состав для доставки активных веществ к корням пшеницы

Формула изобретения

1. Состав для доставки активных веществ к корням пшеницы, содержащий микрочастицы, каждая из которых включает матрицу и распределенное в ней химическое вещество, отличающийся тем, что матрица представляет собой липосомы, полученные из яичного фосфатидилхолина, при этом поверхность матрицы содержит липополисахариды внешней мембраны бактерий Azospirillum brasilense Sp245.

2. Состав для доставки активных веществ к корням пшеницы, содержащий микрочастицы, каждая из которых включает матрицу и распределенное в ней химическое вещество, отличающийся тем, что матрица представляет собой наночастицы диоксида кремния, при этом поверхность матрицы содержит полисахариды корней пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29.

3. Состав по пп.1 и 2, отличающийся тем, что микрочастицы имеют размеры 0,01-0,20 мкм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экологии, биотехнологии и методов, применимых в растениеводстве и может быть использовано для доставки различных химических соединений, обладающих биологической активностью, к корням растений. Предлагаемый состав может быть использован для целевой доставки стимуляторов роста и других активных веществ к корням пшеницы, а также для проведения фундаментальных исследований на растениях, выращиваемых в лабораторных условиях.

Известны наносистемы для доставки лекарственных веществ в организме человека. Например, липосомы, несущие углеводные детерминанты, применяют для транспорта цитотоксических препаратов к опухолевым клеткам (Водовозова Е.Л. Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы // Биол. мембраны. 2004. Т.21. №.1. С.53-65). В качестве специфических углеводных детерминант используют остатки трисахарида А, тетрасахарида силиал LewisX, способных специфически связываться с пектинами, находящимися на поверхности раковой клетки. Различные векторные липосомы, нагруженные липидными производными противоопухолевого препарата сарколизина, проявляют лучшие терапевтические свойства по сравнению с исходным сарколизином.

Однако наносистемы с указанными специфическими углеводными детерминантами не применимы в аграрной практике.

Наиболее близким к предлагаемому решению является состав с контролируемым постепенным выделением активного ингредиента для доставки к растениям сельскохозяйственного химиката. В изобретении описывается состав для доставки к растениям сельскохозяйственного химиката, содержащий микрочастицы, имеющие средний диаметр от 0,2 до 200 мкм, каждая из которых включает полимерную матрицу и распределенный в полимерной матрице сельскохозяйственный химикат, выбранный из ципроконазола, эпоксиконазола и тебуконазола, причем микрочастицы включают от 1 до 50% по весу сельскохозяйственного химиката и от 50 до 99% по весу указанной полимерной матрицы, состоящей из полимера, выбранного из группы, включающей полиметилметакрилат, полимер молочной кислоты, сополимеры молочной и гликолевой кислот, ацетатбутират целлюлозы, полистирол, сополимеры оксимасляной кислоты и оксивалериановой кислоты, сополимеры стирола и малеинового ангидрида, экстракционную канифоль, акриловый полимер и сополимер винилпирролидона и винилацетата и их комбинации (см. патент РФ №2203547, МПК A01N 43/653).

Данные микросистемы не содержат на своей поверхности специфических детерминант, способных узнавать определенные растительные культуры, т.е. они не предназначены для целевой доставки активных веществ. Кроме того, в их состав входят полимеры, плохо деградируемые в окружающей среде, поэтому применение таких составов может способствовать увеличению антропогенной нагрузки на природные экосистемы.

Задачей изобретения является разработка состава для целевой доставки активных веществ к корням пшеницы, а также для проведения фундаментальных исследований на растениях, выращиваемых в лабораторных условиях.

Технический результат заключается в уменьшении антропогенной нагрузки на сельскохозяйственные угодья и окружающую среду.

Поставленная задача достигается тем, что в составе для доставки активных веществ к корням пшеницы, содержащем микрочастицы, каждая из которых включает матрицу и распределенное в ней химическое вещество, согласно решению матрица представляет собой липосомы или наночастицы диоксида кремния, при этом поверхность матрицы содержит природные углеводсодержащие соединения, способные специфически связываться с корневой поверхностью.

Липосомы могут быть получены из яичного фосфатидилхолина.

Поверхность матрицы из липосом может содержать липополисахариды внешней мембраны бактерий Azospirillum brasilense Sp245.

Поверхность матрицы из диоксида кремния может содержать полисахариды корней пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29.

Микрочастицы могут иметь размеры 0,01-0,20 мкм.

В известной авторам научно-технической и патентной литературе не обнаружены составы с подобной совокупностью признаков. Полученный результат, обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях. Преимуществами заявляемого состава является возможность доставлять с его помощью химические соединения к корням пшеницы целенаправленно, с большей экономией препаратов и снижением экологической нагрузки.

Способ приготовления состава заключается в следующем.

Если матрицей являются липосомы, состав готовят следующим образом. В водный раствор химического (активного) вещества при 50°С добавляют 10%-ный этанольный раствор фосфатидилхолина до его конечной концентрации 1.4 г/л при перемешивании, которое проводят до исчезновения запаха спирта. Полученную суспензию озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Липосомы, содержащие липополисахариды (ЛПС) внешней мембраны бактерий Azospirillum brasilense Sp24 получают, как описано выше, проводя инжекцию этанольного раствора фосфатидилхолина в водные растворы ЛПС с концентрацией 20-150 мг/л и химического вещества. Методика выделения ЛПС из бактерий Azospirillum brasilense Sp245 описана в работе (Федоненко Ю.П., Егорова И.В., Коннова С.А. и др. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. - 2001. - Том 70. - №3. - С.384-390.).

Если матрицей являются наночастицы диоксида кремния, состав готовят следующим образом. Создают в воде концентрацию наночастиц диоксида кремния ("Fluka", диаметр 7 нм) 1 г/л. Полученную суспензию также озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе. Для получения наночастиц, инкрустированных полисахаридами, к суспензии частиц приливают растворы полисахаридов, выделенных из корней пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29, до их конечной концентрации 10^-3-10 ^-1 г/л и перемешивают около 1 ч. Выделение полисахаридов корней пшеницы проводят любым известным методом (Выделение и анализ гликополимеров растительного и бактериального происхождения: уч. пособ. для студ. биол. фак-та / Коннова С.А., Сачкова (Фучеджи) О.А., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П. - Саратов: Изд-во СГУ, 2005, - 39 с. Для распределения в микрочастицах химического вещества суспензию наночастиц разбавляют водным раствором вещества в 100-10000 раз и перемешивают около 1 часа.

Примеры практической реализации способа

Пример 1. Оценка эффективности целевой доставки химического вещества к корням пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29 с помощью липосом, обогащенных ЛПС бактерий Azospirillum brasilense Sp245.

В качестве доставляемого химического вещества используют краситель метиленовый синий. Природными углеводсодержащими соединениями, способными специфически связываться с корневой поверхностью пшеницы, являются ЛПС бактерий Azospirillum brasilense Sp245 (Арефьева О.А., Рогачева С.М., Кузнецов П.Е. и др. Липосомы в изучении механизма агрегации бактерий и их адсорбции на корнях растений // Биологические мембраны. - 2006. - №1. - Т.23. - С.14-21).

Готовят состав с матрицей в виде липосом из яичного фосфатидилхолина. В водный раствор, содержащий метиленовый синий в концентрации 0.1 г/л, добавляют 10%-ный этанольный раствор яичного фосфатидилхолина ("Биолек", Украина) до его конечной концентрации 1.4 г/л при перемешивании на магнитной мешалке при 500 об/мин. Полученную суспензию озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе UD-11 ("Elpan", Poland) 3 раза по 30 с на максимальной мощности.

Готовят состав с матрицей в виде липосом из яичного фосфатидилхолина, содержащих на поверхности ЛПС. В данном случае инжекцию 10%-ного этанольного раствора яичного фосфатидилхолина проводят в раствор липополисахарида с концентрацией 23 и 150 мг/л, содержащий метиленовый синий с концентрацией 0.1 г/л.

Низкомолекулярные соединения, в том числе не включенный в липосомы краситель, удаляют диализом (диаметр пор диализной мембраны - 12-14 кДа) против воды в течение 2-х суток.

Состав растворов и суспензий, использованных в экспериментах, приведен в таблице 1.

Таблица 1
Суспензия/раствор	Состав, мг/л
	Фосфатидилхолин	ЛПС*	Метиленовый синий
Метиленовый синий (контроль)	0	0	1
Липосомы	1400	0	0,7±0,1
Липосомы с низким содержанием ЛПС	1400	23	0,7±0,2
Липосомы с высоким содержанием ЛПС	1400	150	0,7±0,1
Раствор ЛПС	0	150	0,9
* Концентрация до проведения диализа

От проростков пшеницы отделяют целые корни, помещают их в бюксы с исследуемыми растворами и суспензиями. Инкубацию корней проводят двумя способами: а) полностью погружают корни в инкубационные среды и выдерживают 45 мин; б) корни погружают в среду таким образом, чтобы места их срезов оставались над поверхностью исследуемых растворов и суспензий, и выдерживают 24 часа. После инкубации корни тщательно промывают дистиллированной водой, растирают в ступке и экстрагируют 96%-ным этанолом в течение 1 ч. В спиртовом экстракте корней содержание красителя определяют спектрофотометрически при 632 нм, при длине оптического слоя l=1 см. Концентрацию метиленового синего определяют по предварительно построенной калибровочной зависимости оптической плотности от концентрации. Раствором сравнения для экстрактов служит этанольный экстракт корней пшеницы. Результаты опытов представлены в табл.2, из которой видно, что происходит увеличение степени сорбции метиленового синего в зависимости от концентрации ЛПС в липосомах более чем в 2,5 раза,

Таблица 2
Суспензия/Раствор	Концентрация метиленового синего, ppm (от веса корня)
	Инкубация 24 ч	Инкубация 45 мин
Метиленовый синий (контроль)	20±5	8±4
Липосомы	15±6	8±3
Липосомы с низким содержанием ЛПС	20±10	16±6
Липосомы с высоким содержанием ЛПС	54±9	46±5
Раствор ЛПС	9±2	12±5

Наличие ЛПС в липосомах увеличивает не только степень, но и скорость сорбции красителя. Так, за 45 мин из суспензии липосом с высоким содержанием ЛПС на корнях сорбируется 85±9% красителя от максимально возможного количества. В суспензии липосом без ЛПС этот показатель составляет 53±20%. Следует отметить, что количество сорбированных липосом со встроенным ЛПС на корнях не увеличивается после 24 ч инкубации. Таким образом, эффективность доставки увеличивается при использовании ЛПС.

Пример 2. Целевая доставка индолил-3-уксусной кислоты к корням пшеницы.

Состав для доставки индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) к корням растений получают следующим образом. В цитрат-фосфатный буфер (рН 6.0), содержащий ИУК в концентрации 1-100 мг/л, добавляют раствор ЛПС до конечной концентрации 150 мг/л. Затем в полученный раствор добавляют 10%-ный этанольный раствор яичного фосфатидилхолина до его конечной концентрации 1.4 г/л при перемешивании на магнитной мешалке при 500 об/мин. Полученную суспензию озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Недиспергированные фосфолипиды удаляют с помощью центрифугирования (центрифуга К-24, Германия) взвеси в течение 10 мин при 8000 об/мин.

Составы вносят в пробирки с гидропонной комплексной средой в соотношении 1:10, на поверхность гидропонного раствора помещают наклюнувшиеся семена пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29 и выращивают в климатокамере (KTLK 1250, Германия) в течение 2-х недель с режимом: 16-часовой световой период, 25°С. Измеряют длину проростков. Результаты опытов представлены в табл.3.

Таблица 3
Раствор/Суспензия	Средняя длина растения, мм
Гидропонный раствор (контроль)	1456±30
Раствор ИУК, 10 мг/л	1620±10
Липосомы с ЛПС (150 мг/л), и ИУК, 10 мг/л	1697±20

Из данных, представленных в табл.3, видно, что наибольший рост растений наблюдается на гидропонной среде, при обработке липосомами с ЛПС и ИУК, что свидетельствует об эффективности этих микросистем.

Пример 3. Оценка эффективности доставки ИУК липосомами с ЛПС к колеоптилям пшеницы

Готовят липосомы, обогащенные ЛПС и загруженные ИУК, как описано в примере 2.

Препарируют колеоптили пшеницы. Для этого наклюнувшиеся семена пшеницы раскладывают на нержавеющие решеточки в стаканы, которые ставят в термостат при 27°С для выращивания. Проростки при достижении длины колеоптилей 20-22 мм вынимают из термостата, срезают их у основания и измеряют. Отбирают колеоптили, равные по длине, из которых на расстоянии 4 мм от верхнего конца на станочке нарезают отрезки длиной 5 мм. Тупой стеклянной иглой из них удаляют первый настоящий лист. После препарирования отрезки помещают в стаканчики с исследуемыми растворами и суспензиями (табл.4). Стаканчики выдерживают в термостате при 27°С в течение 20 ч. После инкубации длину отрезков колеоптилей измеряют с точностью до 0.5 мм. По разности их длины в суспензиях судят о ростовом эффекте применяемых систем (табл.4).

Таблица 4
Суспензия/раствор	Прирост колеоптилей, (% к исходной длине)
Вода	14±2
Раствор ЛПС, 150 мг/л	12±2
Раствор ИУК,
1 мг/л	48±1
10 мг/л	49±1
100 мг/л	47±2
Липосомы без ЛПС с ИУК, исходная кон-ция ИУК:
1 мг/л	14±1
10 мг/л	14±1
100 мг/л	13±2
Липосомы с ЛПС (150 мг/л) с ИУК исходная кон-ция ИУК:
1 мг/л	50±1
10 мг/л	53±2
100 мг/л	50±1

Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют, во-первых, об отсутствии биологической активности у ЛПС: отмечен практически одинаковый прирост колеоптилей в воде и растворе ЛПС. Во-вторых, показано, что максимальный биологический эффект ИУК проявляет в концентрации 1 мг/л, что подтверждают и литературные данные (Паламарчук И.А., Веселова Т.Д. Учебное пособие по ботпнической гистохимии. - Москва: Изд-во Моск. ун-та, 1965. - 93 с.). Липосомы без ЛПС, загруженные ИУК, не проявляют биологической активности. С другой стороны, применение липосом, инкрустированных ЛПС и загруженных ИУК, приводит к тому же результату, что и использование растворов ИУК.

Необходимо отметить, что количество вещества во внутреннем объеме липосом в суспензиях гораздо меньше, чем в соответствующих растворах ИУК. Т.е. для получения высокого биологического эффекта в случае применения систем доставки (липосом) необходимо использовать значительно меньшее количество биологически активного вещества.

Пример 4. Доставка флуоресцеина натрия (ФН) липосомами к корням пшеницы.

В качестве доставляемого химического вещества используют краситель - флуоресцеин натрия (ФН). Состав готовят на основе липосом, как описано в способе приготовления, проводя инжекцию спиртового раствора яичного фосфатидилхолина в 10^-5 М водный раствор ФН. Затем смесь дезинтегрируют ультразвуком 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Недиспергированные фосфолипиды удаляют с помощью центрифугирования (центрифуга К-24, Германия) взвеси в течение 10 мин при 8000 об/мин. Не включившийся в липосомы краситель удаляют 1 сут. диализом против воды.

От проростков пшеницы отделяют целые корни, помещают их бюксы с растворами и суспензиями (табл.5). Корни погружают в среды таким образом, чтобы места их срезов оставались над поверхностью, и выдерживают 1 ч. Чтобы определить степень сорбции ФН корнями, их размельчают, экстрагируют водой в течение 1 ч, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Отбирают 1 мл супернатанта, смешивают с 5 мл фосфатного буфера рН 8.25 и измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны поглощения 491 нм, эмиссии 512 нм.

Таблица 5
Раствор/Суспензия	Интенсивность флуоресценции
10-5 М водный раствор ФН	2.2
Липосомы с ФН	1095

Из табл.5 видно, что сорбция ФН на корнях пшеницы, после их инкубации с эмульсией липосом примерно в 500 раз выше, чем при инкубации в растворе красителя. Поскольку ранее установлено (примеры 1, 3), что липосомы практически не сорбируются на корнях пшеницы, мы связываем этот результат со встраиванием ФН в липидную мембрану липосом и участием химического вещества в специфическом процессе сорбции на корнях. Подобный результат можно ожидать в случае применения в качестве активного химиката в системах доставки соединения со структурным подобием ФН.

Пример 5. Целевая доставка ФН наночастицами диоксида кремния, обогащенными растительными полисахаридами к корням пшеницы

Состав для направленного транспорта ФН к корням пшеницы на основе наночастиц диоксида кремния готовят следующим образом.

Выделяют растительные полисахариды из биомассы корней пшеницы. Навеску корней пшеницы (10 г) перетирают в ступке. Измельченную биомассу переносят в стакан и для фиксации материала заливают 5-кратным объемом 96% горячего этанола на 5 мин, после чего фиксирующий раствор сливают. Затем к растительной биомассе приливают 80%-ный раствор этанола и выдерживают 20 мин на кипящей водяной бане, периодически помешивая содержимое стеклянной палочкой. Экстракт сливают через фильтр в сухой стакан, процедуру экстракции повторяют еще два раза. Все экстракты объединяют и концентрируют упариванием на водяной бане при температуре 40-50°С до объема 20 мл.

Для разделения полисахаридов используют метод гель-фильтрации на хроматографической колоне (2×50 см), заполненной носителем Sephadex G-75 ("Pharmacia", Швеция), в качестве элюента - пиридин-ацетатный буфер (0,025 М, рН 4,1). Получают полисахариды высокой молекулярной массы (ВПС) и низкой молекулярной массы (НПС).

Получают гидрозоль наночастиц диоксида кремния, как описано в способе приготовления состава. Его разбавляют 10 ^-5 М раствором ФН до конечной концентрации частиц 10 ^-2, 10^-3, 10^-4 г/л и растворами ВПС и НПС до их конечной концентрации 10 ^-1, 10^-2, 10^-3 г/л при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 ч. Полученные составы используют в опытах.

Корни, отделенные от проростков пшеницы, инкубируют в средах (табл.6), оценивают степень сорбции ФН корнями, как описано в примере 4. Результаты экспериментов представлены в табл.6.

Из данных табл.6 видно, что степень сорбции ФН на корнях пшеницы зависит как от концентрации полисахаридов, так и от концентрации наночастиц в гидрозоле. Наибольшая степень сорбции наблюдалется для наночастиц, инкрустированных ВПС и НПС в концентрации 10^-1 г/л, при их содержании в гидрозоле 10^-4 г/л. По сравнению с частицами без полисахаридного покрытия она возрастает в 19.5 раза для ВПС ив 11.3 для НПС. Отмечено, что степень сорбции наночастиц увеличивается с ростом концентрации полисахаридов. Уменьшение степени сорбции частиц при их концентрации в гидрозолях больше 10 ^-4 г/л, видимо, связано с процессом агрегации наночастиц.

Показано, что наночастицы без полисахаридного покрытия также способны сорбироваться корнями пшеницы, но менее эффективно. По сравнению с контролем степень адсорбции ФН в гидрозолях таких частиц увеличивается только в 2.1-2.8 раза. Что касается растворов полисахаридов (без наночастиц), степень адсорбции из них красителя не отличается значимо от контроля. Т.е. в доставке химического вещества к корням растений основную роль играют наночастицы диоксида кремния.

Таблица 6. Интенсивность флуоресценции экстрактов корней после их инкубации в гидрозолях наночастиц диоксида кремния и растворах различного состава
Концентрация полисахаридов, г/л	Концентрация наночастиц, г/л
	10-2	10-3	10 -4	10-5	0
ВПС
10-2	9.1±0.8	23.5±4.3	42.8±6.2	6.5±2.4	3.9±1.1
10 -3	6.6±0.4	8.1±0.9	11.1±1.2	3.2±1.9	2.5±0.8
НПС
10-1	5.7±0.6	9.0±0.9	24.9±3.7	5.6±1.3	4.2±1.4
10 -2	7.1±1.4	7.7±0.2	18.7±0.9	4.3±1.2	3.5±1.2
10-3	6.5±0.4	6.4±0.5	6.8±0.6	4.6±0.6	3.3±0.6
0	6.2±0.9	4.9±0.5	4.7±0.6	5.0±1.3	2.2±0.2

Таким образом, наиболее эффективная сорбция обнаружена для наночастиц, инкрустированных ВПС в концентрации 10^-2 г/л. Это еще раз подтверждает, что специфические детерминанты на поверхности матрицы способствуют целевой доставки микрочастиц к корням растений, в данном случае пшеницы.

Пример 6. Определение размеров микрочастиц

Оценка размера липосом выполнена по спектру мутности суспензий (Безрукова А.Г., О.А. Розенберг // Бюл. эксп. биол. мед. - 1981. - №4. - С.506-507.). В интервале длин волн суспензий 370-500 нм определяют значения их оптической плотности. Строят линейную зависимость IgD от lg , находят волновой экспонент n как тангенс угла наклона прямой. Волновой экспонент зависит от диаметра частиц n(d). По табулированным значениям (Безрукова, Розенберг, 1981) находят среднее значение диаметра частиц. Диаметр используемых липосом составляет 0,1-0,18 мкм.