной среды.

Для приготовления основы питательной среды отмеряют 20,0 г патоки рафинадной в мерном стакане, выливают в эмалированную кастрюлю, затем заливают водопроводной водой 980,0 мл, взвешивают на механических весах дрожжевой экстракт 10,0 г. натрия хлорид 5,0 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного 4,0 г. ссыпают в эмалированную кастрюлю, тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до 56°С, с добавлением активированного угля марки «ОУ-А» в количестве 1-2% к объему жидкости, добавляют 7 мл 20% раствора натрия гидроокиси, кипятят 5 мин. Фильтруют через полотняный фильтр «Бельтинг» и 8-16 слоев фильтровальной бумаги. Сбор фильтрата помещают в эмалированную кастрюлю. Готовый фильтрат светло-желтого цвета. К нему добавляют 18,0 г/л агара микробиологического. Смесь подогревают в кастрюле до 100±1°С, кипятят до полного расплавления агара в течение 10 мин. Корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1, добавляют дрожжевой экстракт 10,0 г.

Приготовленную среду разливают во флаконы (V 100) по 30 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют в автоклаве при 114±1°С в течение 20 мин. После стерилизации и остуживания до 56°С укладывают флаконы на бок, чтобы расплавленная агаровая среда образовала твердый слой на ее боковой стенке. Через 2-е суток флаконы ставят вертикально и выдерживают в термостате 3-е суток при 37°С на стерильность.

Плотная фаза питательной среды содержит следующие ингредиенты, г/л:

Патока рафинадная	18,0-20,0
Натрия хлорид	4,0-6,0
Натрия фосфорнокислого двузамещенного	3,0-5,0
Дрожжевой экстракт	8,0-12,0
Микробиологический агар	16,0-20,0
Водопроводная вода	остальное

Жидкая фаза питательной среды

Питательную среду (жидкую) готовили на основе питательного бульона для культивирования микроорганизмов сухого (СПБ) (производства МИКРОГЕН ФГУП «НПО» »Микроген» МЗ РФ Россия, 115088, г.Москва ул. 1-я Дубровская, 15). Среда содержит панкреатический гидролизат кильки и натрия хлорид. В данную среду мы добавили лимоннокислый натрий как консервант, и глюкозу как стимулятор роста в определенных дозах при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (СПБ)	13,0-17,0
Лимоннокислый натрий	4,0-6,0
Глюкоза	8,0-12,0
Дистиллированная вода	остальное

Смесь подогревают в эмалированной кастрюле до 100±1°С, кипятят до полного расплавления ингредиентов в течение 3 мин. В готовой жидкой питательной среде устанавливают рН 7,2±0,1 раствором 20% гидроокиси натрия или раствором соляной кислоты в соотношении 1:1

Приготовленную среду разливают в стерильные бактериологические пробирки мерно по 10±0,1 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации и остуживания пробирки ставят в термостат вертикально и выдерживают 3-е суток при 37°С на стерильность. После поверки стерильности двух фаз питательных сред с соблюдением правил асептики стерильно над факелом жидкую питательную среду вливают во флаконы твердой питательной средой, флаконы закрывают стерильными резиновыми пробами и накрывают алюминиевыми колпачками, затем вальцуют. Завальцованные флаконы выдерживают в условиях термостата при температуре 37°С 3-е суток.

Готовую двухфазную питательную среду используют для выделения бруцеллезного микроба. Испытуемые тест-штаммы B.melitensis 565 М, В. abortus 544, выращенные на пластинках плотного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 24 ч. Из суточных культур готовили взвесь м.к. тест-штаммов в физиологическом растворе с концентрацией, соответствующей, 10 единицам ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича, эквивалентного 1,0.10 ⁹ м.к./мл бруцелл. Затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 и 10 м.к. Из данных разведений взвесей культур высевали одноразовым шприцем по 0,1 мл в 3 флакона. Посевы инкубировали в условиях термостата при 37°С Через каждые 24-48-72-120 ч флаконы наклоняют, так чтобы жидкая среда смачивала всю поверхность скошенного агара, а затем из жидкой среды стерильно одноразовым шприцем над факелом через прокол резиновой пробки забирают пробу в количестве 0,1 мл и засевают на пластинки агара

Оценку ростовых свойств двухфазных питательных сред для выделения бруцеллезного микроба проводили путем подсчета количества выросших колоний бруцелл при посеве содержимого флаконов посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на двухфазной питательной среде, содержащей, г/л: (плотная фаза) патока рафинадная 18,0, натрия хлорид 4,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0, дрожжевой экстракт 8,0, микробиологический агар 16,0, водопроводная вода - остальное;

(жидкая фаза) питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 13,0, лимоннокислый натрий 4,0, глюкоза 8,0, дистиллированная вода - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара при пересеве из жидкой среды, для бруцелл обеих видов, высеянных из флаконов при посевной дозе 100 м.к., составило через 48 и 72 ч соответственно 121; 500; 83; 100. То есть накопительный эффект для B.melitensis 565 составил после 72 120 ч подращивания 49/58%, а для B.abortus 58/71%.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на двухфазной питательной среде, содержащей, г/л: (плотная фаза) патока рафинадная 20,0, натрия хлорид 5,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный 4,0, дрожжевой экстракт 10,0, микробиологический агар 18,0, водопроводная вода - остальное,

(жидкая фаза) питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 15,0: лимоннокислый натрий 5,0, глюкоза 10,0, дистиллированная вода - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара при пересеве из жидкой среды, для бруцелл обеих видов, высеянных из флаконов при посевной дозе 100 м.к., составило через 48 и 72 часа соответственно 275; сплошной рост; 200; сплошной рост. То есть накопительный эффект для B.melitensis 565 составил после 72/120 ч подращивания 89/98%, а для B.abortus 55/98%.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на двухфазной питательной среде, содержащей, г/л: (плотная фаза) патока рафинадная 22,0, натрия хлорид 6,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный 5,0, дрожжевой экстракт 12,0, микробиологический агар 20,0, водопроводная вода - остальное,

(жидкая фаза) питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 17,0: лимоннокислый натрий 6,0: глюкоза 12,0: дистиллированная вода - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара при пересеве из жидкой среды, для бруцелл обеих видов, высеянных из флаконов при посевной дозе 100 м.к., составило через 48 и 72 ч соответственно 130; 602; 97; 124. То есть накопительный эффект для B.melitensis 565 составил после 72/120 ч подращивания 45/55%, а для B.abortus 61/69%.

Таким образом вариант 2 - двухфазная питательная среда - является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов двух питательных фаз, они в совокупности позволяют получить достаточное количество колоний бруцеллезного микроба в ранние сроки (2-3 сутки).