способ получения иммуногенной негемолитической бактерии вида actinobacillus pleuropneumoniae, бактерия вида actinobacillus pleuropneumoniae, вакцина против свиной плевропневмонии (варианты), иммуногенный и негемолитический штамм actinobacillus pleuropneumoniae (варианты)

Формула изобретения

1. Способ получения иммуногенной негемолитической бактерии вида Actinobacillus pleuropneumoniae (App) из вирулентной бактерии Арр, характеризующийся тем, что включает следующие стадии:

идентификацию трансмембранных доменов гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх;

модификацию путем введения делеции, по меньшей мере, одного сегмента гена apxIA и, необязательно, сегмента гена apxIIA, которые кодируют трансмембранный домен гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что делецию вводят в сегмент гена apxIA, который кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxI App.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что вводится делеция последовательности нуклеотидов с 886 по 945 гена apxIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxI App.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно вводят делецию в сегмент гена apxIIA, который кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxII Арр.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что вводят делецию последовательности нуклеотидов с 886 по 945 гена apxIIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxII Арр.

6. Бактерия вида Actinobacillus pleuropneumoniae для приготовления живой аттенуированной вакцины против свиной плевропневмонии, характеризующаяся тем, что она получена способом, как он определен в любом из пп.1-5.

7. Вакцина против свиной плевропневмонии, содержащая иммунологически эффективное количество живых аттенуированных бактерий вида Actinobacillus pleuropneumoniae, полученных согласно способу, как он определен в любом из пп.1-5, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

8. Иммуногенный и негемолитический штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под регистрационным номером СЕСТ 5985, для приготовления живой аттенуированной вакцины против свиной плевропневмонии.

9. Вакцина против свиной плевропневмонии, содержащая иммунологически эффективное количество бактерий штамма Actinobacillus pleuropneumoniae, как он определен в п.8, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

10. Иммуногенный и негемолитический штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под регистрационным номером СЕСТ 5994, для приготовления живой аттенуированной вакцины против свиной плевропневмонии.

11. Вакцина против свиной плевропневмонии, содержащая иммунологически эффективное количество бактерий штамма Actinobacillus pleuropneumoniae, как он определен в п.10, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения иммуногенного негемолитического штамма Actinobacillus pleuropneumoniae, подходящего для приготовления живой аттенуированной вакцины против свиной плевропневмонии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Actinobacillus pleuropneumonia (далее "Арр") представляет собой грамотрицательные бактерии, которые вызывают свиную плевропневмонию, распространенное во всем мире инфекционное заболевание, ответственное за значительные экономические потери в промышленном свиноводстве.

Наиболее важными факторами вирулентности Арр являются внеклеточные белки, а именно: экзотоксины Арх. Эти экзотоксины относятся к семейству порообразующих RTX-токсинов, широко распространенных среди патогенных грамотрицательных бактерий. Основными экзотоксинами у Арр являются: ApxI, ApxII, ApxIII и ApxIV.

Экзотоксины ApxI и ApxII являются гемолитическими и цитолитическими. ApxI демонстрирует значительную гемолитическую и цитолитическую активность, a ApxII демонстрирует слабую гемолитическую и умеренную цитолитическую активность.

Хотя все протестированные (отобранные) до настоящего времени серотипы способны продуцировать ApxIV, существует типичное распределение серотипов по экспрессии остальных экзотоксинов Арх. Серотипы 1, 5, 9 и 11 продуцируют экзотоксины ApxI и ApxII; Серотип 10 продуцирует только ApxI; Серотипы 7 и 12 продуцируют только ApxII, а серотипы 2, 3, 4, 6 и 8 продуцируют ApxII и ApxIII.

Гены, соответствующие экзотоксинам ApxI и ApxII, сгруппированы в виде оперонов. Оперон экзотоксина ApxI содержит 4 гена: apxIC, apxIA, apxIB и apxID. Ген apxIA кодирует сам экзотоксин ApxI. Ген apxIC кодирует активаторный белок (ацилазу), который вносит посттрансляционную модификацию (ацилирование) в Арх, что позволяет ApxI приобретать активную конформацию и делает его способным взаимодействовать со специфическими рецепторами клетки-хозяина. Гены apxIB и apxID кодируют два мембранных белка, которые секретируют зрелый экзотоксин ApxI во внешнюю среду.

Оперон ApxII содержит только ген А (apxIIA) и ген С (apxIIC), которые кодируют соответственно ApxII и ацилазу, ответственную за приобретение ApxII активной конформации. Существует также небольшой фрагмент, который демонстрирует некоторое сходство с геном apxIB, но он не создает функциональный белок. Экспорт зрелого ApxIl во внешнюю среду осуществляется благодаря действию белков, кодируемых генами apxIB и apxID.

В способах вакцинации согласно настоящему изобретению не предусматривается полная защита против всех серотипов Арр.

Патентный документ WO 97/16532 A1 описывает конструирование вакцинного штамма, способного индуцировать у животного иммунный ответ. Он представляет собой модифицированный микроорганизм, который продуцирует частично или полностью инактивированный в результате частичной делеции токсин Арх. Эта делеция осуществлена посредством индуцированного мутагенеза структурного гена apxIA и/или посредством частичной делеции активаторного гена apxIIC. Она не модифицирует трансмембранную область.

Патентный документ ЕР 810283 А2 описывает конструирование вакцинного штамма Арр путем модификации гена ApxIC таким образом, что он не продуцирует активаторный белок в функциональной форме и этот белок не может активировать токсин путем ацилирования. Он также не модифицирует трансмембранную область.

Jansen с соавт. (Infection and Immunity 63:7-37 (1995)) описали получение гомологичных рекомбинантов Арр посредством сайт-направленного мутагенеза. Эти мутанты имеют ген apxIA, инактивированный посредством вставки гена CMr, и/или ген apxIIA, инактивированный посредством вставки гена TETr.

Tascón et al. (Molecular Microbiology 14: 207-216 (1994)) описывает два мутанта Арр. Один из них имеет нарушение в гене apxIBD, а другой - нарушение в структурном гене apxIA.

Reimer с соавт. (Microbial Pathogenesis 18:197-209 (1995)) описывает невирулентный мутант Арр, который благодаря химическому мутагенезу имеет делеции, повреждающие важные участки оперона apxIABCD. Этот мутант не синтезирует токсин ApxI, но способен синтезировать ApxII, хотя этот токсин и не секретируется клеткой.

Штаммы, которые не экспрессируют экзотоксины ApxI и ApxII, не могут быть использованы в качестве аттенуированных вакцин, так как они не вызывают защитные иммунные ответы, поскольку экзотоксины ApxI и ApxII представляют собой наиболее важные детерминанты вирулентности Арр.

Prideaux (The 16^th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne (Australia) 17-20^th September 2000, pag. 439-442)) описывает вакцину, полученную из штамма с инактивированным геном apxIIC, который секретирует и экспрессирует неактивированный токсин ApxII, неспособный поэтому прикрепляться к клеткам-мишеням.

Таким образом, описанные в предшествующем уровне техники живые аттенуированные вакцины на основе штаммов Арр без гемолитической способности являются менее иммунозащитными, так как они претерпели модификации в своей структуре, которые не позволяют им прикрепляться к мембранному рецептору клеток-мишеней. Кроме того, они не могут вызывать образование антител против токсинов ApxI и/или ApxII, так как они не секретируются клеткой. Frey с соавт. (Gene 142:97-102 (1994)) описывает аминокислотную последовательность экзотоксина ApxI из штамма серотипа I, a Smiths с соавт. (Infection and Immunity 59:4497-4504 (1991)) описывает аминокислотную последовательность экзотоксина ApxII из штамма серотипа 9.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили способ получения иммуногенного и негемолитического штамма Арр из вирулентного штамма Арр, который был модифицирован в по меньшей мере одном сегменте гена apxIA (SEQ ID NO:1) и по выбору в сегменте гена apxIIA (SEQ ID NO:2), которые кодируют трансмембранный домен цитолитических и гемолитических экзотоксинов Арх.

Этот штамм не имеет гемолитической активности, но поддерживает неизменной его иммунозащитную способность и подходит для получения живой аттенуированной вакцины против свиной плевропневмонии.

Трансмембранные домены экзотоксинов ApxI и ApxII играют важную роль в образовании поры в мембране клетки-мишени. После образования этой поры развивается осмотический дисбаланс, который в конце концов вызывает лизис клетки-мишени.

Неожиданно было обнаружено, что живая аттенуированная вакцина, приготовленная с этим модифицированным штаммом Арр, может вводиться в низкой дозе, которая содержит токсины ApxI и ApxII без гемолитической активности и все антигены, иммунологически необходимые для получения сильного иммунногенного ответа.

Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать способ получения иммуногенного и негемолитического штамма Арр из вирулентного штамма Арр, модифицированного в по меньшей мере одном сегменте гена apxIA и по выбору в сегменте гена apxIIA, который кодирует трансмембранный домен гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх.

Кроме того, другим аспектом настоящего изобретения являются штаммы, которые будут получены с использованием способов по настоящему изобретению, и вакцины, приготовленные из них.

В третьем аспекте изобретение направлено на штаммы Арр, депонированные в Испанской коллекции типовых культур (Colección Española de Cultivos Tipo) под регистрационными номерами: СЕСТ 5985 и СЕСТ 5994.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Представлено выравнивание, выполненное с помощью программы ClustalX (Thompson et al.; Nucleic acid Research 24:4876-4882 (1997)), между аминокислотной последовательностью ApxI, происходящего из штамма серотипа 1 (Frey et al.; Gene 142: 97-102 (1994)), и аминокислотной последовательностью ApxII из серотипа 9 (Smits et al.; Infection & Immun. 59:4497-4504 (1991)). На этой Фигуре приведены только последовательности, содержащиеся между аминокислотами 1-594 ApxI и 1-590 ApxII. Следующие участки при выравнивании были заключены в рамки: Н1 (аминокислоты 233-253), Н2 (аминокислоты 296-315) и Н3 (аминокислоты 369-405). Эти участки в указанном порядке соответствуют трем трансмембранным доменам, присутствующим в обоих Арх.

Фиг.2. Представлена схема со стадиями, разработанными для получения гибридных плазмид pApxI Н2 и pApxII Н2. Сначала получали плазмиду pGP1 путем расщепления плазмиды pGP704 (Miller and Mekalanos; J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988)) рестриктазами EcoRI и BgIII и последующего лигирования (сшивания) олигонуклеотидов pGP5' и pGP3'. Эта плазмида содержит растительный ориджин (origin) репликации плазмиды R6K (OriR6K) и ориджин переноса путем конъюгации плазмиды RP4 (OriTP4) и гена устойчивости к ампицилину (Bla). Плазмиду pGP1 расщепляли рестриктазой Pstl и лигировали с носителем Pstl-фрагмента гена устойчивости к канамицину (Kmr или Kan), который происходит из плазмиды pUC4K, с получением плазмиды pGP2. В эту плазмиду, ранее дефосфорилированную и расщепленную рестриктазой EcoRI, были встроены три ДНК-фрагмента, амплифицированных с помощью ПЦР, а именно: промотор ptac, кодирующий участок слияния в atpE/GFPUV (сайт связывания рибосом, где Е. coli atpE с УФ-вариантом зеленого флуоресцентного белка (gfpUV)) и терминатор транскрипции rrnB. Полученную плазмиду обозначили pGP3. В эту плазмиду были встроены 5'- и 3'-фланкирующие участки (амплифицированные с помощью ПЦР), которые кодируют вторую трансмембранную спираль генов apxI и apxII, с образованием плазмид рАрх1 Н2 и pApxII Н2 соответственно.

Фиг.3 разделена на три панели. Панель А демонстрирует рестрикционные карты в тысячах пар нуклеотидов (т.п.н.) и распределение генов в опероне apxI из генома Арр. Светло-серым обозначен ген apxIA, являющийся мишенью для различных рекомбинационных событий, и темно-серым - соседние гены apxIC, apxIB и apxID. Другие гены или участки плазмиды pApxI Н2 изображены с использованием косых линий. Кодирующие фрагменты трансмембранных спиралей (Н1, Н2 и Н3) apxIA выделены черным. Названия и некоторые подробные структуры плазмид на Фиг.2 были упрощены. Так, gfpUV включает промотор ptac и слияние atpE/GFPUV; OriV указывает на ориджин вегетативной репликации R6K, и OriT - на ориджин переноса путем конъюгации RP4. На обоих (1) и (3) представлены рестрикционная карта, полученная с ферментом Xhol, и распределение генов в опероне Apxl генома Арр. На (2) представлена рестрикционная карта того же оперона после вставки плазмиды pApxI Н2 в геном Арр. Эту вставку осуществляют посредством уникального гомологичного рекомбинационного события между 5'-фланкирующими участками Н2, находящегося в плазмиде pApxI Н2, и геномом Арр соответственно.

Панель В на Фиг.3 демонстрирует результаты гибридизации генного зонда Apxl с Саузерн-переносом расщепленной геномной ДНК, расщепленной рестриктазой Xhol и полученной из культиваров: 1) HP816 NIr; 2) рекомбинанта, полученного путем вставки плазмиды pApxI Н2 в геном Арр посредством уникального гомологичного рекомбинационного события между 5'-фланкирующими участками Н2 (HP816R1); 3) рекомбинанта, полученного из HP816R1, который воспроизводит фенотип, идентичный родительскому штамму HP816 NIr и 4) рекомбинанта, полученного из HP816R1, который воспроизводит фенотип, идентичный родительскому штамму НР816 NIr, за исключением того, что он демонстрирует такую же гемолитическую активность, что и HP816R1 (AppApxIH20-).

Панель С демонстрирует вид колоний, посеянных из тех же культур, которые были описаны на панели В (1, 2, 3 и 4), вместе с другой колонией, происходящей из культуры Арр серотипа 7 (5). Колонии сеяли на чашки с колумбийским кровяным агаром, дополненным 0,004% НАД (СА), или на чашки с TSYN, с дополнением 25 мкг/мл канамицина (TS). Можно наблюдать присутствие больших гемолитических ореолов, окружающих колонии в культурах 1 и 3, и маленьких гемолитических ореолов, окружающих колонии в культурах 2, 4 и 5, в СА, а также отсутствие роста культур 1, 3, 4 и 5 в TS.

Фиг.4 разделена на 3 панели. Панель А демонстрирует рестрикционные карты (в т.п.н.) и распределение генов в опероне apxII, расположенном в геноме Арр. Светло-серым обозначен ген apxIIA. Он является мишенью для различных рекомбинационных событий. Соседние гены apxIIC, apxIIB обозначены темно-серым. Другие гены или участки плазмиды pApxII Н2 изображены с использованием косых линий. Кодирующие фрагменты трансмембранных спиралей (Н1, Н2 и Н3) apxIIA выделены черным. Рестрикционная карта, полученная с помощью фермента EcoRI, и распределение оперонных генов ApxII в геноме Арр представлены на (1) и (3). Рестрикционная карта того же оперона после вставки плазмиды pApxII Н2 представлена на (2). Эту вставку осуществляют посредством уникального гомологичного рекомбинационного события между 3'-фланкирующими участками Н2, расположенного в плазмиде pApxII Н2, и геномом Арр. На (4) представлена рестрикционная карта оперона после анализа плазмиды, встроенной на (2) после второй рекомбинации через 5'-фланкирующие участки Н2, расположенные в геноме Арр.

Панель В демонстрирует результаты гибридизации образца гена apxIIA на Саузерн-переносе геномных ДНК, расщепленных с помощью EcoRI и полученных из следующих культур: 1) НР8816 NIr; 2) рекомбинанта, полученного путем вставки плазмиды pApxII Н2 в геном Арр посредством уникального гомологичного рекомбинационного события между 5'-фланкирующими участками Н2 (HP816R2); 3) рекомбинанта, полученного из HP816R2, который воспроизводит фенотип, идентичный родительскому штамму НР816 NIr; 4) рекомбинанта, полученного из HP816R2, который воспроизводит фенотип, идентичный родительскому штамму НР816 NIr за исключением того, что он демонстрирует такую же гемолитическую активность, что и HP816R2 (AppApxI/IIH2-).

Панель С демонстрирует вид колоний, посеянных из тех же культур, которые описаны на панели В (1, 2, 3 и 4). Эти колонии сеяли в чашки с колумбийским кровяным агаром, дополненным НАД (СА), или в чашки с TSYN, дополненной 25 мкл/мл канамицина (TS). Можно видеть присутствие небольших гемолитических ореолов, окружающих эти колонии в культурах 1 и 3, и отсутствие гемолитических ореолов, окружающих колонии в культурах 2 и 4. Видно также отсутствие роста культур 1, 3 и 4 в TS.

Фиг.5. Показаны три графика с кривыми роста, полученными (темные символы) из значений поглощения различных культур при 600 нм с одночасовыми интервалами (ось у слева). Одновременно были взяты несколько образцов из супернатантов культур в одни и те же интервалы времени. Эти образцы хранили при 0°С до тех пор, пока их не разбавляли 1/50 в карбонатном буфере (рН 9,6). Затем эти образцы помещали в микролунки для количественного определения присутствия ApxI и ApxII посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием моноклонального антитела, специфичного для каждого Арх. На основе значений поглощения при 405 нм для каждого протестированного образца (ось у справа) были построены кривые, представляющие накопление каждого Арх в зависимости от времени (светлые символы). На (А) культура НР816 NIr (треугольники) и культура AppApxIH2- (кружки); светлые символы показывают накопление ApxI. На (В) культура НР816 NIr (треугольники) и культура AppApxI/IIH2-( кружки); светлые символы показывают накопление ApxII. На (С) культура HP816RI (треугольники) и культура HP816R2 (кружки) показывают накопление ApxI, a светлые кружки показывают накопление ApxII.

Фиг.6. Панель (А) демонстрирует окрашивание кумасси голубым (Coomassie blue) полиакриламидного геля после денатурирующего электрофореза образцов супернатантов из культур, взятых через 5 часов из: (1) НР816 NIr; (2) AppApxIH2-; (3) контроля, полученного из Арр серотипа 4 (Арр серотипа 4 продуцирует и секретирует ApxII 105 кДа и ApxIII 115 кДа, но не ApxI); и М) маркера молекулярной массы (указаны полосы, соответствующие 110 и 120 кДа). На (В) можно видеть Вестерн-блоттинг геля с образцами, идентичными образцам, анализируемым на геле (А), обнаруженным с помощью моноклонального антитела, специфичного для ApxI. На (С) можно видеть Вестерн-блоттинг геля с образцами, идентичными образцам геля (А), за исключением дорожки 2, которая содержит образец супернатанта из культуры AppApxI/IIH2-. Изображения геля не прилагается, поскольку распределение полос идентично тому, которое наблюдается в геле (А). Этот перенос выявляли с помощью специфического моноклонального антитела против ApxII. Следует отметить, что полоса 105 кДа на дорожке 3 появляется только на (С).

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу получения иммуногенного и негемолитического штамма Actinobacillus pleuropneumoniae из вирулентного штамма Арр, характеризующемуся следующими стадиями.

- Определение трансмембранных доменов гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх.

- Модификация, по меньшей мере, одного фрагмента гена apxIA и, по выбору, сегмента гена apxIIA, который кодирует трансмембранный домен гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх.

Термин "иммуногенный" означает, что штамм Арр, полученный способом согласно настоящему изобретению, сохраняет неизменной свою иммунозащитную способность; это означает, что он содержит все антигены, иммунологически необходимые для получения высокоиммуногенного ответа у хозяина.

Термин "негемолитический" означает, что штамм Арр, полученный способом согласно настоящему изобретению, не имеет гемолитической активности, являясь по существу авирулентным штаммом.

Отбор вирулентного штамма Арр, полученного из инфицированных животных, которые страдают этим заболеванием, осуществляют стандартными способами, известными специалистам в данной области техники.

Первая стадия состоит в идентификации трансмембранных доменов гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх Арр с использованием программ TransMem (Aloy et al.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) или Helixmem (Eisenbeg et al.; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)), которые анализируют аминокислотные последовательности гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх, как описано для Е.coli в Ludwig et al.; Mol. Gene. Genet. 226:198-208 (1991).

Вторая стадия состоит в модификации, по меньшей мере, одного сегмента гена apxIA и, по выбору, сегмента гена apxIIA, которые кодируют трансмембранный домен гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх.

Термин "модифицировать" относится к модификации гена либо с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК, которые включают в себя замену одного или нескольких нуклеотидов, вставку одного или нескольких нуклеотидов, частичную или полную делецию гена, либо посредством нарушения с помощью химически или радиационно-индуцированного мутагенеза.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модификацию осуществляют посредством делеции, по меньшей мере, в одном сегменте гена apxIA и, по выбору, в сегменте гена apxIIA, которые кодируют трансмембранный домен гемолитических и цитолитических экзотоксинов Арх.

Трансмембранные домены, присутствующие в генах apxIA и apxIIA гемолитических и цитолитических экзотоксинов, определяли с использованием вышеупомянутых программ Transmem и Helixmem. Прогнозирование, осуществленное на основе аминокислотных последовательностей гемолитических и цитолитических экзотоксинов ApxI и ApxII, указывает, что трансмембранные домены, называемые также трансмембранами, расположены в следующих областях последовательности экзотоксинов.

- Первый трансмембранный домен Н1: между аминокислотами 233 и 253, соответствующими нуклеотидам 697-759 из apxI.

- Второй трансмембранный домен Н2: между аминокислотами 296 и 315, соответствующими нуклеотидам 886-945 из apxI.

- Третий трансмембранный домен Н3: между аминокислотами 369-405, соответствующими нуклеотидам 1105-1215 из apxI.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модификацию осуществляют посредством делеции в сегменте гена apxIA, который кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина Apxl Арр.

Эту модификацию предпочтительно осуществляют посредством делеции последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxI Арр.

Кроме того, согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, вносится дополнительная делеция в сегмент гена apxIIA, который кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxII Арр. Предпочтительной является делеция последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxIIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxII Арр.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, который будет подробно описан в разделе "примеры", получение иммуногенного негемолитического штамма Арр было осуществлено с использованием способа, включающего следующие стадии.

А Селекция вирулентного штамма Арр.

В Предсказание альфа-спиралей трансмембранного домена белков ApxI и ApxII для конструирования нуклеотидной конструкции, которая обеспечивает делецию во втором трансмембранном домене обоих белков без повреждения процесса фолдинга (сворачивания) и способности полученных гемолизинов взаимодействовать с мембранными специфическими рецепторами.

С Конструирование клонирующего вектора, который способен интегрировать в геном Арр и который содержит маркерные гены, позволяющие эффективным образом контролировать интеграцию такого вектора.

С.1. Конструирование гибридной плазмиды pGP3, которая имеет ориджин репликации RK6, ориджин переноса RP4 и ген устойчивости к канамицину. Кроме того, был включен ген флуоресцентного белка GPVUV (далее GFP) под контролем промотора ptac и терминатор rrnB. Сайт множественного клонирования также был модифицирован для того, чтобы облегчить последующую вставку последовательностей ДНК.

С.2. Конструирование гибридного клонирующего вектора, который содержит 5'- и 3'-фланкирующие последовательности второй трансмембранной спирали, определенной геном apxIA. Поэтому конструировали гибридную плазмиду pApxI Н2 для того, чтобы селекционировать и клонировать такие фрагменты, примыкающие к 5'- и 3'-концам сегмента, который кодирует вторую трансмембранную спираль в гене apxIA. Эту плазмиду использовали в качестве конечного вектора для трансформации Арр.

С.3. Конструирование гибридного клонирующего вектора, который содержит 5'- и 3'-фланкирующие последовательности второй трансмембранной спирали, определенной геном apxIIA. Поэтому конструировали гибридную плазмиду pApxII Н2 для того, чтобы селекционировать и клонировать такие фрагменты, примыкающие к 5'- и 3'-концам сегмента, который кодирует вторую трансмембранную спираль в гене apxIIA. Эту плазмиду использовали в качестве конечного вектора для трансформации Арр.

D. Конструирование рекомбинантных бактерий, которые обеспечивали рекомбинацию гибридной плазмиды, встроенной в геном.

D.1. Конструирование рекомбинантного штамма Арр, обозначенного как HP816R1, который содержит гибридную плазмиду pApxI Н2 в геноме Арр в результате уникального гомологичного рекомбинационного события между этой плазмидой и геномом Арр HP816NI^r, который представляет собой штамм, устойчивый к налидиксовой кислоте, полученный из спонтанного мутанта штамма Арр НР816.

D.2. Конструирование штамма AppApxIH2 ^- с помощью процедуры, которая делает возможным, после того как рекомбинантные бактерии, полученные на стадии 1, были идентифицированы, рекомбинацию рекомбинантного вектора, интегрированного в геном, посредством второго гомологичного рекомбинационного события, а также обнаружение (детектирование) и выделение бактерий, которые благодаря этой второй рекомбинации имеют частичную делецию в гене apxIA.

D.3. Конструирование рекомбинантного штамма Арр HP816R2, который содержит гибридную плазмиду pApxII Н2 в геноме AppApxIH2^- в результате уникального гомологичного рекомбинационного события между этой плазмидой и геномом AppApxIH2^-.

D.4. Конструирование штамма AppApxI/IIH2^- с помощью процедуры, которая делает возможным, после того как были получены идентифицированные рекомбинантные бактерии на стадии D.3, рекомбинацию рекомбинантного вектора, интегрированного в геном, посредством второго гомологичного рекомбинационного события, а также обнаружение и выделение бактерий, которые благодаря второй рекомбинации приобрели частичную делецию в гене apxIIA.

Мутант AppApxIH2^-, полученный согласно настоящему изобретению, идентичен родительскому штамму Арр дикого типа, за исключением делеции последовательности нуклеотидов 886-945 (оба включительно) кодирующей последовательности гена apxIA, которая соответствует отсутствию аминокислот 296-315 (обе включительно) в продуцируемом ApxI.

Мутант AppApxI/IIH2 ^-, полученный согласно настоящему изобретению, идентичен штамму AppApxIH2^-, за исключением делеции последовательности нуклеотидов 886-945 (оба включительно) кодирующей последовательности гена apxIIA, которая соответствует отсутствию аминокислот 296-315 (обе включительно) в продуцируемом ApxII.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения единственные модификации, полученные в геноме Арр, представляют собой делецию 60 пар нуклеотидов в кодирующих последовательностях генов apxIA и apxIIA и замену их рестрикционными мишенями, соответствующими в этом случае ферментам Xhol и EcoRI соответственно. Никаких дополнительных вставок последовательностей, происходящих из плазмидной ДНК, в геном Арр не производят (как, например, ген устойчивости к канамицину). Это позволяет модифицировать полученный штамм в том же гене, но в другом гене-мишени после точно такой же стратегии, которую использовали для осуществления первой модификации. С другой стороны, при этом избегают того, что полученный штамм устойчив ко многим антибиотикам, что является желательной характеристикой в штамме, который будет использован в качестве живой вакцины.

Рестрикционная мишень, используемая в настоящем изобретении, не является необходимой. Хотя можно использовать конструкцию, которая не вводит никакой рестрикционной мишени, ее применение предпочтительно, для того чтобы иметь дополнительный механизм для обнаружения желательных рекомбинантных клонов и возможности осуществлять контроль стабильности полученного штамма или штаммов. Поэтому любая мишень может быть использована при условии, что она не вводит стоп-кодон при синтезе белка и дает увеличение рестрикционных фрагментов, анализируемых электрофорезом (то есть более чем 100 пар нуклеотидов), с фланкирующими рестрикционными фрагментами, которые могли существовать ранее в геноме Арр.

Изобретение относится также к штамму Арр, полученному согласно вышеописанному способу.

Другим объектом изобретения является штамм Арр, характеризующийся тем, что он имеет делецию последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxIA, которая кодирует вторую трансмембрану экзотоксина ApxI, депонированный в Испанской коллекции типовых культур (Colección Española de Cultivos Tipo) под регистрационным номером СЕСТ 5985, согласно Будапештскому соглашению от 28 апреля 1977 года, или его мутант.

Другим объектом изобретения является штамм Арр, характеризующийся тем, что он имеет делецию последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxI, которая кодирует вторую трансмембрану экзотоксина Apxl и, кроме того, делецию последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxIIA, которая кодирует вторую трансмембрану экзотоксина ApxII, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под регистрационным номером СЕСТ 5994, согласно Будапештскому соглашению, или его мутант.

Изобретение также относится к вакцинам для защиты животных против свиной плевропневмонии. Эти вакцины могут быть получены согласно стандартным способам, известным специалистам в данной области техники.

Эти вакцины содержат иммунологически эффективное количество бактерий живого аттенуированного штамма Арр, полученного согласно способу, описанному в настоящем изобретении. "Иммунологически эффективное" означает, что количество бактерий, введенных для вакцинации, является достаточным для того, чтобы индуцировать у хозяина эффективный иммунологический ответ против инфекции, вызванной вирулентными формами Арр.

Используемая дозировка будет зависеть от возраста и массы животного, подлежащего вакцинации, и формы введения.

Вакцина может содержать любую дозу бактерий, достаточных для индуцирования иммунного ответа. Подходящая дозировка находится в диапазоне от 10³ до 10¹⁰.

Кроме того, вакцина может содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Этот наполнитель может представлять собой просто воду, но он может также включать культуральную жидкость, в которой выращивают бактерии, или раствор с физиологической концентрацией соли.

Другой пример фармацевтически приемлемых наполнителей, применимых в настоящем изобретении, включает стабилизаторы, углеводы (то есть глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит) и буферы (то есть фосфатные буферы).

В вакцину могут быть добавлены и другие адъювантные компоненты. Эти адъюванты представляют собой неспецифические стимуляторы иммунной системы, которые усиливают иммунный ответ хозяина против патогенного агента. Примерами адъювантов являются витамин Е и растительное масло.

Вакцина может быть введена животным интраназальным, интрадермальным, подкожным, аэрозольным или внутримышечным путями.

Промышленное применение изобретения легко вывести из описания. Следует упомянуть, что свиная плевропневмония является широко распространенным инфекционным респираторным заболеванием, ответственным за большие экономические потери в промышленном свиноводстве, и что способ получения иммуногенных негемолитических штаммов Арр согласно настоящему изобретению делает возможным получение эффективных вакцин для борьбы со свиной плевропневмонией.

Примеры, которые последуют далее, описаны для того, чтобы предложить специалистам в данной области техники достаточно исчерпывающее и полное объяснение настоящего изобретения, но они не должны рассматриваться как ограничение существенных признаков этого изобретения, описанного в предыдущем разделе описания.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Методики и способы рекомбинантных ДНК, применяемые следующим образом, описаны подробно у Sambrook и Russell (In Molecular cloning 3^rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Новая York (2001) и Ausubel et al.; Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998)). Все ПЦР-продукты были предварительно клонированы в плазмиде рВЕ перед тем, как их расщепляли рестриктазами. Эта плазмида получена на основе вектора pBluescript SK2 (Stratagene) и имеет сайт множественного клонирования, замещенный малой нуклеотидной последовательностью, которая определяет единственную мишень для рестриктазы EcoRV.

Штамм Е.coli XL1-blue (Stratagene) был использован в качестве хозяина для гибридных векторов на основе плазмид pUC118 или pBluescript SK. Штамм Е.coli S17-1 pir (Simon et al.; Biotechnology 1:784-791 (1983)) был использован в качестве хозяина для гибридных векторов на основе плазмиды pGP704.

Все олигонуклеотидные последовательности, описанные ниже, записаны в 5'-3'-направлении, если однозначно не указано иначе. Во всех ПЦР реакциях использовали термополимеразу Deep Vent (New England Biolabs), которая имеет проверенную корректирующую активность.

А. Селекция вирулентного штамма Арр.

Штамм НР816, который соответствует природному типу Арр серотипа 1, принадлежащий лабораториям Hipra S.A. (Amer - Girona - Spain), был выбран в качестве штамма Арр дикого типа.

Штамм HP816NI^r представляет собой штамм, устойчивый к налидиксовой кислоте, полученный из спонтанного мутанта НР816 дикого типа.

В. Идентификация трансмембранного домена экзотоксинов ApxI и ApxII.

Три трансмембранных домена, которые принимают -спиральную структуру, определяли с помощью программ TransMem (Aloy et al.; Comp. Appl. Biosc. 13:213-234 (1997)) и Helixmem (Eisenbeg et al.; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)), как описано для Е. coli (Ludwig et al.; Mol. Gene. Genet. 226:198-208 (1991)), используемых для аминокислотной последовательности ApxI, происходящей из штамма серотипа 1 (Frey et al.; Gene 142: 97-102 (1994)), и ApxII серотипа 9 (Smits et al.; Infection and Immunity 59:4497-4504 (1991)). Эти программы определили три участка, которые могут функционировать в качестве трансмембранных спиралей в обоих белках (Фиг.1): первая трансмембрана располагается между аминокислотами 233 и 253 (H1); вторая трансмембрана располагается между аминокислотами 296 и 315 (Н2), и третья трансмембрана - между аминокислотами 369 и 405 (Н3), все они из Apxl.

С. Конструирование гибридных клонирующих векторов, которые способны интегрировать в геном Арр.

На Фиг.2 можно видеть схему с картами плазмид, которые описаны в этом разделе.

С. 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pGP3.

Плазмиду pGP704 (Miller and Mekalanos; J. Bact. 170:2575-2583 (1988)) разрезали одновременно рестриктазами BglII и EcoRI. Используя электрофорез в агарозном геле, выделяли фрагмент ДНК длиной 3,7 т.п.н. Этот фрагмент инкубировали в реакционной смеси для лигирования вместе с олигонуклеотидами pGP5' (GAT CGA ATT CAG GAT ATC АСА GAT CT) (SEQ ID NO:3) и pGP3' (ATT TAG АТС TGT GAT ATC GTG AAT TC) (SEQ ID NO:4). Полученную рекомбинантную плазмиду обозначили как pGP1.

Плазмиду pGP1 расщепляли рестриктазой PstI. Используя электрофорез в агарозном геле, выделяли фрагмент ДНК длиной 3,12 т.п.н. Этот фрагмент лигировали с другим фрагментом 1,2 т.п.н., полученным путем расщепления плазмиды pUC4K (Pharmacia) рестриктазой PstI. Полученную таким образом рекомбинантную плазмиду обозначили как pGP2.

Используя плазмиду pMAL-p2 (New England Biolabs), последовательности, соответствующие промотору ptac, были амплифицированы с помощью ПЦР, используя олигонуклеотидные праймеры ptac5' (GAA TTC AAT GCT TCT GGC GTC AG) (SEQ ID NO:5) и ptac3' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID NO: 6), которые включают соответственно рестрикционные мишени для EcoRI и KpnI на своих 5'-концах. Из плазмиды pMAL-p2 с помощью ПЦР амплифицировали также последовательности, соответствующие rho-независимому терминатору оперона rrnB, используя праймерные олигонуклеотиды rrnB5' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID NO: 7) и rrnB' (GAA TTC AAG AGT TTG TAG AAA CGC) (SEQ ID NO: 8), которые включают соответственно рестрикционные мишени для KpnI и EcoRI на своих 5'-концах. Размер амплифицированного фрагмента ДНК составляет 278 пар нуклеотидов (п.н.).

С помощью плазмиды pAG408 (Suarez et al.; Gene 196: 69-74 (1997)) слитую конструкцию, состоящую из гена белка GFPUV с участком гена atpE, который связывается с рибосомой, амплифицировали, используя праймерные олигонуклеотиды GFP5' (GGT ACC ТАА ТТТ ACC AAC ACT AC) (SEQ ID NO: 9) и GFP3' (GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTC ATC) (SEQ ID NO: 10), которые включают рестрикционную мишень для KpnI на своих 5'-концах. Амплифицированный фрагмент имеет размер 830 п.н.

Два первых фрагмента (промотор ptac и терминатор rrnB) расщепляли рестриктазами KpnI и EcoRI, тогда как третий (слитая конструкция atpE-GFPUV) расщепляли рестриктазой KpnI. Три фрагмента, полученные таким образом, затем лигировали с плазмидой pGP2, которую предварительно дефосфорилировали и разрезали рестриктазой EcoRI. Из полученных разных рекомбинантных плазмид выбирали одну, которая была носителем трех фрагментов, расположенных согласно Фиг.2. Колонии, которые содержали эту плазмиду, показали интенсивную флуоресценцию при облучении ультрафиолетовым светом. Гибридную плазмиду, полученную таким образом, обозначили как pGP3.

С.2 Конструирование гибридной плазмиды pApxI Н2.

На этой стадии первая задача состояла в том, чтобы получить фрагмент ДНК, примыкающий к 5'-концу кодирующего фрагмента второй трансмембранной спирали гена apxIA. Поэтому фрагмент длиной 897 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из очищенной геномной ДНК штамма Арр НР816, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды Apxla5' (GAT АТС ATG GCT ААС ТСТ СТС AGC TCG АТА G) (SEQ ID NO: 11) и Apxla3' (СТС GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG) (SEQ ID NO: 12), которые включают рестрикционные мишени для EcoRV и XhoI на своих соответствующих 5'-концах. Седьмое основание олигонуклеотида Apxla5' (SEQ ID NO: 9) соответствует первому основанию стартового кодона для трансляции гена apxIA. Седьмое основание олигонуклеотида Apxla3' (SEQ ID NO:10) комплементарно основанию 885 кодирующей последовательности гена apxIA, при этом последнее (основание 885) является последним основанием перед началом последовательности для второй трансмембранной спирали.

Вторая задача этой стадии состояла в том, чтобы получить фрагмент ДНК, примыкающий к 3'-концу кодирующего сегмента второй трансмембранной спирали гена apxIA. Поэтому, используя ПЦР, амплифицировали фрагмент длиной 1042 п.н. из очищенной геномной ДНК штамма АррНР816, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды Apxlb5' (СТС GAG CCG СТТ TCG ТТС ТТА ААТ GTT GCG) (SEQ ID NO: 13) и Apxlb3' (AGA TCT TCA CCG GCT TTC TGT GCA СТТ TG) (SEQ ID NO: 14), которые включают рестрикционные мишени для XhoI и BglII на своих соответствующих 5'-концах. Седьмое основание олигонуклеотида Apxlb5' (SEQ ID NO:13) соответствует основанию 946 кодирующей последовательности гена apxIA, при этом это основание (основание 946) является первым основанием после конца последовательности для второй трансмембранной спирали. Седьмое основание олигонуклеотида Apxlb3' (SEQ ID NO:14) комплементарно основанию 1975 кодирующей последовательности гена apxIA.

После того, как были получены два ранее описанных фрагмента, первый фрагмент расщепляли рестриктазами EcoRV и XhoI, тогда как второй фрагмент расщепляли ферментами XhoI и BglII. Оба фрагмента затем лигировали с вектором pGP3, который предварительно разрезали рестриктазами EcoRV и BglII. Полученную гибридную плазмиду обозначили как pApxI Н2.

С.3. Конструирование гибридной плазмиды pApxII H2.

Первая задача этой стадии состояла в том, чтобы получить фрагмент ДНК, примыкающий к 5'-концу кодирующего сегмента второй трансмембранной спирали гена apxIIA. Поэтому с помощью ПЦР амплифицировали фрагмент длиной 871 п.н. из очищенной геномной ДНК штамма Арр НР816, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды ApxIIa5' (GAT АТС ААА TCG ТСС ТТА САА САА GGA TTG) (SEQ ID NO: 15) и ApxIIa3' (GAATTC ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID NO: 16), которые включают рестрикционные мишени для EcoRV и EcoRI на своих соответствующих 5'-концах. 7-ое основание олигонуклеотида ApxIIa5' (SEQ ID NO:15) соответствует основанию 27 кодирующей последовательности гена apxIIA. Седьмое основание олигонуклеотида ApxIIa3' (SEQ ID NO:16) комплементарно основанию 885 кодирующей последовательности гена apxIIA, при этом это основание (основание 885) является последним основанием перед началом последовательности для второй трансмембранной спирали.

Вторая задача этой стадии состояла в том, чтобы получить фрагмент ДНК, примыкающий к 3'-концу кодирующего сегмента второй трансмембранной спирали гена apxIIA. Поэтому фрагмент длиной 952 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из очищенной геномной ДНК из штамма Арр НР816, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды ApxIIb5' (GAA ТТС ССТ СТТ ТСА ТТС ТТА ААТ GTA GC) (SEQ ID NO: 17) и ApxIIb3' (AGA TCT GCC АТС ААТ AAC GGT AGT ACT TG) (SEQ ID NO: 18), которые включают рестрикционные мишени для Ecol и BglII на своих соответствующих 5'-концах. Седьмое основание олигонуклеотида Apxllb5' (SEQ ID NO:17) соответствует основанию 946 кодирующей последовательности гена apxIIA, при этом последнее основание является первым основанием после конца последовательности для второй трансмембранной спирали. Седьмое основание олигонуклеотида ApxIIb3" (SEQ ID NO:18) комплементарно основанию 1845 кодирующей последовательности гена apxIIA.

После того, как были получены два фрагмента, описанных ранее, первый фрагмент расщепляли рестриктазами EcoRV и EcoRI, тогда как второй фрагмент расщепляли ферментами EcoRI и BglII. Оба фрагмента затем лигировали с вектором pGP3, предварительно расщепленным рестриктазами EcoRV и BglII. Полученную гибридную плазмиду обозначили как pApxII Н2.

D. Конструирование рекомбинантных бактерий, которые обеспечивали рекомбинацию гибридной плазмиды, встроенной в геном.

D.1. Конструирование рекомбинантного штамма Арр HP816R1.

Трансформацию Арр гибридной плазмидой pApxI Н2 осуществляли путем конъюгации с клетками Е.coli S17-1 pir, которые являются носителями этой плазмиды. Штамм HP816Nl^r использовали для трансформации гибридной плазмидой pApxI Н2.

Перед осуществлением конъюгации для таких бактерий получали культуру в стационарной фазе. Культуральную среду TSYN (соевый триптический бульон 30 г/л, дрожжевой экстракт 6 г/л и после автоклавирования добавление 0,004% НАД) и налидиксовую кислоту (50 мкг/мл) использовали для роста App816NI^r .

Культуральную среду LB (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л), которую после автоклавирования дополняли 25 мкг/мл канамицина, использовали для роста Е.coli S17-1 pir. После достижения стационарной фазы 0,2-0,3 А₆₀₀ единиц культуры Арр и 0,6-0,8 А₆₀₀ единиц культуры Е.coli добавляли к 1 мл 10 мМ раствора MgSO₄. Затем это центрифугировали в течение 2 минут при 15000g, и осадок, полученный таким образом, ресуспендировали в 200 мкп раствора 10 мМ MgSO₄. После получения смеси обеих культур эту смесь наносили на нитроцеллюлозный фильтр 2,5 см и 0,45 мкм, предварительно помещенный на чашку Петри, содержащую среду TSYN с добавлением Нобль-агара 15 г/л. После 6-ти часовой инкубации при 37°С фильтр с конъюгатом помещали в пробирку, содержащую 2 мл PBS (10 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ КН₂ PO₄, 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, рН 7,4). После интенсивного перемешивания фильтр удаляли, и клеточную суспензию центрифугировали в течение 2 минут при 15000g, и осадок ресуспендировали в 500 мкл PBS. Полученную таким образом суспензию распределяли в чашках Петри со средой TSYN, дополненной Нобль-агаром 15 г/л, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл налидиксовой кислоты, в соотношении 100 мкл клеточной суспензии на каждую чашку Петри. Полученные культуры инкубировали при 37°С в течение 24-36 часов. С помощью этой процедуры были получены 65 колоний, устойчивых к канамицину и налидиксовой кислоте, для конъюгации с плазмидой pApxI Н2, которая равна частоте трансформации 1,3×10 ^-7 для каждой рецепторной клетки.

Некоторые колонии пересевали с помощью петли для пересевов в чашки Петри, содержащие LP с добавлением Нобль-агара 15 г/л, 0,004% НАД, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл налидиксовой кислоты. Все полученные колонии проявляли разную степень флуоресценции при воздействии на них ультрафиолетового света, что указывает на интеграцию плазмиды в геном Арр в результате уникального рекомбинационного события. Как показано на Фиг.3, если имеет место двойная рекомбинация, эксконъюгаты не могут расти в среде, содержащей канамицин. Присутствие этого антибиотика в чашках позволяет расти только тем рекомбинантам, которые интегрировали в свой геном полную плазмиду. Индикаторный ген GFP позволяет различать, какая из колоний, устойчивых к канамицину, является продуктом спонтанной мутации.

В конце концов, полученные рекомбинанты являлись результатом гомологичной рекомбинации между плазмидой и геном apxIA. Это подтверждали посредством наблюдения гемолитической активности рекомбинантов в чашках с колумбийским кровяным агаром с добавлением 0,004% НАД (Фиг.3, панель С). Рекомбинанты, полученные с плазмидой pApxI Н2, демонстрируют резкое уменьшение диаметра гемолитического ореола по сравнению с родительским штаммом HP816Nl^r .

Один из рекомбинантов, полученных с плазмидой pApxI Н2, был отобран для последующих пересевов и был обозначен как HP816R1.

D.2 Конструирование штамма AppApxIH2 ^-

После получения рекомбинантов с плазмидой pApxI Н2, интегрированной в геном, важно закрепить делецию в геноме Арр посредством второй рекомбинации. Поэтому один из рекомбинантов из предыдущей стадии был предложен для последовательных пассажей в культуральной среде, дополненной только налидиксовой кислотой. Среда без канамицина обеспечивает, в том случае, если между геномом Арр и интегрированной плазмидой происходит вторая рекомбинация, что полученные бактерии будут жизнеспособными. Это второе рекомбинационное событие обеспечивает появление двух различных генотипов. В том случае, если это происходит в том же сегменте, в котором имела место первая рекомбинация, полученный генотип будет идентичен родительскому штамму, использованному в разделе D.1. Если эта вторая рекомбинация происходит в сегменте, где первая рекомбинация не имела места, то полученный генотип будет демонстрировать делецию во фрагменте, который кодирует вторую трансмембранную спираль гемолизина (Фиг.3, панель А). Появление рекомбинантов можно контролировать несколькими различными путями:

a) исчезновение флуоресценции при воздействии на колонии ультрафиолетового света;

b) чувствительность к канамицину и

c) получение гемолитического ореола, демонстрируемого родительским штаммом, используемым в разделе D.1.

Способы (а) и (b) определяют оба рекомбинантных типа. Способ (с) позволяет различать те рекомбинанты, которые воспроизводят родительский генотип. Это объясняется тем фактом, что в рекомбинантах, которые демонстрируют делецию в кодирующем сегменте второй трансмембранной спирали гена apxIA, гемолитическая активность соответствующего родительского фенотипа не восстанавливается.

Последовательные пассажи осуществляли из предыдущих пассажей, используя разведения 1/10000 предыдущего пассажа, за исключением того, что первый пассаж состоял просто из культуры, полученной из колонии, выделенной из HP816R1. Культуральная среда представляла собой LB с добавлением 0,004% НАД и 50 мкг/мл налидиксовой кислоты. Для каждого пассажа использовали объем среды 10 мл. Процентное содержание обнаруженных рекомбинантов представлено в Таблице 1.

Таблица 1
Кол-во пассажей	% обнаруженных рекомбинантов (а)	% обнаруженных рекомбинантов (b)
2	0,12	0,18
3	0,32	0,46
4	7,75	10,4
5	18,5	22,3

a) Процент, определенный подсчетом колоний, которые воспроизводили гемолитический ореол, продемонстрированный родительским штаммом.

b) Процент, определенный подсчетом колоний, которые не показали флуоресценции при воздействии на них ультрафиолетовым светом.

Как видно из таблицы выше, в каждом пассаже количество бактерий, которые демонстрируют рекомбинировавшую в результате второй рекомбинации плазмиду, увеличивается. Процент нефлуоресцентных колоний лишь немногим выше, чем таковой для колоний, которые восстанавливают гемолитическую активность. Этот факт предполагает, что вторая рекомбинация происходит предпочтительно в том же сегменте ДНК, где имела место первая рекомбинация. Если частота для каждого рекомбинантного типа составляла 50%, то количество не флуоресцентных колоний по отношению к колониям, которые восстанавливают гемолитическую активность, удваивается.

После того, как культура была достаточно обогащена вторыми рекомбинантами, может быть начата стадия очистки. С этой целью, несколько нефлуоресцентных колоний размножали в колумбийском агаре, дополненном НАД, и агаре LB, дополненном НАД, 50 мкг/мл, налидиксовой кислотой и 20 мкг/мл канамицина (LBNKm). Для последующих исследований было выбрано несколько колоний, которые не показали рост на LBNKm и показали ту же гемолитическую активность, что и рекомбинант со вставкой HP816R1.

D.3 Конструирование рекомбинантного штамма Арр HP816R2.

Трансформацию Арр с помощью pApxII Н2 осуществляли путем конъюгации с клетками Е.coli S17-1 pir, которые являются носителями этих плазмид. Штамм AppApxIH2 ^- использовали для трансформации гибридной плазмидой pApxII Н2. Процедуры и культуральная среда идентичны тем, которые описаны в разделе D.1. Частота трансформации плазмидой pApxII Н2 была аналогична частоте, полученной в разделе D.1. для плазмиды pApxI Н2.

Некоторые колонии пересевали с помощью петли для пересевов в чашки Петри со средой LB, дополненной Нобль-агаром 15 г/л, 0,004% НАД, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл налидиксовой кислоты. Все полученные колонии демонстрировали различную степень флуоресценции при воздействии на них ультрафиолетового света, что указывает на интеграцию плазмиды в геном Арр в результате одного рекомбинационного события. Как видно на Фиг.4, если имеет место двойная рекомбинация, то эксконъюгаты не могут расти в среде, содержащей канамицин. Присутствие этого антибиотика в чашках позволяет расти только тем рекомбинантам, которые интегрировали в свой геном полную плазмиду. Индикаторный ген GFP позволяет различать, какая из колоний, устойчивых к канамицину, является продуктом спонтанной мутации.

В конце концов, полученные рекомбинанты являлись результатом гомологичной рекомбинации между плазмидой и соответствующим геном apxIIA. Это было подтверждено наблюдением гемолитической активности рекомбинантов в чашках с колумбийским агаром, дополненным 0,004% НАД (Фиг.4, панель С). Рекомбинанты, полученные с плазмидой pApxIIH2, демонстрируют полное исчезновение гемолитического ореола.

Один из рекомбинантов, полученных с плазмидой pApxII Н2, был выбран для последующих пассажей и обозначен как HP816R2.

D.4 Конструирование штамма AppApxI/IIH2 ^-.

После получения рекомбинантов с плазмидой pApxII Н2, интегрированной в геном, важно закрепить эту делецию в геноме Арр посредством второй рекомбинации. Поэтому рекомбинанты, полученные на предыдущей стадии, были предложены для последующих пассажей в культуральной среде с добавлением только налидиксовой кислотой, как описано в разделе D.2. Процентные значения для рекомбинантов, определенные из второго пассажа, аналогичны значениям, полученным в разделе D.2.

После того, как культура была достаточно обогащена вторичными рекомбинантами, можно приступить к стадии очистки. С этой целью, несколько нефлуоресцентных колоний размножали в колумбийском агаре, дополненном НАД, и агаре LB, дополненном НАД, 50 мкг/мл налидиксовой кислоты и 20 мкг/мл канамицина (LBNKm). Для последующих исследований были выбраны несколько колоний, которые не показали рост на LBNKm и продемонстрировали такую же гемолитическую активность, что и рекомбинант со вставкой HP816R2.

Е. Анализ очищенной ДНК из колоний, выделенных из предыдущего пассажа, для тестирования гомогенности культур и присутствия делении в генах apxIA и apxIIA.

Рекомбинанты из предыдущих пассажей D.2 и D.4 растили в 10 мл среды TSYN с добавлением 50 мкг/мл налидиксовой кислоты до тех пор, пока не наступала стационарная фаза роста. Затем осуществляли экстракцию ДНК из каждого рекомбинанта.

Е.1. Анализ рекомбинантов apxIH2^-.

Образцы геномной ДНК, соответствующей каждому образцу культур вторичных рекомбинантов, полученных из плазмиды pApxI Н2, расщепляли рестриктазой XhoI. Полученные фрагменты вместе с другими, полученными расщеплением ДНК, экстрагированной из культур штамма HP816NI^r и HPB816R1 соответственно, анализировали Саузерн-блоттингом, используя в качестве зонда фрагмент ДНК длиной 1927 п.н., полученный из расщеплением плазмиды р Арх1Н2^- рестриктазами EcoRV и BglII. Результаты этих гибридизаций представлены на Фиг.3В. Результаты гибридизации контрольного штамма HP816NI^r демонстрируют присутствие рестрикционной мишени Xhol, расположенной примерно в 20 т.п.н. от мишени, обнаруженной в опероне apxI. Анализ рекомбинанта со вставкой плазмиды pApxI Н2, демонстрирует появление двух новых полос 1,1 и 4,3 т.п.н. и незначительное увеличение примерно на 1 т.п.н. уже существующей полосы 20 т.п.н. Размер новых полос и увеличение уже существующей полосы являются ожидаемыми благодаря вставке гибридной плазмиды рАрх Н2 в 5'-фланкирующий участок кодирующего фрагмента второй трансмембранной спирали гена apxIA генома Арр (Фиг.3А, схема 2). Анализ рекомбинанта с плазмидой, рекомбинировавшей в результате второй рекомбинации в том же 5'-участке, где имела место первая рекомбинация, демонстрирует исчезновение двух полос меньшей молекулярной массы и незначительное уменьшение подвижности предыдущей полосы 21 т.п.н., которая теперь появляется на том же уровне, что и в родительском штамме. Это вместе с фактом, что гемолитическая активность идентична активности, проявляемой родительским штаммом HP816NF^r, означает, что никаких дополнительных модификаций не вводится в геном Арр в течение всего этого процесса (Фиг.3, А и С).

В конечном счете, анализ рекомбинанта с плазмидой, рекомбинировавшей в результате второй рекомбинации в 3'-фланкирующем участке сегмента, который кодирует вторую трансмембранную спираль, демонстрирует исчезновение полосы 4,3 т.п.н., сохранение полосы 1,1 т.п.н., которая уже наблюдалась в рекомбинанте благодаря вставке и незначительному уменьшению полосы 20 т.п.н. Это распределение полос является ожидаемым благодаря исчезновению кодирующего сегмента второй трансмембранной спирали и его замене мишенью для XhoI. Эта новая мишень, встроенная в геном Арр, дает увеличение на фрагмент 1,1 т.п.н. и последующее уменьшение на 1,1 т.п.н. в полосе 20 т.п.н., которое наблюдается в штамме 816 NF^r (Фиг.3, А и В). Следует обратить внимание на присутствие в СА больших гемолитических ореолов, окружающих колонии культур 1 и 3 и маленьких гемолитических ореолов, окружающих колонии культур 2, 4 и 5. Видно также отсутствие роста культур 1, 3, 4 и 5 в TS. Этот рекомбинант демонстрирует сильно пониженную гемолитичесую активность по сравнению с родительским штаммом HP816NI^r и такую же гемолитическую активность, что и Арр серотипа 7, который выделяет только экзотоксин - гемолизин ApxII (Фиг.3С). Этот результат показывает, что делеция во второй трансмембранной спирали элиминирует или значительно уменьшает гемолитическую активность ApxIA App. App, модифицированный описанной делецией, был обозначен как ApxI Н2^-.

Полученный таким образом рекомбинант, характеризующийся тем, что имеет делецию последовательности нуклеотидов 886-945 в гене apxIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxI, был обозначен как AppApxIH2^- . 10 января 2002 года этот рекомбинант был депонирован в Испанской коллекции типовых культур под регистрационным номером СЕСТ 5985 в соответствии с условиями, установленными в Будапештском соглашении.

Е.2. Анализ рекомбинантов apx/IIH2^-.

Образцы геномной ДНК, соответствующей рекомбинанту со вставкой HP816R2, и вторичные рекомбинанты, полученные из плазмиды pApxII Н2^-, расщепляли рестриктазой EcoRI. Полученные фрагменты вместе с другими полученными расщеплением ДНК, экстрагированной из культуры штамма HP816NI^r, анализировали, используя Саузерн-блоттинг. В качестве зонда использовали два фрагмента ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР. Они соответствовали 5'- и 3'-фланкирующим участкам ДНК-сегмента, который кодирует вторую трансмембранную спираль ApxII (раздел В). Результаты этих гибридизаций представлены на Фиг.4В. Результаты гибридизации контрольного штамма НР816 Nl^r демонстрируют присутствие двух рестрикционных мишеней для EcoRI, удаленных друг от друга на 15,7 т.п.н., что определяет границы фрагмента, в который включен оперон apxII. Анализ рекомбинанта, полученного путем вставки плазмиды pApxII Н2 демонстрирует исчезновение полосы 15,7 т.п.н. и появление 3 новых полос 8,2, 7,5 и 0,9 т.п.н. Размер новых полос является ожидаемым из-за вставки гибридной плазмиды pApxII Н2 в 3'-фланкирующий участок кодирующего сегмента второй трансмембранной спирали гена apxIIA генома App (Фиг.4А). Анализ рекомбинанта с рекомбинировавшей плазмидой в результате второй рекомбинации в том же 3'-участке, где имела место первая рекомбинация, демонстрирует повторное появление единственной полосы 15,7 т.п.н., которая совпадает с полосой, продемонстрированной контрольным штаммом (Фиг.4В). Гемолитическая активность идентична таковой, продемонстрированной родительским штаммом AppApxIH2 ^- (Фиг.4С). В конечном счете, анализ рекомбинанта с плазмидой, рекомбинировавшей в результате второй рекомбинации с помощью 3'-фланкирующего участка сегмента, который кодирует вторую трансмембранную спираль, демонстрирует исчезновение полос 13,5 и 0,9 т.п.н. и появление нового фрагмента 7,5 т.п.н. (Фиг.4В). Это распределение полос является ожидаемым в результате исчезновения кодирующего сегмента второй трансмембранной спирали и ее замене мишенью для EcoRI (Фиг.4А). Эта новая мишень, встроенная в геном Арр, вызывает расщепление EcoRI-фрагмента 15,7 т.п.н., который включал оперон apxII в родительском штамме, на два фрагмента 8,2 и 7,5 т.п.н. (Фиг.4А и В). Этот рекомбинант является фактически не гемолитическим (Фиг.4С). Этот результат показывает, что делеция во второй трансмембране по существу ликвидирует или практически сводит к нулю гемолитическую активность ApxIIA Арр. ApxIIA, модифицированный путем осуществления описанной делеции, будет обозначен теперь как ApxII Н2^-. Следует отметить присутствие в СА маленьких гемолитических ореолов, окружающих колонии культур 1 и 3, и отсутствие гемолитических ореолов, окружающих колонии культур 2 и 4. Следует отметить также отсутствие роста культур 1, 3 и 4 в TS.

Рекомбинантный штамм, полученный таким образом, был обозначен как AppApxI/IIH2^-. Он характеризуется тем, что имеет делецию последовательности нуклеотидов 886-945 в гене apxIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxI, и, кроме того, делецию последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxIIA, которая кодирует второй трансмембранный домен экзотоксина ApxII. Этот штамм был депонирован в Испанской коллекции типовых культур 12 июня 2002 года под регистрационным номером СЕСТ 5994, как определено в условиях Будапештского соглашения по патентам.

F. Анализ продукции ApxI Н2^- и ApxII H2^- полученными рекомбинантными штаммами.

Для того чтобы определить, продуцируют ли полученные рекомбинантные штаммы АрхН2^-, определяли его концентрацию в среде LB. Продуцируемый Арх определяли, используя моноклональные антитела, специфичные к Арх I и Арх II, с помощью иммуноанализов и Вестерн-блоттинга. Как показано на Фиг.5 (А и В), продукция и экскреция в среду ApxI Н2^- и ApxII Н2^- рекомбинантными штаммами имеет ту же временную картину, что и немодифицированный Арх из родительского штамма HP816Ml^r дикого типа. Все гемолизины (модифицированы они или нет) появляются в культуральной среде примерно во второй половине экспоненциальной фазы роста и достигают максимальной концентрации в начале стационарной фазы. Начиная с этого момента, концентрация всех гемолизинов остается постоянной или немного уменьшается. Как видно на той же Фиг., ApxI Н2^- и ApxII Н2^- накапливаются до достижения уровней, аналогичных тем, которые продемонстрированы в соответствующем немодифицированном Арх, продуцируемом родительским штаммом HP816Ml^r дикого типа. С другой стороны, введенная делеция является очень маленькой (18 аминокислот) и ожидается уменьшение молекулярной массы двух АрхН2^- только на 2 кДа. Принимая во внимание, что 2 гемолизина дикого типа имеют кажущуюся молекулярную массу примерно 105 кДа, уменьшение на 2 кДа в его молекулярной массе не заметно в полиакриламидных гелях и его соответствующих Вестерн-блоттингах (Фиг.6). В конечном счете, авторы должны подчеркнуть, что на этой же Фиг. не появляются укороченные или неправильно процессированные полипептидные продукты. Следует отметить, что 105 кДа на дорожке 3, по-видимому, определяются только в (С). Все эти данные показывают, что небольшая делеция, введенная в оба Арх, не препятствует тому, чтобы они синтезировались целиком и выделялись в культуральную среду. После их высвобождения в культуральную среду, АрхН2 ^- проявляет стабильность, аналогичную той, которая продемонстрирована соответствующим немодифицированным Арх.

G. Эффективность аттенуации полученных штаммов.

Для того чтобы протестировать степень аттенуации двух сконструированных рекомбинантных штаммов, использовали трехмесячных самцов и самок гибридных свиней LWxLD. В различных испытаниях использовали четыре группы свиней. Каждый из штаммов вводили в дозе 10⁸ КОЕ в 5 мл PBS каждому из животных 3 первых групп посредством внутритрахеальной инъекции. Эту дозу предварительно определяли как LD50 для штамма HP816NI^r дикого типа у свиней того же возраста. Животных из четвертой группы инокулировали только одной дозой - 5 мл PBS. Клинические симптомы регистрировали ежедневно в течение 7-дневного периода, в течение которого продолжалось это испытание. Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Штамм	Кол-во животных	Доза Арр (КОЕ)	Смертность	Дни с нарушениями в поведении	Дни с клиническими респираторными симптомами (b)
0-2	3-4	5-6	0-2	3-4	5-6
HP816NI r	5	108	2/5	5/5	3/3	3/3	5/5	1/3	0/3
AppApxIH2 -	10	108	0	10/10	9/10	4/10	5/10	3/10	3/10
AppApxI/IIH2 -	10	108	0	4/10	0/10	0/10	2/10	0/10	0/10
Контроль (PBS)	5	НА	0	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5

(a) Животные с нарушенным тревожным поведением и способностью отвечать на присутствие скотника (пораженные/общее).

(b) Животные с нарушенным ритмом дыхания и/или диспноэ (одышкой) (пораженные/общее).

Через семь дней после инокуляции животных умерщвляли и регистрировали отмеченные макроскопические поражения в органах дыхания. Бактериологические исследования осуществляли также при вскрытии.

Результаты, полученные в этом испытании, просуммированы в Таблице 3.

Таблица 3
Штамм	Кол-во животных	Доза Арр (КОЕ)	Смертность	Животные с поражениями легких	Средний коэффициент поражений легких	Животные, из которых был выделен Арр
HP816NIr	5	108	2/5	4	11,6±2,1	3
AppApxIH2-	10	108	0	7	3,2±4,6	3
AppApxI/IIH2-	10	108	0	0	0	8
Контроль (PBS)	5	НА	0	0	0	0

Два из 5 животных в группе, инокулированной штаммом HP816NI^r дикого типа, погибли в течение этого периода времени (семь дней после инокуляции). При вскрытии у четырех из пяти животных были обнаружены тяжелые поражения легких. Животные, которые были инокулированы штаммом AppApxIH2^-, также продемонстрировали изменение в своем поведении, хотя эти симптомы уменьшались через день после инокуляции. Клинические симптомы были более умеренные и наблюдались только у 50% свиней. Хотя ни одно из животных этой группы не умерло в течение этого испытания, 70% из них продемонстрировали поражения при вскрытии, хотя и было обнаружено, что все они были более легкими, чем в предыдущей группе. Третью группу инокулировали штаммом АррАрх/IIH2^-. Хотя четыре животных продемонстрировали умеренно измененное поведение, симптомы уменьшались через 48 часов после инокуляции. Два животных, которые продемонстрировали ограниченные клинические симптомы, также выздоравливали в течение 48 часов после инокуляции. Ни у одного животного при вскрытии не было обнаружено никаких поражений легких. Оценку легочных поражений выполняли согласно Hannan с соавт. (Research In Veterinary Science 33:76-88 (1982)). Представленные значения являются средним арифметическим для каждой группы вместе со стандартным отклонением. Согласно этим результатам, штамм AppApxI/IIH2^- является невирулентным и может быть безопасно использован в качестве живой вакцины. Следует подчеркнуть, что инокулированный штамм Арр выделяли у 80% свиней этой группы через семь дней после его введения. Этот результат показывает, что жизнеспособность штамма AppApxI/IIH2 ^- при экспериментальном инфицировании не изменяется, несмотря на тот факт, что он лишен гемолитической активности. Этот факт важен, если принять во внимание необходимость того, чтобы микроорганизм оставался жизнеспособным для того, чтобы могли производиться и высвобождаться экзотоксины Арх. Без продукции экзотоксинов Арх, аттенуированный штамм не может быть использован в качестве живой вакцины, поскольку он не сможет индуцировать иммунный ответ, который защитил бы животное против последующей инфекции (Reimer et al.; Microbial Pathogenesis 18:197-209 (1995)). Во всех испытаниях был достигнут сильный иммуногенный ответ.