штамм вируса паротита драгун для получения антигена-компонента тест-системы и иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу паротита

Формула изобретения

1. Штамм вируса паротита Mumps virus для получения антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу паротита, депонированный в коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора под регистрационным номером №VB-05.

2. Иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу паротита, включающая планшет с иммобилизованным очищенным антигеном вируса паротита, инактивированный положительный контрольный образец (К+), инактивированный отрицательный контрольный образец (К-), раствор конъюгата (РК), раствор хромогена (РХ), 25х концентрат фосфатно-солевого буферного раствора (25х ФСБ-Т), раствор для разведения сывороток (PC), стоп-реагент, отличающаяся тем, что в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса паротита тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма по п.1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового штамма вируса паротита Драгун для получения антигена - компонента диагностической тест-системы и тест-система для диагностики антител к вирусу паротита.

Известен штамм вируса паротита Л-3, продуктивность которого составляет не более 8×10⁵ БОЕ/мл (О.G.Andzhaparidzel, Yu.S.Boriskini, N.N.Bogomoloval and V.D.Lotte Accumulation of altered viral nucleocapsids in mumps virus - Persistently infected cell cultures // JOURNAL ARCHIVES OF VIROLOGY PUBLISHER SPRINGER WIEN, 1983, vol.75, N 4, 283-289).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм вируса паротита Эндерс, продуктивность которого составляет не более 10⁶ БОЕ/мл (Fleisner В., Kreth H.W. Mumps Virus Replication in Human Lymphoid Cell Lines and in Peripheral Blood Lymphocytes: Preference for Т Cells. // INFECTION AND IMMUNITY, 1982, vol.35, N 1, p.25-31).

Недостатками выше указанных аналогов является их низкая продуктивность при получении антигена вируса паротита.

Известна отечественная иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу паротита "Паротит-скрин" (разработчик и производитель тест-системы "Паротит-скрин" - ЗАО Биотехнологическая компания "БИОСЕРВИС" (Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу паротита "Паротит-скрин"; Москва, 2001 г.). Указанная тест-система содержит:

- иммуносорбент - полистироловые планшеты для иммунологических реакций, в лунках которых сорбирован антиген вируса паротита (АгВП). АгВП - в рядах планшета А, С, Е, G и контрольный антиген (кАг) - в рядах В, D, F, Н. АгВП представляет собой инфицированные вирусом паротита клетки Vero, содержащие не менее 80% вируссодержащих клеток; кАг представляет собой незараженные клетки Vero;

- положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу паротита;

- отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови человека или сывороточный альбумин человека, не содержащие антител к вирусу паротита;

- конъюгат - антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена;

- субстратная буферная смесь с гидроперитом (БСГ) - для приготовления раствора хромогена;

- хромоген - ортофенилендиамин (ОФД);

- стабилизатор - бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин;

- концентрат фосфатно-солевого буфера для отмывания планшетов и приготовления разведении сывороток и конъюгата.

Однако указанная тест-система (аналог) имеет низкую чувствительность вследствие того, что в ней используют АгВП, представляющий собой неочищенный антиген - инфицированные вирусом паротита клетки Vero (инфицировано не менее 80% клеток).

Наиболее близкой тест-системой (прототипом) является иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу паротита фирмы Wampole Laboratories (Wampole Laboratories mumps IgG ELISA // P/N 6000-29W REV В. - №4, 1996; Jeremy M. et al. Mumps Virus-Specific Antibody Titers from Pre-Vaccine Era Sera: Comparison of the Plaque Reduction Neutralization Assay and Enzyme Immunoassays // J. Clin. MicrobioL, 2005, No.9, vol.43, p.4847-4851). Указанная иммуноферментная тест-система содержит планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса паротита, антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), калибраторы, раствор для разведения образцов; раствор хромогена - тетраметилбензидина (ТМБ), жидкий стоп-реагент, концентрат промывочного буфера.

Однако в указанной тест-системе (прототип) в качестве антигена использован неочищенный NP-белок вируса паротита, вследствие чего тест-система имеет недостаточную чувствительность (не выявляет в сыворотках крови антитела к другим белкам, например гемагглютинин-нейраминидазе - HN, белку слияния - F, матриксному белку - М).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание штамма-продуцента вируса паротита, обладающего более высокой продуктивностью и иммуноферментной тест-системы на его основе для диагностики антител к вирусу паротита с более высокой чувствительностью.

Указанный технический результат достигается созданием нового штамма вируса паротита Драгун для получения антигена-компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу паротита, депонированный в коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора под регистрационным номером №VB-05.

Указанный технический результат достигается также тем, что в иммуноферментной тест-системе для диагностики антител к вирусу паротита, включающей планшет с иммобилизованным очищенным антигеном вируса паротита, инактивированный положительный контрольный образец (К+), инактивированный отрицательный контрольный образец (К-), раствор конъюгата (РК), раствор хромогена (РХ), 25х концентрат фосфатно-солевого буферного раствора (25х ФСБ-Т), раствор для разведения сывороток (PC), стоп-реагент, согласно изобретению в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса паротита тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса паротита Драгун по п.1 формулы изобретения, регистрационный №VB-05.

На чертеже представлен анализ полной нуклеотидной последовательности заявляемого штамма вируса паротита и представлен графически в виде филогенетического дерева. Черным прямоугольником отмечены штаммы, выделенные в России.

Примечание: штаммы, с которыми проводилось сравнение (CRU94Dra=С-генотип, RU-страна, в которой изолят выделен, 94-год выделения, Dra-название штамма-Драгун).

Характеристика заявляемого штамма.

Штамм вируса паротита Драгун относится к семейству вирусов Paramyxoviridae род Rubulavirus. Заявляемый штамм получен в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Министерство здравоохранения Российской Федерации, Кольцово, Новосибирская обл.

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора под регистрационным номером №VB-05, дата регистрации 16 мая 2002 г. (справка о депонировании штамма №0502 прилагается к заявке) и используется для производства антигена при выпуске тест-системы иммуноферментной для определения антител к вирусу паротита «Анти-паротит ИФА».

Источник получения.

Штамм выделен от больного Д. во время вспышки заболевания в 1994 г.в р.п.Кольцово, Новосибирской области. Больной Д. имел плотный контакт с инфекционным больным, у которого был серологически подтвержденный диагноз «эпидемический паротит». Течение инфекции у больного Д. было типичным: заболевание начиналось с повышения температуры до 37,4°С, появления припухлости слюнных желез сначала с одной стороны, а затем с другой. Через 2 суток воспаление слюнных желез исчезло. На основании клинических проявлений и по нарастанию титров противопаротитных антител в парных сыворотках, определенных с помощью РТГА и ИФА, больному Д. был поставлен диагноз - эпидемический паротит. На 3-й день после повышения температуры у больного Д. были взяты образцы крови и носоглоточный смыв. Ватный тампон, которым делался носоглоточный смыв со слизистой носоглотки больного Д., был помещен в 1 мл среды ДМЭМ, содержащей антибиотики и после стерилизации через фильтры 0.45 мкм был помещен в культуральный сосуд (кубарик, 75 см³) с монослоем клеток Vero. Клетки Vero были получены из Института клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». В качестве питательной среды использовали среду ДМЭМ (производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФСКРС), 2 ммоль/л глютамина и антибиотиков: 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина. При визуальном контроле под микроскопом на 3 сутки инкубирования при плюс 37°С было обнаружено изменение морфологии клеток. На 4 сутки - было зарегистрировано появление симпластов. На 5-6 сутки наблюдалось разрушение симпластов (ЦПД). На 6 сутки культуральный сосуд помещали на минус 20°С, затем производили оттаивание культуральной вируссодержащей жидкости (КВЖ). Полученную смесь КВЖ и лизата клеток Vero расфасовывали и одну часть стока, лиофилизировали, а другую - хранили при минус 70°С.

Подлинность штамма.

Из образца носоглоточного смыва больного Д с помощью набора RNaidTM PLUS (ф. "BIO 101", США) была выделена суммарная РНК. С использованием набора AmpliTaq (ф. "Elmer Perkin", США) проведена цепная полимеразная реакция (ПЦР). Для проведения реакции были использованы праймеры на SH ген вируса паротита (SH1F - AGT AGT GTC GAT GAT СТС AT, SH2R - GCT САА GCC TTG АТС АТТ GA). ПЦР была положительна, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце смыва с носоглотки больного Д.

Проведен сиквенс полного генома выделенного изолята. Анализ полной нуклеотидной последовательности заявляемого штамма вируса паротита проведен со всеми доступными полными нуклеотидными последовательностями штаммов вируса паротита, помещенными в GebBank (http://www.ncbi.nlia.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar) и показан на рисунке фиг.1 в виде филогенетического дерева. Из чертежа видно, что заявляемый штамм отличается генетически от известных штаммов вируса паротита.

Генотип штамма.

Генотип С [Номер депонированной последовательности в GebBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar) - AY 669145].

Культуральные свойства. Штамм Драгун при культивировании на монослое клеток Vero вызывает образование симпластов на 4-6 сутки (температура культивирования 37°С). Максимальные титры вируса достигали на 5-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero и составляли 8.6×10 ⁷ БОЕ/мл. Продуктивность: из 3 литров КВЖ получается 24 мг антигена для ИФА. Использование полученного из штамма Драгун антигена - 0.2-0.4 мкг/лунку позволяет выявлять противопаротитные антитела в сыворотках вакцинированных и больных эпидемическим паротитом людей методом ИФА.

Антигенные свойства.

Выявляет антитела к вирусу паротита в сыворотках больных и вакцинированных людей. Выделенный штамм имеет серологический перекрест с референс-штаммом Эндерс и вакцинным штаммом Л-3.

Патогенность для человека. По клиническим признакам заболевания у больного, от которого был выделен штамм Драгун (температура - 37,8°С, воспаление слюнных желез исчезло на 2 сут после появления, после заболевания осложнений не зарегистрировано), можно считать, что штамм Драгун не является высокопатогенным. Штамма Драгун не является фито- и зоопатогенным.

Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствор желатина и сахарозы.

Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ ×2АВК, ДМЭМ, содержащие 2-5% фетальной сыворотки КРС, 2 ммоль/л глютамина и антибиотиков: 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Изучение серологических свойств полученного штамма (Драгун) выявило существенное сходство с референс-штаммом - Эндерс (прототип) вируса паротита и с вакцинным штаммом Л-3. Полученные от иммунизированных мышей линии BALB/c антисыворотки к референс-штамму Эндерс, к вакцинному штамму Л-3 и к заявляемому штамму Драгун, выделенному от больного, были исследованы в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Macaco, mulatta, и в реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты изучения перекреста между полученными сыворотками представлены в таблице 1. Как видно из результатов таблицы 1, сыворотка от всех мышей, иммунизированных вирусом паротита штамм Эндерс, реагировала как с вирусами паротита штамм Эндерс и Л-3, так и со штаммом Драгун. С другой стороны, сыворотки от всех мышей, иммунизированных заявляемым штаммом Драгун, выделенном при вспышке эпидемического паротита в 1994 году, реагировали как с самим вирусом, так и с референс штаммом Эндерс и с вакцинным штаммом Л-3. Исходя из полученных результатов можно заключить, что заявляемый штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эндерс и к вакцинному штамму Л-3.

Таблица 1. Изучение антигенных свойств вируса паротита штамм Драгун
Специфичность сыворотки	N сыворотки		Антиген/реакция/титр антител
		штамм Эндерс	РТГА			ИФА
			штамм Л-3	штамм Драгун	штамм Эндерс	штамм Л-3	Штамм Драгун
Сыворотка	1	1:256	1:128	1:128	1:640	1:320	1:640
против вируса	2	1:128	1:64	1:128	1:640	1:160	1:320
паротита штамм	3	1:128	1:64	1:128	1:640	1:160	1:320
Эндерс	4	1:128	1:64	1:128	1:640	1:160	1:320
	5	1:64	1:64	1:64	1:320	1:80	1:320
	6	1:64	1:64	1:32	1:160	1:80	1:160
Сыворотка	1	1:16	1:32	1:32	1:160	1:160	1:320
против вируса	2	1:16	1:32	1:16	1:80	1:160	1:320
паротита штамм	3	1:16	1:32	1:16	1:80	1:160	1:320
Л-3	4	1:16	1:32	1:16	1:80	1:160	1:320
	5	1:8	1:32	1:16	1:80	1:160	1:320
	6	1:8	1:32	1:8	1:40	1:80	1:160
Сыворотка	1	1:64	1:64	1:128	1:320	1:160	1:1280
против выделенного	2	1:64	1:32	1:128	1:320	1:160	1:640
штамма	3	1:64	1:16	1:128	1:320	1:160	1:640
Драгун	4	1:64	1:16	1:128	1:160	1:80	1:640
	5	1:32	1:16	1:128	1:160	1:80	1:320
	6	1:32	1:16	1:64	1:160	1:40	1:320

Пример 1. Способ получения антигена вируса паротита

Очищенный и инактивированный антиген вируса паротита используют для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Получение вируссодержащей жидкости.

Исходные клетки Vero хранят в жидком азоте и выращивают путем серийных пересевов. В качестве ростовой среды используют раствор Игла MEM с 8-10% эмбриональной сыворотки КРС.

Культуру клеток выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации клеток 5-10×10 ⁵ кл/мл среды и пересевают общепринятым способом.

Вирусом паротита (штамм Драгун) заражают 1-литровые матрасы с монослоем культуры клеток Vero (множественность заражения 1:10). После инкубации при 20-25°С в течение 40 минут в 1-литровый культуральный сосуд приливают 200 мл питательной ДМЭМ с добавлением (4,0±0,1) мл сыворотки крупного рогатого скота, 0.001%-трипсина, 100 ед/мл бензилпеницилина и 100 нг/мл стрептомицина и после инкубации в течение 5-7 суток при (36±1)°С сливают питательную среду. Титр вируса в КВЖ - не менее 10 ⁸ БОЕ/мл.

Получение лизата клеток Vero.

При культивировании переход вируса из клетки в клетку осуществляется за счет образования симпластов без выхода основного количества вируса в культуральную вируссодержащую жидкость (КВЖ), поэтому накопление вируса происходит как в КВЖ, так и внутри клеток. В 1-литровый культуральный сосуд добавляют 5-7 мл 0.01 М Трис HCl, рН=9.0. Клетки разрушают двукратным замораживанием-оттаиванием для выхода вируса из клеток. Клеточный лизат освобождают от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием в роторе JA-10 центрифуги J2-21 (ф. «Beckman», США) при 1500 об/мин в течение 10 мин при температуре+4°С.Титр вируса в лизате клеток составляет от 6×10⁴ 3×10⁶ БОЕ/мл.

Проведение ультрафильтрации.

Концентрирование и очистку вируса паротита из КВЖ проводят на мембранах "Владипор" типа УАМ-100 (Россия) или РТНК 0005 (ф. «Millipore», США). Линейная скорость подачи КВЖ на ячейку должна быть равна 0.6 л/мин. Давление на выходе должно быть не более 2.5 кг/см² , давление на входе не должно превышать давление на выходе более чем на 0,4 кг/см². Конечный продукт представляет собой КВЖ, сконцентрированную в 20-25 раз, освобожденную от низкомолекулярных соединений и клеточного детрита. Титр вируса паротита Драгун в концентрате не менее 10⁹ БОЕ/мл, что выше на 2-3 порядка по сравнению с известными аналогами (штаммы Эндерс и Л-3).

Ультрацентрифугирование вируссодержащего материала.

Осаждение вируса. Антиген для ИФА получают из двух источников: из концентрата КВЖ и из лизата клеток после размораживания.

На первом этапе вирус осаждают через «подушку» 10%-ной сахарозы в роторе SW 28 центрифуги L-8-70 (ф. «Beckman», США). Для этого в пробирки ротора осторожно наливают 5 мл 10%-ной сахарозы и сверху наслаивают 30 мл концентрата КВЖ или лизата клеток. Осаждение вируса проводят при 25000 об/мин, 4°С, 10 часов. Надосадочную жидкость осторожно отбирают пипеткой, а осадок растворяют в 0.5-1.0 мл NTE-буфера (0.1 М NaCl, 0.01 М Трис HCl, 0.001 М ЭДТА, рН=7.6).

Очистка антигена вируса паротита. Антиген для ИФА очищают от чужеродных белков ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Осадки из всех пробирок (осадки из концентрата КВЖ и лизата клеток) объединяют, проводят обработку на ультразвуковом дезинтеграторе при 6000 Гц 3 раза по 10 сек и наслаивают на градиент раствора 20-60%-ной сахарозы. Для приготовления линейного градиента раствора сахарозы используют смеситель, состоящий из двух камер, которые можно изолировать перекрыванием крана между ними. Одну из камер (первую) соединяют гибким шлангом с перистальтическим насосом. Шланг, выходящий из насоса, опускают в пробирку вместимостью 12 мл таким образом, чтобы он касался стенки пробирки в верхней ее части. Смеситель устанавливают на магнитную мешалку. В первую камеру помещают якорек. Смеситель заполняют при закрытом кране следующим образом: в первую камеру наливают 4,5 мл 60%-ного раствора сахарозы, во вторую 4,5 мл 20%-ного раствора сахарозы. Затем включают магнитную мешалку, перистальтический насос и осторожно открывают кран между камерами. Раствор из второй камеры поступает в первую, перемешивается и через насос поступает в пробирку. Общий объем приготовленного линейного градиента (20-60%) составляет 9 мл в каждой пробирке.

Осажденный антиген вируса паротита осторожно наслаивают с помощью шприца с толстой иглой на линейный градиент сахарозы 20-60% в стаканы ротора SW-41 центрифуги Beckman L-8-70. Режим центрифугирования - 37000 об/мин при 4-6°С в течение 8 час. Полосу на уровне 42-45%-ной сахарозы осторожно отбирают шприцом с толстой иглой и после определения чистоты антигена методом электрофореза и определения концентрации антигена по белку используют для проведения ИФА.

Выход пригодного для ИФА антигена с 3 л КВЖ и лизата клеток составляет 24 мг по белку.

Стадия инактивации вируса: очищенный в градиенте плотности сахарозы антиген вируса паротита инактивируют прогреванием при 56°С в течение 30 мин (Жданов В.М., Гайдамович С.Я. Вирусология. М.: Медицина, 1966 г, с.382).

Пример 2. Состав тест-системы

Состав компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу паротита (Анти-паротит ИФА), которая представляет собой набор реагентов:

- иммуносорбент - планшет 96-луночный для иммунологических реакций по ТУ 64-2-375-86 или планшет разборный типа "Nunc", Дания или аналогичные с иммобилизованным очищенным антигеном вируса паротита;

- инактивированный положительный контрольный образец (К+)* - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу паротита, инактивированная прогреванием, и краситель нейтральный красный по ТУ 6-09-3070-84;

- инактивированный отрицательный контрольный образец (К-)* - сыворотка крови здоровых доноров не содержащая антител к вирусу паротита;

- раствор конъюгата (РК) - моноклональные антитела мыши против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена по ТУ 6-09-10-1408-79;

- раствор хромогена (РХ) - тетраметилбензидина (ТМБ);

- 25х концентрат фосфатно-солевого буферного раствора (25х ФСБ-Т) **;

- раствор для разведения сывороток (PC) - однократный раствор ФСБ-Т, содержащий концентрат блокирующего раствора (КБР)*** в разведении 1:100;

- стоп-реагент серная кислота по ГОСТ 4204-77 с концентрацией 0,9 моль/л;

Набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контроли.

Примечание:

*Консервант - мертиолят натрия "Сигма" (США) содержится в К+, К- и РК, в концентрации 0,01%; К+и К- содержат антибиотик-гентамицина сульфат по ВФС 42-2626-89 в концентрации 1 мг/мл.

** Состав 1 л 25х ФСБ-Т

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный
ГОСТ 4172-76	90,0 г
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный
по ГОСТ 245-76	4,75 г
Натрий хлористый ГОСТ 245-76	22,0 г
Твин-20 "Сигма", США	12,5 мл

Соли последовательно растворяют при перемешивании в 0,9 л дистиллированной воды при температуре 40-50°С, рН 7,5±0,3, коррекцию проводят как описано выше. Объем раствора доводят до 1 л, добавляют твин-20 и перемешивают.

*** Состав 100 мл КБР

Очищенные от детрита центрифугированием
растворенные в питательной среде в концентрации
5,0 мг/мл белки клеточной культуры,
использованной для заражения вирусом паротита
при его наработке	10,0 мл
Мертиолят натрия "Сигма" (США)	10 мг
Фосфатно-солевой раствор без твина	90 мл

Пример 3. Состав и методика применения коммерческой тест-системы "Анти-паротит ИФА"

1. Состав набора

1. Иммуносорбент - планшет с иммобилизованным очищенным антигеном вируса паротита - 1 планшет (разборный);

2. Инактивированный положительный контрольный образец (К+), жидкий, красного цвета - 1 флакон объемом 2,0 мл;

3. Инактивированный отрицательный контрольный образец (К-), жидкий, желтого цвета - 1 флакон объемом 3,0 мл;

4. Раствор конъюгата (РК), жидкий, зеленого цвета - 1 флакон объемом 12 мл;

5. Раствор хромогена (РХ) - тетраметилбензидина (ТМБ), жидкий, бесцветный, прозрачный раствор - 1 флакон объемом 13 мл;

6. 25х концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (25х ФСБ-Т), жидкий, бесцветный, прозрачный, слегка опалесцирующий раствор - 1 флакон объемом 26 мл;

7. Раствор для разведения сывороток (PC), жидкий, бесцветный, прозрачный, слегка опалесцирующий раствор - 1 флакон объемом 12 мл;

8. Стоп-реагент, прозрачная бесцветная жидкость - 1 флакон объемом 6 мл.

2. Проведение иммуноферментного анализа

Очищенный антиген (вирус паротита штамм Драгун) разводят в карбонатном буфере (рН=9,7) до концентрации 8 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора антигена в лунки 96 луночного планшета. Адсорбцию антигена проводят при 20±1°С в течение 16-20 часов. После инкубации из планшета удаляют неиммобилизованный антиген и вносят блокирующий раствор (5% сахароза, 2,5% пептон из казеина и 0,5% азид натрия в очищенной воде), при этом в каждую лунку планшета вносят объем раствора не менее 200 мкл. Блокировку планшета проводят при 27±1°C в течение 2-3 часов. Затем содержимое лунок удаляют вытряхиванием и отхлопыванием планшета. Сушка производится при 27±1°С в течение 3 часов. Планшет с сорбированным антигеном вируса паротита (иммуносорбент) запаивают в пакет при пониженном давлении или с силикагелем. Для определения титра противокоревых антител сыворотки раститровываются в лунках по вертикали во вспомогательном 96-ти луночном планшете. Во все лунки вспомогательного планшета (кроме 1-го ряда - лунки с А-1 по А-11) вносят по 130 мкл PC. Во все лунки ряда А, начиная с лунки "А-1" (лунки 1-11), вносят по 225 мкл р-ра PC. Последний (12-ый ряд) планшета используется для контролей. Затем во все лунки ряда А, начиная с лунки "А-1" (лунки 1-11), вносят по 25 мкл испытуемых сывороток и раститровывают их каждую по своему ряду с шагом разведений 1:2. Например, из лунки А-1 отбирают 130 мкл испытуемой сыворотки в разведении 1:10 и переносят в лунку "В-1", тщательно пипетируют, отбирают 130 мкл и переносят в лунку "С-1". Процедуру повторяют и переносят 130 мкл в лунку "D-1" и так далее до лунки "Н-1". Аналогичным образом в лунках ряда 2 (от лунки "А-2" до лунки "Н-2") раститровывается следующая испытуемая сыворотка и так далее, до лунок 11-го ряда. Последний (12-ый ряд) планшета используется для контролей. Таким образом, в планшете можно раститровать до 11 сывороток. Все разведения сывороток (100 мкл) из вспомогательного планшета переносятся в соответствующие лунки планшета с иммобилизованным антигеном вируса паротита. В лунки А-12 и В-12 вносят К+объемом по 100 мкл, в лунки С-12 и D-12 вносят СОП объемом по 100 мкл, в лунки Е-12 и F-12 вносят К- объемом по 100 мкл, в лунки G-12 и Н-12 вносят ФСБ-Т объемом по 100 мкл для контроля конъюгата. Затем планшет закрывают крышкой или клейкой лентой и инкубируют 30 мин при температуре (37±1)°С. После пятикратной промывки ФСБ-Т и удаления влаги в каждую лунку вносят РК объемом по 100 мкл. Планшет закрывают и инкубируют 30 мин при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации планшет пятикратно промывают ФСБ-Т и удаляют остатки влаги из планшета. Далее в каждую лунку планшета вносят РХ объемом по 100 мкл. Планшет закрывают крышкой и помещают на 20 мин в защищенное от света место при температуре 20-25°С. Реакцию останавливают внесением стоп-реагента по 50 мкл в каждую лунку планшета.

3. Учет результатов

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Результаты учитывают только в том случае, если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (К Кг) не превышает 0,100, в лунках с К- среднее значение ОП(ОП К- ср) не более 0,200, а в лунках с К+ среднее значение ОП(ОП К+ ср) не менее чем в 4 раза превышает ОП К- ср.

Наименьшее положительное значение ОПкрит. рассчитывают по формуле:

ОПкрит.=0,2+ОП К- ср

Результаты теста считаются положительными, если ОП анализируемой сыворотки больше ОПкрит.При определении титра антител к вирусу паротита в сыворотке титром следует считать последнее разведение исследуемой сыворотки, значение ОП в которой превышает значение ОПкрит.

Тест-систему "Анти-паротит ИФА" выпускают в виде набора, упакованного в полистироловую или картонную коробку. Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контроли.

Примеры использования тест-системы "Анти-паротит ИФА" в клинической практике

Пример 4. Во время спорадических случаев заболеваемости эпидемическим паротитом в Новосибирской области от больных с клиническим диагнозом эпидемический паротит на 5-8 сутки и через 3 недели забирали кровь и получали сыворотку. Начиная с 2001 года, эта работа проводилась в рамках приказов Управления здравоохранения Новосибирской области. Сыворотки анализировали тремя различными методами - иммуноферментным анализом (ИФА), реакцией торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцией нейтрализации на культуре клеток Vero (PH). ИФА проводили с использованием тест-систем ЗАО "Биосервис" (Москва), Wampole (США), Boehringer Mannheim (Германия), Human (Германия) и испытуемой тест-системы «Анти-Паротит ИФА», производства ЗАО «МБС» Новосибирск, основным компонентом которой является очищенный антиген вируса паротита штамм Драгун.

Всего за период 1997-2005 гг. указанными методами было проанализировано 18 парных сывороток от людей с клиническим диагнозом эпидемический паротит с целью серологического подтверждения клинического диагноза. Окончательный диагноз «эпидемический паротит» ставился после проведения ПЦР со специфическими праймерами на SH ген вируса паротита.

У всех 18 больных было отмечено как минимум 4-кратное нарастание специфических антител, определенное методами РТГА и PH. Следует отметить, что при определении титра антител в сыворотках крови больных с клиническим диагнозом эпидемический паротит методом PH в 4-х сыворотках не было зарегистрировано 4-кратного нарастания специфических антител.

У всех 18 больных в забранных образцах с помощью ИФА тест-систем Wampole (США), Boehringer Mannheim (Германия), Human (Германия) было зарегистрировано нарастание антител к вирусу паротита.

При определении титра антител в сыворотках крови больных с клиническим диагнозом «эпидемический паротит» с помощью тест-системы производства ЗАО "Биосервис" (Москва) в 3-х сыворотках не было зарегистрировано 4-кратного нарастания специфических антител.

У всех 18 больных с помощью тест-системы "Анти-паротит ИФА" было зарегистрировано как минимум 4-кратное нарастание антител к вирусу паротита.

У всех 18 больных методом ПЦР была обнаружена РНК вируса паротита.

Таким образом, тест-система "Анти-паротит ИФА" может быть использована для определения специфических антител в парных сыворотках, полученных от больных, и таким образом для определения, снятия или подтверждения диагноза при протекании заболевания с клиническими проявлениями, характерными для эпидемического паротита.

Пример 4.2. В период с 1996 по 2004 годы в Новосибирской области проводились работы по изучению титра специфических антител к вирусу паротита в сыворотках крови детей возраста 6 лет перед проведением второй вакцинации против паротита. Для этого у детей перед вакцинацией забирали 5 мл крови и получали сыворотку. Сыворотки на наличие антител к вирусу паротита анализировали тремя различными методами - иммуноферментным анализом (ИФА), реакцией торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцией нейтрализации на культуре клеток Vero (PH). ИФА проводили с использованием тест-систем ЗАО "Биосервис" (Москва), Wampole (США), Boehringer Mannheim (Германия), Human (Германия) и испытуемой тест-системы «Анти-Паротит ИФА», производства ЗАО «МБС» Новосибирск, основным компонентом которой является очищенный антиген вируса паротита штамм Драгун. Всего за указанный период было изучено 254 сыворотки. Из 254 сывороток 12 сывороток имели титры антител против вируса паротита <1:4 в РТГА и <1:4 в PH и могут считаться отрицательными, остальные 242 сыворотки были положительными при изучении в РТГА и РН. Эти же 12 отрицательных сывороток дали отрицательный результат в ИФА на тест-системах всех указанных производителей.

Результаты сравнения показывают, что с помощью метода иммуноферментного анализа с помощью тест-системы производства ЗАО "Биосервис" (Москва) специфические антитела определялись в 240 сыворотках из общего количества сывороток (242 сыворотки), в которых были найдены противопаротитные антитела с помощью методов РТГА и РН.

С помощью ИФА тест-системы производства Wampole (США) специфические антитела определялись в 240 сыворотках из общего количества сывороток (242 сыворотки), в которых были найдены противопаротитные антитела с помощью методов РТГА и РН.

С помощью ИФА тест-системы производства Boehringer Mannheim (Германия) специфические антитела определялись в 241 сыворотке из общего количества сывороток (242 сыворотки), в которых были найдены противопаротитные антитела с помощью методов РТГА и РН.

С помощью ИФА тест-системы производства Human (Германия) специфические антитела определялись в 240 сыворотках из общего количества сывороток (242 сыворотки), в которых были найдены противопаротитные антитела с помощью методов РТГА и РН.

С помощью заявляемой ИФА тест-системы «Анти-Паротит ИФА» производства ЗАО «МБС» Новосибирск специфические антитела определялись во всех 242, в которых были найдены противопаротитные антитела с помощью методов РТГА и РН.

Таким образом, наибольший процент совпадения выявляемости положительных и отрицательных сывороток был получен при использовании ИФА тест-систем Boehringer Mannheim (Германия) и «Анти-Паротит ИФА» производства ЗАО «МБС» Новосибирск (99.5% и 100% соответственно).

Средние арифметические величины титров антител при использовании тест-систем на основе метода ИФА (в том числе и исследуемой тест-системы «Анти-Паротит ИФА» производства ЗАО «МБС» Новосибирск) также были выше, чем в РТГА и РН (1:146, 1:37 и 1:52, соответственно).

Таким образом, титр заявляемого штамма вируса паротита Драгун выше на 2-3 порядка по сравнению с известными аналогами и, таким образом, на этапах получения антигена выше его продуктивность по антигену.

Кроме того, заявляемая ИФА тест-система "Анти-паротит ИФА" имеет более высокую чувствительность по сравнению со многими известными аналогами и рекомендуется к использованию для определения напряженности индивидуального иммунитета к заболеванию «эпидемический паротит».