средство, обладающее противоопухолевым действием, и способ его получения

Формула изобретения

1. Средство, обладающее противоопухолевым действием, содержащее в качестве активного вещества 7-(диэтиламидо)-этилтионфосфат 2,3-дигидрокверцетина.

2. Способ получения 7-(диэтиламидо)-этилтионфосфат 2,3-дигидрокверцетина, заключающийся в том, что дигидрокверцетин подвергают взаимодействию с тетраэтилдиамидоэтилфосфитом при комнатной температуре в среде диоксана с последующим добавлением порошковой серы, перемешиванием, удалением диоксана, добавлением бензола и высаживанием целевого продукта гексаном.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным средствам, обладающим противоопухолевым действием, и касается конкретно производного дигидрокверцетина (таксифолина).

Исходное вещество - флавоноид дигидрокверцетин (ДГК) обладает ярко выраженной Р-витаминозной активностью, проявляет антиоксидантное и антирадикальное действие, является капилляропротектором (1,2). Показано, что некоторые органические производные на базе ДГК (гамма-пирроны) оказывают противовоспалительное, радиозащитное, антигистаминное действие (3). Опубликованы исследования о способности таксифолина регулировать ферментные системы организма, а именно эндоцитоз и активность лизосомальных ферментов (4). При этом флафоноиды, в частности ДГК, проявляют низкую мутагенную активность и токсичность (5). Однако в научной литературе не представлены достоверные данные о способности ДГК прямо влиять на рост опухолевых клеток. Таким образом, ДГК не является соединением с противоопухолевой активностью.

Известно, что фосфорилирование природных соединений, таких как углеводы, липиды, нуклеозиды, приводит к усилению и расширению спектра биологического действия, в том числе появлению антипролиферативных свойств (6). Поэтому мы использовали фосфорилирование ДГК для получения соединений с противоопухолевой активностью.

Задача настоящего изобретения - создание нового оригинального отечественного противоопухолевого средства на основе структурного аналога ДКГ с низкой токсичностью.

Поставленная задача решается тем, что предложено средство на основе ДГК, обладающее противоопухолевым действием, характеризующееся выполнением в виде однородного порошка желтого цвета, содержащего в качестве активного вещества 7-(диэтиламидо)-этилтионфосфат 2,3 дигидрокверцетина (ДГК-p-S) в количестве 98% на 1 г вещества.

Методически поставленная задача решается тем, что молекула нецитотоксичного ДГК используется в качестве носителя активных цитотоксических групп, конкретно, фосфорсодержащих фармакофорных групп.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению, относящемуся к способу получения органических производных ДГК, является способ получения ацетатов ДГК (7).

Способ получения ацетатов заключается в обработке ДГК уксусным ангидридом в среде пиридина с последующим удалением уксусной кислоты и пиридина промыванием ледяной дистиллированной водой. Недостатком данного способа является использование пиридина и большого количества воды для удаления уксусной кислоты и следов пиридина. Кроме того, описанные ацетаты ДГК не обладают противоопухолевой активностью.

Общая схема получения фосфорилированных производных ДГК

Избирательное фосфорилирование ДГК проводили амидоэфирами фосфористой кислоты по гидроксильной группе, которая обладает наибольшей кислотностью и находится в седьмом положении флавоноида.

Синтез проводят в растворе диоксана при температуре 20°С в течение 1,5-2 часов. Затем к реакционной смеси добавляют 0.1 г порошковой серы и перемешивают в течение 1-2 часов. Растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в бензоле, целевой продукт высаживают гексаном и сушат в условиях вакуума.

Синтез проводят в растворе диоксана при температуре 20°С в течение 1,5-2 часов. Затем к реакционной смеси добавляют 0,1 г порошковой серы и перемешивают в течение 1-2 часов. Растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в бензоле, целевой продукт высаживают гексаном и сушат в условиях вакуума. Данный способ позволяет получать фосфорилированные производные ДГК с высоким выходом 83% и высокой степенью чистоты 98% на 1 г вещества.

Таким образом, была осуществлена химическая трансформация доступного природного биофлавоноида и синтезированы шесть фосфорилированных производных ДГК:

1. 7-неопентиленфосфат дигидрокверцетина (ДГК-1)

2. 7-неопентилентионфосфат дигидрокверцетина (ДГК-2)

3. 7-неопентиленселенонфосфат дигидрокверцетина (ДГК-3)

4. 7-(диэтиламидо)-этилселенонфосфат дигидрокверцетина (ДГК-4)

5. 7-(диэтиламидо)-бутилтионфосфат дигидрокверцетина (ДГК-5)

6. 7-(диэтиламидо)-этилтионфосфат 2,3 дигидрокверцетина (ДГК-p-S)

Сущность способа поясняется конкретным вариантом проведения синтеза ДГК-p-S.

Пример 1

К 1 г сухого ДГК растворенного в 30 мл абсолютного диоксана добавляют 0.72 г тетраэтилдиамидоэтилфосфита в 5 мл абсолютного диоксана и перемешивают при температуре 20°С в течение 1,5-2 часов, а затем к реакционной смеси добавляют 0.1 г порошковой серы и перемешивают в течение 2 часов. Диоксан удаляют в вакууме, остаток растворяют в 50 мл бензола, фильтруют и целевой продукт (ДГК-p-S) высаживают гексаном (200 мл) и сушат светло-желтый порошок в вакууме при 40°С. Получают 1.31 г (ДГК-p-S). Выход: 83%. Т пл. 67-68°С, ³¹Р-ЯМР 70.3 м.д., Rf 0.45 система бензол:диоксан 3:1. Найдено в %: С, 52.00; Н, 5.40; N 2.90. C₂₁ H ₂₆ О₈ NSP. Вычислено в %: С - 51,96; Н - 5,62; N - 2,88.

В опытах в качестве объектов исследования использовали линии опухолевых клеток человека - карциному яичника CaOv и Т-лимфому Jurkat. Клеточные культуры выращивали в среде RPMI1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка. Цитотоксическую активность препаратов оценивали по способности соединений подавлять пролиферацию опухолевых клеток. Цитотоксическую активность оценивали с помощью стандартного МТТ-теста с использованием МТТ-реагента (3,4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид). Метод основан на способности дегидрогеназ живых, метаболически активных клеток восстанавливать МТТ-реагент до голубых нерастворимых кристаллов формазана. Эксперименты выполнены с использованием 96-луночных микропланшет. В каждую лунку помещали 20000 клеток линии CaOv или 30000 клеток Т-лимфомы линии Jurkat в 180 мкл готовой питательной среды и выращивали в течение 24 часов при 37°С и 5% содержании CO₂. Через 24 часа в лунки вносили исследуемые соединения в определенных концентрациях в объеме 20 мкл и инкубировали далее 48 часов при тех же условиях. Затем добавляли МТТ-реагент в объеме 20 мкл в конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали далее в течение 2 часов в условиях, указанных выше. Выпавшие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 20 минут при 37°С. Оптическое поглощение окрашенных растворов ДМСО измеряли на счетчике оптического поглощения Titertek Multiskan MCC/340 при длине волны 540 нм. Оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана пропорционально количеству живых клеток в пробе. Результаты оценивали по отношению к контрольным пробам (без исследуемых соединений). Ингибирование пролиферации клеток (ИК) в опытных лунках определяли по формуле ИК %=(1-П _о/П_К)×100, где П _о - оптическое поглощение в опыте, П_К - оптическое поглощение в контроле. Соединение считали активным, если концентрация 100 мкМ вызывала подавление роста клеток линии CaOv или Jurkat не менее 50% (ингибирующая 50% концентрация - ИК₅₀<100 мкг/мл). Ошибка измерений не превышала 5%.

Исследование противоопухолевой активности

Противоопухолевую активность оценивали in vivo на перевиваемых опухолях мышей-гибридов первого поколения BDF ₁ (С₅₇В1/6×DBA/ ₂) массой 18-25 гр. Животных получали из отдела экспериментальных животных ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Животных содержали в виварии на обычном рационе питания.

Противоопухолевое действие изучали на перевиваемых опухолях мышей, входящих в число обязательных моделей опухолей животных, которые используются при отборе новых противоопухолевых веществ - лимфоцитарной лейкемии Р-388, аденокарциноме Са-755 и эпидермоидной карциноме легкого Льюис (LLC).

Лимфоцитарная лейкемия Р-388

Опухоль перевивали мышам-гибридам BDF ₁ внутрибрюшинно асцитной жидкостью по 10 ⁶ клеток при разведении в среде 199. Критерием оценки терапевтического эффекта являлось увеличение продолжительности жизни леченных животных (УПЖ, %) по сравнению с контрольными животными.

Аденокарцинома молочной железы Са-755

Для перевивки опухолевую ткань измельчали ножницами до гомогенной консистенции, добавляли среду 199 до соотношения 1:10 и 0,5 мл полученной суспензии, что составляет приблизительно 50 мг опухолевой массы, вводили подкожно в область правой подмышечной впадины самкам мышей BDF ₁. Штамм поддерживали на мышах-самках линии С ₅₇В1/6. Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (ТРО,%). Наблюдение за мышами проводили до их гибели для оценки противоопухолевого эффекта по критерию УПЖ.

Эпидермоидная карцинома легких Льюис (LLC)

Опухоли перевивали самцам мышей BDF1 подкожно в правую подмышечную область по 0,5 мл взвеси опухолевых клеток в разведении 1:10 в среде 199. Эффективность лечения LLC оценивали по ТРО и УПЖ.

Критерии оценки противоопухолевого эффекта:

1. TPO

Проводится измерение трех максимальных взаимно перпендикулярных размеров опухоли (длина, ширина, высота) у каждого животного и вычисляется ее объем, а затем средний объем опухоли в группе. Измерение объема опухоли проводили каждые 3 дня, начиная с 7 дня опыта, когда опухоли в контроле становятся измеримыми.

V (мм³)=L×S×Н

Торможение роста опухоли вычисляется по формуле:

ТРО(%)=(Vк-Vo)/Vк×100,

где Vк - средний объем опухолей в контрольной группе (мм ³)

Vo - средний объем опухолей в опытной группе (мм ³)

2. УПЖ

Сравнительная оценка противоопухолевого эффекта по продолжительности жизни опытных и контрольных животных проводилась после гибели всех животных от опухолевого процесса. Затем определялась средняя продолжительность жизни (СПЖ, дни) в опытной и контрольной группах. УПЖ вычисляли по формуле:

УПЖ(%)=(СПЖо-СПЖк)/СПЖк×100,

где СПЖк - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе(дни)

СПЖо - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе (дни)

Минимальные критерии активности ТРО 50% и УПЖ 25%.

Токсичность препарата оценивали по ранней гибели мышей по сравнению с гибелью контрольных животных и состоянию внутренних органов животных (селезенка, легкие, наличие метастазов в легких), изменению массы тела по отношению к исходной.

ДГК-p-S растворяли в ДМСО и разводили физиологическим раствором, чтобы концентрация ДМСО составляла не более 10%. Соединение вводили ежедневно внутрибрюшинно в течение 5 дней в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 125 мг/кг и 150 мг/кг.

Лечение начинали через 48 часов после перевивки солидных опухолей (Са-755 и LLC) и через 24 часа после перевивки Р-388.

Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента-Фишера. Статистически значимым терапевтический эффект считали при p 0,05.

Пример 2

Цитотоксическая активность производных ДГК на опухолевых клетках человека in vitro

Таблица 1 Цитотоксический эффект производных ДГК в концентрации 100 мкМ на клетках линии CaOv
№№	Шифр соединения	Ингибирование пролиферации клеток, %	ИК50, мкМ
1	ДГК-1	0
2	ДГК-2	0
3	ДГК-3	0
4	ДГК-4	0
5	ДГК-5	0
6	ДГК-p-S	83,9	50
7	ДГК	0

Таблица 2 Цитотоксический эффект производных ДГК в концентрации 100 мкМ на клетках Т-лимфомы линии Jurkat
№№	Шифр соединения	Ингибирование пролиферации клеток, %	ИК50, МКМ
1	ДГК-1	32,2	>100
2	ДГК-2	16,3	>>100
3	ДГК-3	16,3	>>100
4	ДГК-4	66,9	80
5	ДГК-5	68,2	80
6	ДГК-p-S	84,8	50
7	ДГК	0

Из результатов, представленных в таблице 1 и 2, следует, что соединение ДГК-p-S в максимальной концентрации 100 мкМ ингибировало пролиферацию клеток линий CaOv и Jurkat на 83,9% и на 84,8% соответственно. ИК ₅₀ в обоих случаях составила 50 мкМ.

Соединения ДГК-4 и ДГК-5 в концентрации 100 мкМ ингибировали пролиферацию клеток линии Jurkat на 66,9% и 68,2% соответственно (таблица 2). Для обоих соединений ИК₅₀=80 мкМ.

Пример 3

Противоопухолевая активность ДГК-p-S

Таблица 3 Зависимость противоопухолевого эффекта от дозы ДГК-p-S на лейкозе Р-388 мышей
Препарат	Доза (мг/кг)	Дни введения	СПЖ, (дни)	УПЖ%	Масса селезенки, (мг)	Масса тела, (г)	Гибель от токсичности (n/n)*
Контроль	-	-	11,5±0,82		165±32,91	35,1±2,07	-
ДГК-p-S	10	1-5	10,2±0,98	1	245±48,86	33,2±2,23	0/6
-	25	1-5	11,3±0,5	0	231±52,66	30,5±1,91	0/6
-	50	1-5	10,5±0,55	9	216±53,98	30,2±1,6	0/6
-	75	1-5	11,0±0	4	88±37,29	34,4±4,62	0/6
-	100	1-5	11,0±0	4	141±30,49	30,8±1,83	0/6
Примечание: * - n/n - отношение числа павших к общему числу мышей в группе.

При изучении противоопухолевой активности соединения на Р-388 было показано, что препарат при введении в дозах от 10 мг/кг до 100 мг/кг не оказывал противоопухолевого действия, т.е. не вызывал УПЖ.

Таблица 4 Зависимость противоопухолевого эффекта от дозы ДГК-p-S на Са-755 мышей
Доза (мг/кг)	Дни введения	ТРО, %				УПЖ, %
		дни после перевивки опухоли
		7	10	13	16
25	2-6	21	10	5	30	8
50	2-6	48	44	17	23	22
75	2-6	43	38	22	33	19
100	2-6	51*	43	28	38	11
125	2-6	57*	46	35	42	7
Примечание: * - р<0,05

На Са-755 изучена противоопухолевая активность ДГК-p-S также в широком диапазоне доз от 25 мг/кг до 125 мг/кг. Данные, представленные в таблице 4, показывают, что ДГК-p-S был не эффективен в дозах 25, 50 и 75 мг/кг. В то же время соединение в дозах 100 мг/кг и 125 мг/кг проявило умеренный противоопухолевый эффект непосредственно после окончания ежедневного внутрибрюшинного введения в течение 5 дней: ТРО=51% и ТРО=57% соответственно.

Таблица 5. Зависимость противоопухолевого эффекта от дозы ДГК-p-S на LLC мышей
Доза (мг/кг)	Дни введения	ТРО, %					УПЖ, %
		дни после перевивки опухоли
		7	13	17	22	27
25	2-6	51*	45	26	23	+1	10
50	2-6	78*	72*	73*	56*	33	5
75	2-6	89*	81*	74*	61*	33	26
100	2-6	88*	86*	68*	56*	14	0
150	2-6	86*	70*	56*	30	5	0
Примечание: * - р<0,05

Ha LLC выявлен высокий терапевтический эффект ДГК-p-S, который зависит от введенной дозы соединения. Максимальное торможение роста LLC соединение проявило в дозах 75 мг/кг и 100 мг/кг: ТРО=89% и 88% соответственно, после окончания введения ДГК-p-S. Терапевтический эффект сохранялся высоким еще в течение 10 дней: 74% и 68% соответственно.

Кроме того, соединение проявило антиметастатическое действие (табл.6). ДГК-p-S во всех изученных дозах 25 мг/кг, 50 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг тормозил рост метастазов в легких. Масса легких леченных животных на 25%-37% была меньше массы легких в контроле. Однако статистически значимый антиметастатический эффект соединение проявило только в дозе 25 мг/кг и торможение роста метастазов (ТРМ) составило 37%.

Таблица 6 Зависимость антиметастатического действия от дозы ДГК-p-S на LLC мышей
Препарат	Доза (мг/кг)	Дни введения	масса легких (мг)	ТРМ,%
Контроль	-	-	471,2±262,7	-
ДГК-p-S	25	2-6	298,8±115,9	37*
-//-	50	2-6	353,3±277,9	25
-//-	75	2-6	356,8±81,3	29
-//-	100	2-6	327,5±106,3	30
-//-	150	2-6	304,0±86,3	35
Примечание: * - р<0,05

Пример4. Токсическое действие ДГК-p-S

Выявлены различия в токсическом действии ДГК-p-S самок и самцов мышей BDF₁ с перевиваемыми опухолями по величине летальной дозы (LD). Так самки мышей BDF ₁ с опухолью Са-755 переносили дозу 100 мг/кг массы тела, а доза 125 мг/кг являлась - LD₁₂. В то же время в группе у самцов мышей BDF₁ с LLC соединение в дозе 100 мг/кг вызывало гибель одной из 8 особей. Терапевтическая доза ДГК-p-S на Са-755 составляла 100 мг/кг массы тела, а доза 125 мг/кг являлась - LD₁₂. На LLC терапевтическая доза ДГК-p-S составляла 75 мг/кг массы тела, а доза 100 мг/кг являлась - LD₁₆. Кроме того, на LLC установлена доза, вызывающая гибель 50% мышей - LD₅₀, которая равна 150 мг/кг.

Таблица 7 Зависимость токсического действия от дозы ДГК-p-S на самок мышей с Са-755
Препарат	Доза (мг/кг)	Дни введения	Гибель от токсичности (n/n)*	СПЖ (дни)	Масса тела, (г)
Контроль	-	-	-	14,1±3,66	20,3±6,41
ДГК-p-S	25	2-6	0/8	15,2±2,6	20,7±3,09
-//-	50	2-6	0/8	17,2±5,75	25,0±8,38
-//-	75	2-6	0/8	16,8±5,55	21,0±7,33
-//-	100	2-6	0/8	15,6±3,62	21,4±3,4
-//-	125	2-6	1/8	15,1±1,73	19,7±5,12
Примечание: * - n/n - отношение числа павших к общему числу мышей в группе

Таблица 8 Зависимость токсического действия от дозы ДГК-p-S на самцов мышей с LLC
Препарат	Доза (мг/кг)	Дни введения	Гибель от токсичности (n/n)*	СПЖ (дни)	Масса тела, (г)
Контроль				35,0±8,14	29,9±4,26
ДГК-p-S	25	2-6	0/6	38,5±12,8	30,2±4,09
-//-	50	2-6	0/6	36,6±7,27	26,3±2,73
-//-	75	2-6	0/6	44,2±7,25	31,8±5,08
-//-	100	2-6	1/6	35,0±2,58	29,5±3,0
-//-	150	2-6	3/6	31,0±9,87	23,6±5,27
Примечание: * - n/n - отношение числа павших к общему числу мышей в группе

Выводы

1. Избирательное введение остатков фосфорсодержащих групп в ДГК по 7 положению резорцинового кольца позволило получить производные с цитотоксической и противоопухолевой активностью.

2. Из 6 исследованных in vitro производных дигидрокверцетина 3 соединения проявили цитотоксический эффект выше заданного критерия активности.

2. Исходное соединение - дигидрокверцетин, не обладало цитотоксическим действием на клетки линий CaOv и Т-лимфомы линии Jurkat.

3. Соединение ДГК-p-S проявило цитотоксическую активность одного порядка на линиях клеток CaOv и Jurkat (ИК₅₀=50 мкМ).

Соединения ДГК-4 и ДГК-5 проявили цитотоксическую активность на клетках линии Jurkat (ИК₅₀=80 мкМ).

Наиболее активное из всех изученных соединений - ДГК-p-S (ИК ₅₀=50 мкМ) рекомендовано для изучения противоопухолевой активности in vivo.

4. Не выявлен противоопухолевый эффект ДГК-p-S на Р-388 при введении в широком диапазоне доз - от 10 мг/кг до 100 мг/кг.

5. На Са-755 выявлен умеренный противоопухолевый эффект ДГК-p-S в дозах 100 мг/кг и 125 мг/кг при ежедневном внутрибрюшинном введении в течение 5 дней (ТРО=51% и 57% соответственно).

6. На LLC показан высокий противоопухолевый эффект в течение 10 дней. Максимальное ТРО составляет 89%-88% (р<0,05).

7. На LLC выявлено антиметастатическое действие ДГК-p-S на LLC в дозе от 25 мг/кг, составляющее 37% ТРМ в легких.

8. ДГК-p-S обладает низкой токсичностью при терапевтической дозе 75-100 мг/кг.

9. Установлена доза - LD₅₀ для мышей-самцов, равная 150 мг/кг при ежедневном внутрибрюшинном введении в течение 5 дней.

10. ДГК-p-S является новым оригинальным соединением с противоопухолевым эффектом на некоторых перевиваемых солидных опухолях мышей при низкой токсичности, а также обладает антиметастатическим действием.

Литература

1. Хим.-фарм. журнал 1995, №9, С.61 - Диквертин - новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство. - Колхир В.К., Тюкавкина Н.А., Быков В.А. и др.

2. Вопросы питания 1996. №4. С.33 - Природные флавоноиды как пищевые антиоксиданты и биологически активные добавки. - Тюкавкина Н.А, Руленко И.А., Колесник Ю.А.

3. Фармакология и токсикология 1975, т.38, 5, С.607 - Фармакологические и радиозащитные свойства некоторых производных гамма-пиррона (флаваноны и флаванолы). - Т.Ю.Ильючонок, А.И.Хоменко, Л.Н.Фригидова.

4. Life Sci. 1986, 39, N 8, p.717. - Effect offlavonoids on enzyme secretion and endocytosis in normal and mucolipidosis fibroblasts. - Vladutiu G.D, Middleton E. Jr.

5. Science 1977, 197 (4303), p.577 - Mutagenic activity of quercetin and related compounds. - Bjeldanes L.F., Chang G.W.

6. ДАН СССР 1987, т.297, С.1482 - Эффект понижения ионов кальция РН-стимулированных митогенами тимоцитов при действии амидофосфатов углеводов. - В.П.Зинченко, М.П.Коротеев, Э.Е.Нифантьев, Н.К.Кочетков.

7. J.Org.Chem. 1961, 26, p.1958 - Chemistry ofdihydroquerceitine, acetate derivatives. - Aft H.