дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование

Формула изобретения

1. Дифференцированная стромальная клетка, полученная из жировой ткани, которая экспрессирует по меньшей мере один белок, характерный для эндокринной клетки поджелудочной железы, где характерный белок выбран из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.

2. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что в клетку вводят экзогенный генетический материал.

3. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что является клеткой человека.

4. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что секретирует гормон.

5. Клетка по п.4, отличающаяся тем, что гормон выбран из группы гормонов, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина или панкреатического полипептида.

6. Клетка по п.5, отличающаяся тем, что гормоном является инсулин.

7. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что стромальная клетка, которая экспрессирует по меньшей мере один из признаков, характерных для клетки поджелудочной железы, дополнительно инкапсулирована в биоматериал, совместимый с трансплантацией хозяину.

8. Клетка по п.7, отличающаяся тем, что материал для инкапсулирования выбран из группы, состоящей из производного коллагена, гидрогеля, альгината кальция, агарозы, гиалуроновой кислоты, производного полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты и фибрина.

9. Способ дифференцировки выделенных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, для экспрессии [ими] по меньшей мере одного маркера эндокринной клетки поджелудочной железы, предусматривающий приведение выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, в контакт с веществом, индуцирующим эндокринную функцию поджелудочной железы, где указанный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что вещество, индуцирующее эндокринную функцию поджелудочной железы, содержится в среде для выращивания клеточной культуры, имеющей химически заданный состав.

11. Применение дифференцированной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, для получения лекарственного средства для лечения расстройства эндокринной функции или дегенеративного состояния поджелудочной железы у хозяина, где указанная стромальная клетка экспрессирует по меньшей мере один маркер эндокринной клетки поджелудочной железы и, кроме того, где указанный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что дифференцированную стромальную клетку, которая экспрессирует по меньшей мере один маркер поджелудочной железы, выделяют из [организма] хозяина.

13. Применение по п.11, отличающееся тем, что расстройством эндокринной функции или дегенеративным состоянием поджелудочной железы является сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа, заболевание, ассоциированное с липодистрофией, химически индуцированное заболевание, заболевание, ассоциированное с панкреатитом, или заболевание, ассоциированное с травмой.

14. Имплантат для трансплантации хозяину дифференцированной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, которая экспрессирует по меньшей мере один белок, характерный для эндокринной клетки поджелудочной железы, содержащий материал для инкапсулирования и клетки по любому из пп.1-6.

15. Имплантат по п.14, отличающийся тем, что материал для инкапсулирования содержит биосовместимый полимер.

16. Имплантат по п.15, отличающийся тем, что биосовместимым полимером является гидрогель.

17. Имплантат по п.15, отличающийся тем, что биосовместимый полимер выбран из группы, состоящей из производного коллагена, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты, полигликолевой/полимолочной кислоты, гиалуроната и фибрина.

18. Способ продуцирования гормонов, предусматривающий (а) культивирование клетки по любому из пп.1-6 в среде в условиях, достаточных для того, чтобы клетка могла секретировать гормон в указанную среду, и (b) выделение гормона из указанной среды.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что продуцируемый гормон выбран из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина или панкреатического полипептида.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что продуцируемым гормоном является инсулин.

21. Дифференцированная in vitro стромальная клетка, полученная из жировой ткани, которая экспрессирует по меньшей мере один из признаков эндокринной клетки поджелудочной железы, где указанная стромальная клетка проявляет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.

22. Способ имплантации хозяину дифференцированной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, которая экспрессирует по меньшей мере один из признаков, характерных для эндокринной клетки поджелудочной железы, предусматривающий

a) дезагрегацию и перенос выделенных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в культуры суспендированных клеток;

b) выращивание культуры суспендированных клеток до тех пор, пока не появятся признаки формирования кластеров из островковых клеток; и затем

c) имплантацию полученных кластеров из островковых клеток хозяину, где указанная дифференцированная стромальная клетка проявляет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.

23. Применение клетки по любому из пп.1-8 или 21, имплантированной хозяину с целью лечения эндокринного расстройства или дегенеративного состояния поджелудочной железы.

24. Применение имплантата по любому из пп.14-17, вживленного хозяину с целью лечения эндокринного расстройства или дегенеративного состояния поджелудочной железы.

Описание изобретения к патенту

Ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке заявлен приоритет на основании патентной заявки США с серийным номером 60/344913, поданной 9 ноября 2001 г.

Область изобретения

В настоящем изобретении представлены выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, у которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного признака клетки поджелудочной железы. Приводятся также способы лечения эндокринных заболеваний поджелудочной железы.

Предпосылки изобретения

Масса эндокринных клеток поджелудочной железы, образованных островками Лангерганса, состоит из клеток четырех типов, которые классифицируют по основному продукту секреции, который они регулируют. Они включают глюкагонпродуцирующие -клетки, инсулинпродуцирующие -клетки, продуцирующие панкреатический полипептид -клетки и соматостатинпродуцирующие -клетки (Henquin, 2000, Diabetes 49, 1751-1760; Slack, 1995, Development 121, 1569-1580). Считается, что в процессе развития эти различные клеточные популяции возникают из общих предшественников стволовых клеток, связанных с эпителием панкреатических протоков (Rao et al., 1989, Am. J. Pathol. 134,1069-1086; Rosenberg and Vinik, 1992, Adv. Exp. Med. Biol. 321:95-104; Swenne, 1992, Diabetologia 35,193-201; Hellerstrom, 1984, Diabetologia 26,393-400; Gu and Sarvetnick, 1993, Development 118, 33-46). В процессе постадийной дифференцировки в разные клеточные линии клетки-предшественники приобретают свойства различных клеточных популяций. Ранее проведенные наблюдения показали, что первыми обнаруживаемыми популяциями островков являются -клетки, за которыми последовательно возникают -клетки, -клетки и -клетки (Slack, 1995, Development 121, 1569-1580). Островок образуется вдоль эпителия протока как масса -клеток, окруженных - или -клетками и охватывающих их -клеток. Незрелый островок затем мигрирует в окружающую ацинарную ткань и васкуляризируется (Slack, 1995, Development 121, 1569-1580).

Основной функцией островковых клеток является гомеостаз физиологических питательных веществ. Например, нормально функционирующие -клетки синтезируют и секретируют инсулин с целью поддержания уровня глюкозы в крови. Это осуществляется с помощью чувствительного к глюкозе эндогенного аппарата, который связан с путями секреции при регулируемом высвобождении инсулина. В этом примере сочетания стимулирования и секреции повышенное содержание глюкозы в плазме (например, возникающее после приема пищи) меняет метаболизм -клеток и приводит к изменению потенциала мембраны за счет закрытия АТФ-чувствительных каналов K⁺. Указанная деполяризация вызывает открытие чувствительных к электрическому напряжению каналов Ca²⁺, и приток ионов Ca²⁺ запускает процесс регулируемого выделения инсулина (Henquin, 2000, Diabetes 49, 1751-1760). Инсулин в плазме затем стимулирует захват глюкозы скелетными мышцами и жировыми тканями и ингибирует продукцию глюкозы печенью, так что конечным результатом является понижение содержания глюкозы в плазме (Cheatham and Kahn, 1995, Endocr. Rev. 16, 117-142).

I. Инсулин

Диабет I типа (инсулинзависимый диабет) является основным заболеванием, связанным с потерей эндокринной функции поджелудочной железы. В большинстве случаев это происходит как аутоиммунная атака на островки. Применяемая в настоящее время терапия диабета I типа заключается в однократных или многократных ежедневных инъекциях инсулина. В большинстве случаев этот режим недостаточен для осуществления адекватного контроля уровня глюкозы в крови, что позднее приводит к многочисленным диабетическим осложнениям, которые значительно увеличивают скорость развития заболевания и уровень смертности у больных людей. Альтернативной терапией ежедневным инъекциям инсулина является лечение диабета путем трансплантации поджелудочной железы или островков (Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). Исследования показывают: несмотря на то, что трансплантация здоровой ткани поджелудочной железы является эффективным методом лечения, эта процедура имеет три основных недостатка: 1) дефицит донорного материала; 2) требование проведения обширных хирургических операций и 3) необходимость длительной иммуносупрессивной терапии, которая дает лишь кратковременное улучшение. Аналогично, трансплантация островков эффективна лишь до известной степени. Этот процесс включает выделение островков из поджелудочной железы донора и их инъекцию через воротную вену. Более того, эта процедура включает многократные инъекции, для проведения которых пациентов необходимо несколько раз помещать в стационар (Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). Кроме того, эти пациенты также должны проходить курс интенсивной иммуносупрессивной терапии. Далее, как и при трансплантации ткани поджелудочной железы, метод с использованием выделенных островков также имеет недостаток, вызванный в значительной степени ограниченным количеством доноров. Ведутся исследования по использованию ксенотрансплантантов островков, однако иммунное отторжение при таком подходе все еще остается существенным препятствием (Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415).

Все вместе приведенные выше данные свидетельствуют о необходимости разработки альтернативных методов клеточной терапии. В соответствии с этим, с целью получения клеточных линий, подобных островковым, путем регулируемой индукции дифференцировки по эндокринному панкреатическому пути, были опробованы стволовые клетки панкреатических протоков, полученные как от мышей, так и от человека, а также эмбриональные стволовые клетки (Assady et al., 2001, Diabetes 50, 1691-1697; Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Lumelsky et al., 2001, Science 292, 1389-1394; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). Полученные от мышей стволовые клетки, в которых индуцировали дифференцировку в островковые гормонпродуцирующие клетки, были успешно использованы для реконструкции диабетических мышиных моделей (Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). Однако препятствия, вновь встающие при таком подходе, включают иммунное отторжение и ограниченность источников клеток-предшественников для использования при лечении людей.

Эмбриональные стволовые клетки человека (HES) были успешно дифференцированы в клетки, которые продуцируют инсулин (Assady et al., 2001, Diabetes 50, 1691-1697). Использование плюрипотентных недифференцированных клеток HES потенциально является источником дифференцированных -клеток поджелудочной железы, которые применяют при таких заболеваниях, как диабет. Однако указанные методы имеют ряд недостатков. В первую очередь возникает проблема источника самих клеток HES. Несмотря на недавнее широкое обсуждение настоятельной потребности в проведении научно-исследовательских разработок в области клеток HES, политические и этические споры продолжаются. Вследствие этого не обеспечена доступность подходящих клеток HES. Вторым недостатком использования клеток HES для получения дифференцированных островковых клеток поджелудочной железы является непредсказуемость в проявлении чувствительности к глюкозе у культивированных дифференцированных клеток. Действительно, Assady с коллегами (Diabetes 50, 1691-1697) предположили, что клетки, дифференцированные из клеток HES, не проявляют чувствительности к глюкозе. Нечувствительность можно объяснить отличиями в неоднородности клеточных популяций, выращенных в культуре, трудностью в нормализации ответной инсулиновой реакции к таким параметрам, как содержание белка или ДНК или длительное действие больших концентраций глюкозы в культуре. Таким образом, для использования дифференцированных -клеток необходимо показать, что дифференцированные клетки обладают сочетанием стимулирования и секреции по отношению к инсулину. Терапия с использованием клеток HES также имеет недостаток, связанный с потенциально высоким риском развития тератомы.

Сама поджелудочная железа является источником недифференцированных островковых клеток-предшественников. В международной заявке WO 01/23528, поданной The University of Florida Research Foundation, приводится использование островковых клеток-предшественников, выращенных in vitro, для имплантации млекопитающим при in vivo терапии диабета.

Дифференцировка стволовых клеток, полученных из панкреатических протоков, или выделенных эмбриональных стволовых клеток по панкреатическим эндокринным линиям дифференцировки характеризуется экспрессией специфических ферментов-маркеров и факторов транскрипции. Интересно отметить, что в процессе эмбрионального развития островки и нейральные клетки используют многие общие маркеры, включая нейронспецифичную энолазу, синафтофизины, катехинсинтезирующие ферменты, тирозингидролазу, нестин и факторы транскрипции HNF3 , Isl-1, Brain-4 Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, панкреатический и дуоденальный ген гомеобокса 1 (PDX-1), Nkx6.2, Nkx2.2 и нейрогенин-3 (Ngn-3) (Ramiya et al., 2000, Nat. Med. 6, 278-282; Schwitzgebel et al., 2000, Development 127, 3533-3542; Fernandes et al., 1997, Endocrinology 138, 1750-1762; Zulewski et al., 2001, Diabetes 50, 521-533; Gradwohl et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97, 1607-M611). Функциональными маркерами более зрелых островковых клеток являются экспрессии глюкагона, соматостатина, инсулина, транспортера глюкозы 2 (Glut2) и панкреатического полипептида.

II. Глюкагон

Глюкагон представляет собой пептидный гормон, содержащий 29 аминокислотных остатков, высвобождаемый альфа-клетками в островках Лангерганса. Гюкагонпродуцирующие альфа-клетки представляют собой одну из наиболее ранних обнаруживаемых популяций островковых клеток при развитии эндокринной функции поджелудочной железы. Тканеспецифическое высвобождение проглюкагона контролируется клеточноспецифической экспрессией ферментов прогормонконвертазы (PC). Существенная роль PC2 в процессинге островкового проглюкагона была выявлена при изучении мыши, лишенной PC2. У этой мыши наблюдается слабая гипогликемия, повышенное содержание инсулина, и она имеет серьезные нарушения при процессинге проглюкагона в зрелый панкреатический глюкагон, а островковые -клетки мыши секретируют проглюкагон из атипичных секреторных гранул (J. Biol. Chem. 1998 Feb 6; 273 (6): 3431-7; J. Biol. Chem. 2001 Jul 20; 276 (29): 27197-202).

Основные биологические действия глюкагона сводятся к регулированию гомеостаза глюкозы посредством усиления синтеза и мобилизации глюкозы в печени. Рецепторы глюкагона экспрессируются также в островковых -клетках человека и вносят свой вклад в регулирование стимулированной глюкозой секреции инсулина (Diabetologia 2000 Aug; 43(8); 1012-9).

Глюкагон в общем случае действует как контр-регуляторный гормон, который противодействует активности инсулина и поддерживает уровни глюкозы в крови, в частности, у больных гипогликемией. У больных диабетом избыток секреции глюкагона играет главную роль в возникновении метаболических нарушений, связанных с диабетом, таких как гипергликемия. Основной проблемой у больных диабетом с рецидивами гипогликемии является развитие нарушенных контр-регуляторных ответных реакций, которые включают понижение или отсутствие ответной реакции глюкагона на гипогликемию. Таким образом, понимание того, как и почему вегетативная нервная система и островковые -клетки развивают дефекты секретирования глюкагона, которые приводят к гипогликемической нечувствительности, является одной из основных проблем в исследовании диабета.

Фармакологическое введение глюкагона приводит к быстрому повышению содержания глюкозы в крови, поэтому инъекции глюкагона применяются в качестве фармакологического лечения больных диабетом в случае риска развития значительной гипогликемии. Диабет в течение долгого времени рассматривали как бигормональное расстройство, при котором избыток глюкагона вносит большой вклад в развитие гипергликемии. Shah с коллегами (Am. J. Physiol. 1999 277: E283-E290) изучили значение концентрации инсулина в среде для развития опосредованной глюкагоном гипергликемии у людей после повышения концентрации глюкозы, вызванной приемом пищи. Авторами обнаружено, что избыток глюкагона на фоне относительного дефицита инсулина явно приводит к ослаблению супрессии продукции глюкозы и к гипергликемии. Таким образом, ингибиторы секреции глюкагона или активности глюкагона могут быть полезными при лечении больных диабетом, у которых наблюдается дефицит инсулина и/или избыток глюкагона. Изучение пациентов с диабетом II типа позволяет предположить, что отсутствие супрессии глюкагона приводит к развитию гипергликемии после приема пищи частично за счет повышенного глюкогенолиза. Анализ содержания глюкозы в крови в присутствии или в отсутствие индуцированной соматостатином супрессии глюкагона в процессе проведения орального теста на толерантность к глюкозе выявляет существенное повышение концентрации глюкозы у людей с более высокими уровнями глюкагона (См. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000 Nov; 85(11): 4053-9).

Ряд исследований показал, что глюкагон стимулирует расщепление жира (этот процесс называют липолизом) как в клеточных препаратах, так и in vivo . Так, глюкагон может стимулировать липолиз жировых тканей человека. Однако более ранние исследования были противоречивыми, при этом одни сообщения подтверждали роль глюкагона в липолизе жировых клеток человека. Глюкагон человека и вазоактивный интестинальный полипептид (VIP) стимулируют in vitro высвобождение свободных жирных кислот из жировой ткани человека, в то время как в других экспериментах не удалось показать существенное действие глюкагона на липолиз в выделенных жировых клетках человека (Int. J. Obes. 1985; 9(1): 25-7). Удаление глюкагона или физиологическая гиперглюкагонемия in vivo не приводит к значительному усилению потока пальмитата, который является показателем липолиза, у здоровых людей или больных диабетом (J. Clin. Endocrinol. Metab. 1991 Feb; 72(2): 308-315). Об аналогичных отрицательных наблюдениях сообщалось недавно, когда 7 здоровым мужчинам в брюшную стенку имплантировали постоянные микродиализные катетеры и изучали влияние вливаний глюкагона на внутритканевое содержание глицерина и содержание глицерина и свободных жирных кислот в плазме. Никакого влияния на глицерин или свободные жирные кислоты не было обнаружено при системных инфузиях глюкагона как в присутствии, так и в отсутствие экзогенной глюкозы (J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001 May 1; 86(5): 2085-2089). Аналогичные отрицательные результаты были получены при изучении липолиза у здоровых мужчин, в брюшную жировую ткань которых были имплантированы постоянные микродиализные катетеры (J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001 May; 86(5): 2085-2089). Таким образом, имеющиеся данные не подтверждают важную роль глюкагона в липолизе.

Глюкагон при фармакологическом введении человеку оказывает антисократительное воздействие на желудочно-кишечный тракт (пищевод, желудок, тонкую и толстую кишку) (Dig. Dis. Sci. 1979 Jul; 24(7): 501-8; Gut. 1975 Dec; 16(12): 973-8; N. Engl. J. Med. 1999 Nov 11; 341(20): 1496-503). Глюкагон может также вызвать релаксацию гладкой мускулатуры в желчном пузыре и мочеточнике и поэтому иногда используется при радиологических исследованиях желчного пузыря и почки.

III. Соматостатин

Соматостатин представляет собой эндогенный пептид, продуцируемый дельта-клетками, который осуществляет многочисленные важные функции в организме. Соматостатин является очень гибким циклическим пептидом, имеющим весьма короткий биологический период полураспада. Первоначально было обнаружено, что соматостатин играет роль классического эндокринного гормона гипоталамо-гипофизарной системы, но с тех пор было показано, что он дополнительно выполняет функцию паракринного и аутокринного сигнального вещества в широком разнообразии клеточных типов. Многочисленные физиологические процессы, на которые, как теперь известно, оказывает влияние соматостатин, включают секрецию гормонального и пептидного фактора, нейротрансмиссию, пролиферацию клеток, сокращение гладкой мускулатуры, усвоение питательного вещества и воспаление. Гормоны и пептиды, регулируемые соматостатином, включают гормон роста (GH), тиреотропный гормон (TSH), пролактин (PRL), инсулин и вещество Р (SP).

Соматостатин воздействует на функции многих важных биологических систем, таких как эндокринная, желудочно-кишечная, сосудистая и иммунная системы, а также на центральную и периферическую нервную систему. В эндокринной системе соматостатин играет важную роль в регуляции секреции гормона роста, инсулина и глюкагона (Koerker et al., Science 1974, 184, 482-484). Влияние соматостатина на желудочно-кишечную и сердечно-сосудистую биологические системы привело к тому, что терапия с применением соматостатина находит клиническое использование в обеих этих областях. Как выяснилось, в центральной нервной системе (ЦНС) соматостатин является важным регулятором распознавательной функции (Schettini, Pharmacological Research 1991, 23, 203-215), а в специфических областях мозга выполняет функцию нейротрансмиттера или нейромодулятора, регулирующего высвобождение таких нейротрансмиттеров, как ацетилхолин (Gray et al., J. of Neuroscience 1990, 10, 2687-2698) и допамин (Thal et al., Brain Research 1986, 372, 205-209). В периферической нервной системе (ПНС) соматостатин вместе с веществом Р присутствует в катехинаминсодержащих волокнах и чувствительных окончаниях (Green et al., Neuroscience 1992, 50, 745-749) и играет роль ингибитора их высвобождения и опосредуемых ими эффектов.

Как и сам соматостатин, рецепторы соматостатина располагаются в большом количестве тканей и клеточных типах, включая те, что принадлежат эндокринной, желудочно-кишечной, сосудистой, иммунной, ЦНС и ПНС. Широкая сфера действия рецепторов соматостатина также была обнаружена в большом количестве опухолей человека. Нейроэндокринные опухоли являются одним из классов опухолей, которые содержат в большом количестве функционально активные рецепторы соматостатина. Вследствие избыточного выделения гормона из клеток опухоли функционально-активные нейроэндокринные опухоли проявляют такие клинические симптомы, как ульцерогенная аденома поджелудочной железы и глюкагомный синдром. Указанные симптомы можно лечить путем активации рецепторов соматостатина.

IV. Панкреатический полипептид

Известно, что гамма-клетки поджелудочной железы секретируют панкреатический полипептид (РР), который является членом белкового семейства нейропептидов Y. О точном физиологическом механизме этого пептида известно мало. Известно, что РР непосредственно воздействует на поджелудочную железу путем подавления секреции пищеварительных ферментов поджелудочной железы за счет ингибирования стимуляции блуждающего нерва. Предполагают, что это влияние РР осуществляется как путем прямого воздействия на блуждающий нерв, так и путем опосредованного центральной нервной системой воздействия на дорсально-вагусный комплекс и дуговидное ядро (Deng et al., Brain Res. 2001; 902: 18-29). Полагают также, что посредством своего действия на блуждающий нерв РР ингибирует высвобождение инсулина. Как установлено, РР ингибирует также гипертрофию островковых клеток, которая наблюдается в инсулиннезависимых диабетических состояниях. Уровни РР в кровотоке также оказывают воздействие на печень и приводят к снижению продукции глюкозы печенью. Таким образом, введение РР может сыграть роль при лечении инсулиннезависимого сахарного диабета.

V. Неэмбриональные источники стволовых клеток

Взрослые клетки обладают способностью к дифференцировке. Например, недавние исследования показали специфическую способность выделенных из костного мозга стромальных клеток претерпевать in vitro нейронную дифференцировку (Woodbury et al. (2000) J. Neuroscience Research 61: 364; Sanchez-Ramos et al. (2000) Exp. Neurology 164: 247). В этих исследованиях обработка стромальных клеток костного мозга антиоксидантами, эпидермальным фактором роста (EGF) или мозговым нейротрофическим фактором (BDNF) индуцировала в клетках морфологические изменения, что соответствует нейральной дифференцировке, т.е. приводила к распространению длительного ингибирования клеточных процессов в ростовых колбочках и филоподии (Woodbury et al. (2000) J. Neuroscience Research 61: 364; Sanchez-Ramos et al. (2000) Exp. Neurology 164: 247). Кроме того, эти агенты индуцировали экспрессию нейронспецифических белков, включая нестин, нейронспецифичную энолазу (NSE), нейрофиламент M (NF-M), NeuN и рецептор фактора роста нервной ткани trkA (Woodbury et al. (2000) J. Neuroscience Research 61: 364; Sanchez-Ramos et al. (2000) Exp. Neurology 164: 247).

Другие примеры взрослых клеток, которые обладают способностью к дифференцировке, приведены в следующих патентах:

Патент США № 5486359, выданный компании Osiris, посвящен выделенным гомогенным популяциям стволовых мезенхимных клеток человека, которые могут быть дифференцированы в клетки более чем одного типа соединительных тканей. В патенте приводится способ выделения, очистки и значительной репликации указанных клеток в культуре, т.е. in vitro.

В патенте США № 5942225, выданном компаниям Case Western и Osiris, приводится композиция для индуцирования дифференцировки, направляемой линией дифференциации, выделенных стволовых мезенхимных клеток человека в одном определенном мезенхимном направлении дифференцировки, которая включает стволовые мезенхимные клетки человека и один или более биоактивных факторов для индуцирования дифференцировки стволовых мезенхимных клеток в одном определенном направлении дифференцировки.

В патенте США № 5736396, выданном компании Case Western, приводится способ ex vivo индуцирования дифференцировки, направляемой линией дифференциации, выделенных мезенхимных стволовых клеток человека, который включает контактирование мезенхимных стволовых клеток с биоактивным фактором с тем, чтобы индуцировать ex vivo дифференцировку стволовых мезенхимных клеток в одном определенном мезенхимном направлении дифференцировки. В патенте также приводится способ лечения пациента, нуждающегося в мезенхимных клетках определенного направления дифференцировки, который включает введение нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей выделенные мезенхимные стволовые клетки человека, у которых индуцировали дифференцировку в условиях ex vivo путем контактирования с биоактивным фактором с тем, чтобы индуцировать ex vivo дифференцировку указанных клеток в одном определенном мезенхимном направлении дифференцировки.

В патенте США № 5908784, выданном компании Case Western, приводится композиция для in vitro хондрогенезиса клеток-предшественников мезенхимы человека в условиях in vitro и образования из них хондроцидов клеток человека, при этом композиция включает выделенные мезенхимные стволовые клетки человека в виде плотно спрессованной из клеток гранулы и по крайней мере один контактирующий с ними хондроиндуцирующий агент. В патенте также приводится способ индуцирования хондрогенезиса в мезенхимных стволовых клетках путем контактирования мезенхимных стволовых клеток с хондроиндуцирующим агентом in vitro , при этом мезенхимные стволовые клетки плотно спрессованы в гранулу.

В патенте США № 5902741, выданном компании Advanced Tissue Science, Inc., приводится полученная in vitro жизнеспособная хрящевая ткань, которая включает продуцирующие хрящевую ткань стромальные клетки и белки соединительной ткани, обычно секретируемые стромальными клетками, которые присоединены к по существу их покрывающему трехмерному каркасу, образованному биосовместимым материалом неживого происхождения и сформированному в виде трехмерной структуры, в которой внутритканевые пространства соединены стромальными клетками. В патенте также приводится композиция для выращивания новой хрящевой ткани, которая включает мезенхимные стволовые клетки в полимерном носителе, подходящем для пролиферации и дифференцировки клеток в хрящевую ткань.

В патенте США № 5863531, выданном компании Advanced Tissue Science, Inc., приводится трубчатая жизнеспособная ткань стромы, полученная в условиях in vitro, которая включает стромальные клетки и белки соединительной ткани, обычно естественно секретируемые стромальными клетками, которые присоединены к по существу их покрывающему трехмерному трубчатому каркасу, образованному биосовместимым материалом неживого происхождения, в котором внутритканевые пространства соединены стромальными клетками.

В патенте США № 6022743, выданном компании Advanced Tissue Science, Inc., приводится трехмерная система культуры на основе стромальной клетки, полученная из культуры паренхиматозных клеток поджелудочной железы на каркасе из живой стромальной ткани. Стромальные клетки могут включать клетки пупочного канатика, клетки плаценты, мезенхимные стволовые клетки и зародышевые клетки. Таким образом, систему культуры используют для получения функционально способной ткани поджелудочной железы и материала органов.

В патенте США № 5811094, выданном компании Osiris, приводится способ получения соединительной ткани, который включает формирование соединительной ткани у нуждающегося в этом пациента путем введения указанному пациенту клеточного препарата, содержащего мезенхимные стволовые клетки человека, которые извлекают из костного мозга человека и которые по существу не содержат клеток крови.

В патенте США № 6030836, выданном Thiede et al., приводится способ in vitro поддержания кроветворных стволовых клеток человека, включающий совместное культивирование мезенхимных стволовых клеток человека и кроветворных стволовых клеток таким образом, чтобы по крайней мере в некоторых из кроветворных стволовых клеток поддерживался фенотип своих стволовых клеток.

В патенте США № 6103522, выданном Torok-Storb et al., приводится линия полученных облучением иммортализованных стромальных клеток человека в комбинированной in vitro культуре с кроветворными клетками-предшественниками человека.

В международной заявке WO 9602662A1 и патенте США № 5879940, выданном Torok-Storb et al., приводятся линии стромальных клеток костного мозга человека, которые поддерживают гематопоэз.

В патенте США № 5827735, выданном компании Morphogen, приводятся очищенные плюрипотентные мезенхимные стволовые клетки, которые по существу не содержат подвергнутые дифференцировке многоядерные миогенные клетки и которые преимущественно имеют звездообразную форму, при этом в среде для культивирования клеточной ткани, содержащей 10% сыворотки плода коровы, мезенхимные стволовые клетки при контакте с мышечными морфогенными белками преимущественно образуют клетки фибробластов и преимущественно образуют в клеточной культуре со средой, содержащей 10% сыворотки плода коровы, разветвленные многоядерные структуры, которые спонтанно сокращаются при контактировании с мышечным морфогенетическим белком и фактором задержки рубцевания.

В международной заявке WO 99/43286, поданной Hahnemann University, описывается использование мезенхимных стволовых клеток для лечения центральной нервной системы и способ проведения дифференцировки стромальных клеток костного мозга.

В международной заявке WO 98/20731, поданной компанией Osiris, приводится композиция мезенхимного предшественника мегакариоцита и способ выделения мезенхимных стволовых клеток, связанных с выделенными мегакариоцитами, путем выделения мегакариоцитов.

В международной заявке WO 99/61587, поданной компанией Osiris, приводится клеточная линия CD45 человека и/или стволовые клетки фибробластов или мезенхимы.

В международной заявке WO 01/079457, поданной компанией Ixion Technology, описывается использование выделенных из костного мозга и крови стволовых клеток, которые культивируют и in vitro дифференцируют в клетки, подобные панкреатическим. В международной заявке WO 01/78752, поданной University of Texas, описывается использование нейральных стволовых клеток, имплантированных в поджелудочную железу, для лечения заболеваний поджелудочной железы.

Тем не менее, методы, описанные в предыдущих абзацах, основаны на источниках клеток-предшественников, таких как костный мозг, которые трудно получить, а кроме того, их выделение представляет собой болезненную процедуру для донора. Поэтому целью настоящего изобретения является клетка, материал и способ, помогающий при лечении эндокринных заболеваний поджелудочной железы.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении представлена выделенная стромальная клетка, полученная из жировой ткани человека или другого млекопитающего, индуцированная по экспрессии по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака клетки поджелудочной железы, предпочтительно эндокринной клетки поджелудочной железы. Указанная клетка может обладать свойствами глюкагонпродуцирующей -клетки, инсулинпродуцирующей -клетки, продуцирующей панкреатический полипептид -клетки или соматостатинпродуцирующей -клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получают инсулинпродуцирующую -клетку. В клетке по настоящему изобретению можно индуцировать дифференцировку в условиях in vitro либо после имплантации пациенту.

Клетку по настоящему изобретению можно включить в двумерную или трехмерную структуру с целью создания пригодной для имплантации или имплантированной матрицы, как детально описывается далее. В настоящем изобретении, например, предлагается способ инкапсулирования дифференцированных взрослых стволовых клеток, выделенных из жировой ткани, или дифференцированных клеток в биоматериал, совместимый с методами трансплантации млекопитающему, преимущественно человеку. Материал для инкапсулирования не должен препятствовать высвобождению белков или гормонов, секретируемых взрослыми стволовыми клетками, выделенными из жировой ткани, или дифференцированными клетками. Используемые материалы включают, однако ими не ограничиваются, производные коллагена, гидрогели, альгинат кальция, агарозу, хилауроновую кислоту, производные полимолочной/полигликолевой кислоты и фибрин.

Клетку по настоящему изобретению можно получить методами генной инженерии с тем, чтобы она могла включать экзогенный генетический материал. В одном из вариантов осуществления изобретения используется вектор, который способен интегрировать требуемые последовательности гена в хромосому клетки-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вводимая молекула нуклеиновой кислоты встраивается в плазмидный или вирусный вектор, способный к автономному реплицированию в клетке-хозяине реципиента. С этой целью может быть использовано широкое разнообразие векторов. Предпочтительные эукариотные векторы включают, например, вирус коровьей оспы, SV40, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и большое разнообразие коммерчески доступных векторов экспрессии млекопитающих на основе плазмиды, которые известны специалистам в данной области техники. Как только вектор или нуклеиновая кислота подготовлены для экспрессии, конструкцию (конструкции) ДНК можно ввести в соответствующую клетку-хозяин с помощью любых разнообразных средств, т.е. трансформацией, трансфекцией, вирусным инфицированием, конъюгацией, слиянием протоплазмы, электропорацией, с помощью технологии «генного ружья», преципитацией фосфата кальция, прямой микроинъекцией и т.п. После введения вектора клетки-реципиенты культивируют в выбранной среде, в которой селективно растут клетки, содержащие вектор. Экспрессия молекул(ы) клонированного гена приводит к продукции гетерологичного белка.

В настоящем изобретении предлагается также способ дифференцировки выделенных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, так чтобы они могли экспрессировать по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы, например, глюкагонпродуцирующей -клетки, инсулинпродуцирующей -клетки, продуцирующей панкреатический полипептид -клетки или соматостатинпродуцирующей -клетки, который включает стадию контактирования выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, с веществом, индуцирующим функцию поджелудочной железы, предпочтительно индуцирующим эндокринную функцию поджелудочной железы. Указанное вещество находится в имеющей химически заданный состав среде для выращивания клеточной культуры, что более подробно описывается далее, которая может содержать факторы роста, цитокины, химические агенты и/или гормоны с концентрацией, эффективной для того, чтобы индуцировать в выделенных стромальных клетках, полученных из жировой ткани, экспрессию по крайней мере одного маркера эндокринной клетки поджелудочной железы.

В настоящем изобретении предлагается также способ лечения расстройства, опосредованного панкреатической функцией глюкагонпродуцирующей -клетки, инсулинпродуцирующей -клетки, продуцирующей панкреатический полипептид -клетки или соматостатинпродуцирующей -клетки у реципиента, включающий индуцирование у выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, экспрессии по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака клетки поджелудочной железы, что оказывает терапевтически благотворное воздействие на реципиента; и затем трансплантирование индуцированных клеток реципиенту. Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что полученные из жировой ткани стромальные клетки можно взять непосредственно от реципиента, дифференцировать их и реимплантировать аутогенно. В качестве альтернативы терапию можно проводить аллогенно.

Не ограничивающими настоящее изобретение примерами расстройств эндокринной функции поджелудочной железы или дегенеративных состояний, для лечения которых может быть использовано данное изобретение, включают сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа, заболевание, вызванное липодистрофией, химически индуцированное заболевание, заболевание, вызванное панкреатитом, или заболевание, вызванное травмой.

Клетку по настоящему изобретению можно использовать как в качестве гомогенной или в значительной степени гомогенной популяции клеток, так и как часть популяции, в которой другие клетки секретируют вещества, поддерживающие рост или дифференцировку клетки, подобной эндокринной клетке поджелудочной железы, или вместе с другими клетками, которые секретируют или проявляют другие требуемые терапевтические факторы.

Настоящее изобретение включает также способы продуцирования гормонов с помощью полученных из жировой ткани стромальных клеток. Включены также методы кондиционирования среды с культурой путем воздействия клетки по настоящему изобретению на среду с культурой. Среда затем может быть использована для культивирования других клеток, полученных из жировой ткани.

В изобретении также рассматривается набор для продуцирования полученных из жировой ткани стромальных клеток, у которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака клетки поджелудочной железы, который может включать инструкции по отделению стромальных клеток или стволовых клеток от остатков жировой ткани, а также включает среду для проведения дифференцировки стволовых клеток, причем указанная среда заставляет клетку экспрессировать по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы или же в общем случае стать панкреогенной. Предлагается также набор, который содержит все необходимые компоненты для получения ткани по настоящему изобретению. Указанный набор включает клетку или популяцию клеток по настоящему изобретению, биологически совместимую решетку, а также компоненты, содержащие гидратирующие агенты, субстраты клеточной культуры, среды для выращивания клеточной культуры, другие клетки, антибиотики и гормоны.

Другие цели настоящего изобретения станут более понятны из следующего описания.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предлагается выделенная стромальная клетка, полученная из жировой ткани человека или другого млекопитающего, в которой индуцируют экспрессию по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака клетки поджелудочной железы и предпочтительно эндокринной клетки поджелудочной железы. Клетка может обладать свойствами глюкагонпродуцирующей -клетки, инсулинпродуцирующей -клетки, продуцирующей панкреатический полипептид (PP) -клетки или соматостатинпродуцирующей -клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получают инсулинпродуцирующую -клетку. В клетке по настоящему изобретению можно индуцировать дифференцировку в условиях in vitro либо после имплантации пациенту.

Клетки, полученные способами по настоящему изобретению, могут служить источником частично или полностью дифференцированных, функционально дееспособных клеток, обладающих свойствами зрелых клеток поджелудочной железы, для проведения исследований, трансплантации и развития клеточных терапевтических продуктов, с целью лечения болезней животных, предпочтительно болезней человека, репарации тканей или улучшения тканей и для коррекции ухудшающих условия жизни или угрожающих жизни расстройств обмена веществ. Предлагаются также способы получения указанных клеток.

I. Определения

Эволюционный фенотип обозначает способность клетки приобретать определенный физический фенотип посредством процесса дифференцировки.

Генотип обозначает экспрессию по крайней мере одного транскрипта мРНК гена, связанного с направлением дифференцировки.

Островковая бета-клетка поджелудочной железы обозначает любую клетку, способную секретировать инсулин, аналог инсулина, предшественник инсулина или инсулиноподобный фактор, преимущественно регулируемым образом, более предпочтительно в зависимости от концентрации глюкозы.

Альфа-клетка поджелудочной железы обозначает любую клетку, способную секретировать глюкагон, аналог глюкагона, предшественник глюкагона или глюкагоноподобный фактор, преимущественно регулируемым образом.

Дельта-клетка поджелудочной железы обозначает любую клетку, способную секретировать соматостатин, предшественник соматостатина или соматостатиноподобный фактор, преимущественно регулируемым образом.

РР-клетка поджелудочной железы или гамма-клетка обозначает любую клетку, способную секретировать панкреатический полипептид, его аналог, предшественник или фактор, преимущественно регулируемым образом.

Под инсулином понимают различные инсулины, аналоги инсулина или известные инсулиноподобные факторы. Они включают прогормоны или белки-предшественники инсулина, полностью процессированный белок или же метаболит любого из указанных объектов.

Сахарный диабет обозначает любое болезненное состояние, при котором нарушена функция островковой бета-клетки поджелудочной железы, так что теряется чувствительность к уровню глюкозы в кровотоке. Болезненное состояние может быть следствием врожденного нарушения обмена веществ, травматического повреждения, химического повреждения, инфекционной болезни, хронического приема алкоголя, эндокринопатии, генетических болезней, таких как синдром Дауна, или любых других этиологий, которые вызывают прямое или опосредованное повреждение поджелудочной железы.

Юношеский диабет в данном случае подразумевает небольшой процент больных диабетом пациентов, которых трудно с большой определенностью отнести к фенотипу диабета I или II типа. Он представляет собой генетический дефект функционирования бета-клетки и возникает рано, обычно у людей в возрасте до 25 лет.

Аутоиммунное заболевание в данном случае охватывает любые протекающие в тканях или клетках процессы, опосредованные иммунной системой, которые приводят к отторжению или деструкции эндокринной ткани поджелудочной железы пациента. Этиологией этого процесса, однако приведенными примерами не ограничивается, является иммунная реакция на инфекцию агента, такого как вирус коксаки, или Mycoplasma pneumoniae, врожденная метаболическая предрасположенность к аутоиммунной дисфункции или действие химического реагента.

Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE). Наиболее часто используемым (хотя и не единственным) методом фракционирования полипептидов по их размеру является электрофорез в полиакриламидном геле. Принцип этого метода заключается в том, что молекула полипептида мигрирует сквозь гель таким образом, как если бы он представлял собой сито, которое замедляет движение самых больших молекул в большей степени, а движение самых маленьких молекул в меньшей степени. Чем меньше полипептидный фрагмент, тем больше его подвижность при электрофорезе на полиакриламидном геле. Как до, так и во время электрофореза полипептиды обычно постоянно подвергают воздействию поверхностно-активного додецилсульфоната натрия (SDS), и в этих условиях полипептиды денатурируются. Нативные гели применяют в отсутствие додецилсульфоната натрия. Полипептиды, фракционированные с использованием электрофореза в полиакриламидном геле, можно затем непосредственно наблюдать визуально с помощью метода окрашивания.

Методика вестерн-переноса. Назначение процедуры вестерн-переноса (которую также называют иммуноблоттингом) заключается в физическом переносе полипептидов, фракционированных с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, на фильтр из нитроцеллюлозы или другую подходящую поверхность, при этом сохраняется относительное расположение полипептидов, полученное в процессе фракционирования. Затем пятно можно исследовать с помощью антитела, которое специфично присоединяется к изучаемому полипептиду (или полипептидам).

Очищенный белок или гормон представляет собой белок или гормон, который был выделен из клеточного компонента. Очищенные белки или гормоны были очищены до уровня чистоты, который невозможно наблюдать в природе. Значительно очищенный белок или гормон представляет собой препарат белка или гормона, который содержит лишь такие другие компоненты, которые не оказывают существенного воздействия на свойства гормона или белка.

Под генами эндокринной ткани поджелудочной железы понимают, однако ими не ограничиваются, гены, которые связаны с фенотипом дифференцирующихся или дифференцированных альфа-клеток, бета-клеток, РР-клеток или дельта-клеток эндокринной ткани поджелудочной железы. Эти гены включают, однако ими не ограничиваются, pdx1, pax4, pax6, нейрогенин 1, нейрогенин 2, нейрогенин 3, neuroD, GLUT2, инсулин, Isl1, Hlxb9, Nkx2.2.

II. Полученные из жировой ткани стволовые клетки или стромальные клетки

Жировая стволовая клетка или жировая стромальная клетка обозначают клетки, которые получают из жировой ткани. Под жировой понимают любую жировую ткань. Жировая ткань может быть коричневой или белой жировой клетчаткой, полученной из-под кожи, из сальниковой/висцеральной железы, из молочной железы, из половой железы или другого места расположения жировой ткани. Жировая ткань предпочтительно является белой подкожно-жировой клетчаткой. Подобные клетки могут входить в состав культуры первичной клетки или же иммортализованной клеточной линии. Жировая ткань может быть взята от любого организма, имеющего жировую ткань. Предпочтительно жировую ткань берут от млекопитающего, наиболее предпочтительно берут жировую ткань человека. Удобным источником жировой ткани является хирургическая липосакция, однако источник жировой ткани или способ выделения жировой ткани не является критическим для настоящего изобретения. Липосакция представляет собой сравнительно неинвазивную процедуру, имеющую косметический эффект, которая приемлема для абсолютного большинства пациентов. Широко описано, что жировые клетки являются восполняемой клеточной популяцией. Даже после хирургического удаления липосакцией или после других процедур жировые клетки с течением времени обычно восстанавливаются у пациента в том же самом месте. Из этого следует, что жировая ткань содержит стволовые стромальные клетки, которые способны к самообновлению в адипоциты.

Данные патологии свидетельствуют, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, способны дифференцироваться по различным направлениям дифференцировки. Наиболее распространенные опухоли мягких тканей, липосаркомы, развиваются из адипоцитподобных клеток. Опухоли мягких тканей смешанного происхождения являются относительно общими. Они могут включать элементы жировой ткани, мышцы (гладкие или скелетные), хрящ и/или кость. У пациентов с редким состоянием, известным как прогрессирующая костная гетероплазия, подкожные жировые клетки по неизвестным причинам образуют кость.

Взрослые стромальные клетки человека, полученные из жировой ткани, могут быть размножены ex vivo, подвергнуты дифференцировке по уникальному направлению дифференциации, сконструированы методами генной инженерии и вновь введены индивидууму в качестве аутогенного или аллогенного трансплантанта.

В международной заявке WO 00/53795, поданной The University of Pittsburgh и The Regents of the University of California, и заявке на патент США № 2002/0076400, поданной The University of Pittsburgh, описываются полученные из жировой ткани стволовые клетки и решетки, по существу не содержащие жировые клетки и эритроциты, и клональные популяции стволовых клеток соединительной ткани. Клетки могут быть использованы самостоятельно или вместе с биологически совместимыми композициями для генерирования дифференцированных тканей или структур, как in vivo, так и in vitro. Кроме того, клетки можно размножить и культивировать для продуцирования гормонов и для получения кондиционированных сред для культур, поддерживающих рост и размножение других клеточных популяций. В качестве еще одного аспекта эти публикации приводят полученную из жировой ткани решетку, в значительной степени свободную от клеток, которая включает материал внеклеточного матрикса жировой ткани. Решетка может быть использована в качестве субстрата для облегчения роста и дифференцировки клеток, как in vivo, так и in vitro , в зачатки или зрелые ткани или структуры. Ни в одной публикации не приводятся выделенные из жировой ткани стромальные клетки, в которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного фенотипического или генотипического признака эндокринной клетки поджелудочной железы.

В патенте США № 6391297, выданном компании Artecel Science, приводится композиция из выделенных стромальных клеток, полученных из жировой ткани человека, которые подвергают дифференцировке с тем, чтобы они проявляли по крайней мере один признак остеобласта, и которые могут быть использованы для in vivo заживления кости и для лечения болезней костей. Эту остеобластподобную клетку, полученную из жировой ткани, можно по выбору генетически модифицировать или объединить с матриксом.

В патенте США № 6426222, выданном компании BioHoldings International, приводятся способы индуцирования дифференцировки остеобластов из экстрамедулярной жировой ткани человека путем инкубации клеток жировой ткани в жидкой питательной среде, которая должна содержать глюкокортикоид.

В международной заявке WO 00/44882 и патенте США № 6153432, выданном авторам Halvorsen et al., приводятся способы и композиции для дифференцировки преадипоцитов, полученных из жировой ткани, в адипоциты, обладающие биохимическими, генетическими и физиологическими признаками, аналогичными тем, которые наблюдаются у выделенных первичных адипоцитов.

В международной заявке WO 01/62901 и опубликованной заявке на патент США № 2001/0033834, поданной компанией Artecel Science, приводятся выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, у которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного фенотипического признака нейрональной, астроглиальной, печеночной клетки или гемопоэтической клетки-предшественника. Приводятся также выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, которые подвергают дифференцировке таким образом, чтобы у них отсутствовал фенотипический маркер адипоцита.

В патенте США № 6429013, выданном компании Artecel Science, приводятся композиции на основе выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, у которой индуцируют экспрессию по крайней мере одного признака хрящевой клетки. Приводятся также способы дифференцировки указанных клеток.

В патенте США № 6200606, выданном авторам Peterson et al., указывается, что клетки-предшественники, обладающие потенциальной способностью генерировать кость или хрящ, могут быть выделены из различных кроветворных и некроветворных тканей, включая периферическую кровь, костный мозг и жировую ткань.

Полученные из жировой ткани стромальные клетки, применимые в способах по настоящему изобретению, выделяют с помощью различных способов, известных специалистам в данной области техники, таких как приведенные в международной заявке WO 00/53795, выданной The University of Pittsburgh, и патенте США № 6153432, выданном компании Zen-Bio, Inc. В предпочтительном способе осуществления изобретения жировую ткань берут от млекопитающего, предпочтительно человека. Предпочтительным источником жировой ткани является подкожно-жировая клетчатка. У человека жировую ткань предпочтительно выделяют липосакцией. Если клетки по изобретению предполагается трансплантировать человеку, то жировую ткань предпочтительно берут у того же самого субъекта, с тем чтобы можно было получить аутогенный трансплантант. В качестве альтернативы трансплантированная ткань может быть аллогенной.

В качестве не ограничивающего настоящее изобретение примера, в одном из способов выделения стромальных клеток, полученных из жировой ткани, жировую ткань обрабатывают коллагеназой с концентрацией в диапазоне от 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,04 до 0,2%, наиболее предпочтительно 0,1%, трипсином с концентрацией в диапазоне от 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,04 до 0,4%, наиболее предпочтительно 0,2%, при температуре в диапазоне от 25 до 50°С, предпочтительно в диапазоне от 33 до 40°С, наиболее предпочтительно при температуре 37°С, в течение периода времени в диапазоне от 10 минут до 3 часов, предпочтительно в диапазоне от 30 минут до 1 часа, наиболее предпочтительно в течение 45 минут. Клетки пропускают через сетчатый фильтр из нейлона или марли с размером пор в диапазоне от 20 до 800 микрон, более предпочтительно в диапазоне от 40 до 400 микрон, наиболее предпочтительно 70 микрон. Клетки подвергают дифференциальному центрифугированию непосредственно в среде, или над фиколлом, или перколлом, или в другом заданном градиенте. Клетки центрифугируют с ускорением в диапазоне от 100 до 3000·g, более предпочтительно от 200 до 1500·g, наиболее предпочтительно при 500·g, в течение периода времени в диапазоне от 1 минуты до 1 часа, более предпочтительно от 2 до 15 минут, наиболее предпочтительно в течение 5 минут, при температуре в диапазоне от 4 до 50°С, более предпочтительно в диапазоне от 20 до 40°С, наиболее предпочтительно при 25°С.

Наконец, в еще одном способе выделения стромальных клеток, полученных их жировой ткани, используется механическая система, приведенная в патенте США № 5786207, выданном авторам Katz et al. Система используется для введения образца жировой ткани в автоматическое устройство, его обработки промывочной фазой и диссоциирующей фазой, в котором клетки перемешивают и выращают таким образом, что полученная суспензия клеток собирается в емкости, готовой к центрифугированию. Указанным образом полученные из жировой ткани клетки отделяют от образца ткани, сохраняя клеточную целостность требуемых клеток.

III. Стимулирование полученных из жировой ткани стромальных клеток с целью проявления ими по крайней мере одного признака клетки поджелудочной железы

Настоящее изобретение включает обработку стромальных клеток, полученных из жировой ткани, с целью индуцировать образование клетки, которая экспрессирует по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы. Не ограничивающие настоящее изобретение примеры того, как индуцировать дифференцировку стромальных клеток, полученных из жировой ткани, включают: 1) использование клеточных сред; 2) использование поддерживающих клеток; 3) прямую имплантацию недифференцированных клеток в ткань пациента и 4) методы клеточной инженерии.

А) Стимулирование клеточными средами

Хотя настоящее изобретение не опирается на какую-либо практическую теорию, авторы предполагают, что обработка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в среде, содержащей комбинацию сыворотки, эмбриональных экстрактов, очищенных или рекомбинантных факторов роста, цитокинов, гормонов и/или химических агентов, в двумерном или трехмерном микроокружении, способна индуцировать дифференцировку.

Более конкретно в изобретении предлагается способ дифференцировки полученных из жировой ткани клеток в клетку, имеющую генотипические или фенотипические свойства клетки поджелудочной железы, который включает: посев выделенных взрослых стромальных клеток, полученных из жировой ткани, с требуемой плотностью, включая, но этим не ограничиваясь, плотность приблизительно от 1000 до приблизительно 500000 клеток/см², инкубацию указанных клеток в химически заданной среде для культивирования, которая содержит по крайней мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из: фактора роста, гормона, цитокина, сывороточного фактора, жидкости рецептора нуклеарного гормона или любого другого заданного химического агента.

Основные среды, применимые в способах по настоящему изобретению, включают, однако ими не ограничиваются, Neurobasal (дополнительно содержащую или не содержащую сыворотку плода коровы или основной фактор роста фибробластов (bFGF)), N2, B27, минимальную поддерживающую среду Игла, ADC-1, LPM (без бычьего сывороточного альбумина), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, среду BGJ (с или без модификации Фиттон-Джексона), основную среду Игла (с добавлением солевого основания Игла), модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM - без сыворотки), Yamane, IMEM-20, модифицированную по способу Глазго среду Игла (GMEM), среду Лейбовица L-15, среду Маккоя 5A, среду M199 (M199E - с солевым основанием Игла), среду M199 (M199H - с солевым основанием Хэнкса), минимальную поддерживающую среду Игла (MEM-E - с солевым основанием Игла), минимальную поддерживающую среду Игла (MEM-H - с солевым основанием Хэнкса) и минимальную поддерживающую среду Игла (MEM-NAA - с заменимыми аминокислотами), и среди прочих включают среду 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams'G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Предпочтительной средой для использования по настоящему изобретению является модифицированная по способу Дульбекко среда Игла. Эти и другие применимые среды могут быть получены среди прочих от компании GIBCO (Grand Island, N.Y., США) и Biological Industries (Beth Aemek, Израиль). Ряд этих сред собран в монографии Enzymology, Vol. LVIII, Cell Culture , pp. 62-72 (ed. Jakoby and Pastan, Academic Press, Inc.).

Среды, применимые для дифференцировки стромальных клеток, полученных из жировой ткани, которые экспрессирует по крайней мере один генотипический или фенотипический признак бета-клетки поджелудочной железы, включают секретин или любой аналог или агонист секретина, для которого известно, что он важен для дифференцировки клеток-предшественников в инсулинсекретирующие бета-клетки, как это описано в международной заявке WO 00/47731, поданной компанией Ontogeny, Inc. и др. Среды, применимые в способах по настоящему изобретению, должны содержать сыворотку плода коровы или сыворотку другого видового происхождения с концентрацией по крайней мере приблизительно от 1% до 30%, предпочтительно приблизительно от 5% до 15%, наиболее предпочтительно около 10%. Эмбриональные экстракты цыплят или из другого видового происхождения присутствуют в концентрации приблизительно от 1% до 30%, предпочтительно приблизительно от 5% до 15%, наиболее предпочтительно около 10%.

Факторы роста, цитокины, гормоны, используемые по настоящему изобретению, которые включают, однако ими не ограничиваются, гормон роста, эритропоэтин, тромбопоэтин, интерлейкин 3, интерлейкин 6, интерлейкин 7, колониестимулирующий фактор макрофагов, лиганд c-kit/фактор стволовых клеток, лиганд остеопротегерина, инсулин, инсулиноподобные факторы роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервной ткани, цилиарный нейротрофный фактор, фактор роста тромбоцитов и костный морфогенный белок, в концентрациях от пикограмм на мл до миллиграмм на мл. Например, по данным анализов на колониеобразующие единицы при указанных концентрациях факторы роста, цитокины и гормоны, применимые в способах по настоящему изобретению, способны индуцировать до 100% образование клеток крови (лимфоидного, эритроидного, миелоидного или тромбоцитарного направления дифференцировки) из стромальных клеток, полученных из жировой ткани. (Moore et al. (1973) J. Natl. Cancer Inst. 50: 603-623; Lee et al. (1989) J. Immunol. 142: 3875-3883; Medina et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1507-1515).

Факторы роста, которые, как было показано, способны оказать помощь в получении инсулинпродуцирующих клеток, включают пептиды, GLP-1, экстендин-4, а также аналоги, имеющие в основном гомологичную последовательность аминокислот, как описано в международной заявке WO 00/09666, поданной авторами Egan et al.

Следует также понимать, что в среду для культивирования могут быть добавлены другие компоненты. Подобными компонентами могут быть антибиотики, альбумин, аминокислоты и другие компоненты, известные из области техники для культивирования клеток. Кроме того, могут быть добавлены компоненты для ускорения процесса дифференцировки. Другие химические агенты включают, однако ими не ограничиваются, стероиды, ретиноиды и другие химические соединения или агенты, которые индуцируют дифференцировку стромальных клеток, полученных из жировой ткани, по крайней мере на 25-50% по отношению к положительному контролю.

Следует понимать, что условия сред для культивирования, которые приведены выше, позволяют получать клетку, которая экспрессирует по крайней мере один генотипический или фенотипический признак одного типа панкреатических клеток, т.е. альфа-клеток, бета-клеток, дельта-клеток или PP-клеток поджелудочной железы. Конкретные типы клеток разделяют любыми способами, известными специалистам в данной области техники. Наиболее применимыми являются средства, которые основаны на использовании генотипических или фенотипических признаков, экспрессируемых дифференцированными клетками. Фенотипические маркеры требуемых клеток, которые приведены ниже, хорошо известны специалистам в данной области техники и широко описаны в литературе. Продолжают открываться дополнительные фенотипические маркеры, или же они могут быть идентифицированы без проведения излишних экспериментов. Любые из указанных маркеров используются для подтверждения того, что у взрослых стволовых клеток, полученных из жировой ткани, индуцировано дифференцированное состояние.

Специфичные для направления дифференцировки фенотипические признаки могут включать, однако ими не ограничиваются, поверхностно-клеточные белки, цитоскелетные белки, клеточную морфологию и/или продукты секреции. Альфа-клетки поджелудочной железы среди прочих маркеров экспрессируют глюкагоны. Признаки бета-клеток поджелудочной железы включают экспрессию маркеров, включающих, однако ими не ограничиваются, нестин, pdx1 (известный также, как IDX-1, IPF-1 и STF-1), GLUT2, NeuroD, нейрогенин и инсулин. Кроме того, бета-клетки поджелудочной железы содержат большое количество цинка. Использование нетоксичных чувствительных к цинку флуоресцентных зондов позволяет селективно помечать лабильный цинк в жизнеспособных бета-клетках и выявить возбуждение и эмиссию длин волн в видимом диапазоне спектра, что делает эту методику пригодной для использования в обычных измерительных приборах (Lukowiak B et al., J. Histochem. Cytochem. 2001 Apr; 49(4): 519-28). Клеточный сортинг диссоциированных меченых по методу Newport Green клеток приводит к надежному отделению бета-клеток, что подтверждают по содержанию инсулина на молекулу ДНК и с помощью иммуноцитохимического анализа. При использовании проточной цитометрии или похожих методов сортинга клеток специалист в данной области техники сможет очистить бета-клетки до высокой степени чистоты с помощью данного или сравнимого с ним метода очистки.

Дельта-клетки поджелудочной железы, помимо других маркеров, экспрессируют соматостатин, а PP-клетки поджелудочной железы экспрессируют панкреатический полипептид. Другие маркеры для клеток этого типа включают: рецептор к холецистокинину (ССКА) и KIT-рецептор тирозинкиназы (Schweiger et al., Anat. Histol. Embryol. 2000 Dec; 29(6): 357-61; Rachdi et al., Diabetes 2001 Sep; 50(9): 2021-8).

В альтернативном способе антитела, специфически направленные на маркеры, обнаруженные для различных типов клеток, используют для очистки с помощью хорошо описанных методов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Эти методы включают, однако ими не ограничиваются, иммунохимическую проточную цитометрию, клеточный сортинг и иммуномагнитную очистку. Не ограничивающим настоящее изобретение примером иммуномагнитной очистки является использование иммуномагнитных бусинок Dynabeads, которые представляют собой однородные парамагнитные частицы, покрытые специфическими антителами (например, инсулином, глюкагоном, соматостатином или панкреатическим полипептидом).

Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что с помощью известных калориметрических, флуоресцентных, иммунохимических методов, полимеразной цепной реакции, химических или радиохимических методов можно легко установить присутствие или отсутствие специфического маркера направления дифференцировки.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенная дедефференцированная взрослая стволовая клетка, полученная из жировой ткани, в которой может быть индуцирована экспрессия по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака клетки поджелудочной железы в среде для культивирования, способной осуществить подобную дифференцировку. Дедифференцированную зрелую стволовую клетку, полученную из жировой ткани, идентифицируют по отсутствию маркеров зрелой жировой клетки.

B) Использование поддерживающих клеток для стимулирования дифференцировки стромальных клеток, полученных из жировой ткани

В другом варианте осуществления настоящего изобретения для стимулирования дифференцировки стромальных клеток, полученных из жировой ткани, используют поддерживающие клетки. Поддерживающие клетки могут быть клетками, полученными от человека, или клетками, полученными от животного, не являющегося человеком. Если в качестве поддерживающих клеток используют клетки, взятые от животного, не являющегося человеком, то полученные в итоге дифференцированные клетки имплантируют методом ксенотрансплантации.

Полученные из жировой ткани клетки по настоящему изобретению выделяют и культивируют в популяции клеток, при этом наиболее предпочтительно популяция клеток является заданной популяцией. Популяция клеток является гетерогенной и включает поддерживающие клетки, которые снабжают факторами клетки по настоящему изобретению. Поддерживающие клетки включают другие типы клеток, которые будут стимулировать дифференцировку, рост и поддержание требуемых клеток. В качестве не ограничивающего настоящее изобретение примера, в том случае, если необходимы стромальные клетки, полученные из жировой ткани, которые экспрессируют по крайней мере один генотипический или фенотипический признак бета-клетки поджелудочной железы, стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вначале выделяют с помощью одного из ранее описанных способов и выращивают в культуре в присутствии других поддерживающих клеток. Например, эти поддерживающие клетки преимущественно обладают свойствами клетки поджелудочной железы другого типа, например, альфа-клетки, дельта-клетки, гамма-клетки и PP-клетки. В другом варианте осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки выделяют из первичной культуры указанных клеточных типов, взятых из культивированной ткани поджелудочной железы. Наконец, в еще одном способе осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки выделяют из линии иммортализованных клеток. В некоторых способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аутогенно. В других способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аллогенно.

В настоящем изобретении предполагается также, что клетки, используемые для поддержки дифференцировки требуемой клетки, могут быть превращены в поддерживающие клетки с помощью методов генной инженерии. С помощью любых методов, которые описываются далее, а также хорошо известны специалистам в данной области техники, клетки генетически модифицируются для экспрессии экзогенных генов или для подавления экспрессии эндогенных генов.

C) Имплантация

В соответствии с другим аспектом в настоящем изобретении предлагаются стромальные клетки, полученные из жировой ткани, и дифференцированные клетки, экспрессирующие по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы, которые применимы при аутогенных и аллогенных трансплантациях. Дифференциация проходит in vivo с использованием факторов, которые являются естественными в данной среде, или с использованием введенных факторов. В одном из способов осуществления настоящего изобретения местом, где проводится трансплантация, является пораженная поджелудочная железа. В других способах осуществления настоящего изобретения место для проведения имплантации расположено подкожно или внутрибрюшинно. Предпочтительно субъектом является млекопитающее, более предпочтительно субъектом является человек. В другом способе осуществления настоящего изобретения клетку имплантируют в область, которая нуждается в глюкагоне, панкреатическом полипептиде, соматостатине или инсулине вместе с дополнительными факторами роста или без них. Клетку по настоящему изобретению можно заставить дифференцироваться in vitro или после имплантации пациенту.

Таким образом, в соответствии с еще одним аспектом в настоящем изобретении предлагается способ обеспечения субъекта дифференцированными клетками, экспрессирующими по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы, который включает:

a) выделение стромальных клеток, полученных из жировой ткани;

b) высевание и инкубацию клеток в среде, подходящей для дифференцировки клеток;

c) введение дифференцированных клеток субъекту.

В соответствии с еще одним аспектом в настоящем изобретении предлагается способ обеспечения субъекта недифференцированными стромальными клетками, полученными из жировой ткани, который включает:

a) выделение стромальных клеток, полученных из жировой ткани;

b) введение недифференцированных клеток субъекту.

Предполагается, что когда в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения субъекту вводят недифференцированные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, то их вводят непосредственно в пораженную поджелудочную железу вместе с дополнительными факторами роста или факторами дифференцировки или без них. Наконец, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения недифференцированные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вводят вместе с любыми поддерживающими клетками или факторами дифференцировки, приведенными в настоящем изобретении, которые должны обеспечить среду, подходящую для in vivo дифференцировки стромальных клеток. Например, указанные поддерживающие клетки обладают свойствами панкреатических клеток других типов, например, альфа-клеток, бета-клеток, дельта-клеток, гамма-клеток, PP-клеток. В другом способе осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают из первичных культур клеток указанных типов, которые взяты от культивированной ткани поджелудочной железы. В еще одном способе осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают от линии иммортализованных клеток. В некоторых способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аутогенно. В других способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аллогенно.

В еще одном способе осуществления настоящего изобретения дедифференцированные клетки, полученные из жировой ткани, вводят в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, пригодным для терапевтического применения, которое включает, однако этим не ограничивается, репарацию, регенерацию, реконструкцию или усиление ткани. Полученные из жировой ткани клетки культивируют по методу, приведенному в патенте США № 6153432 (который приводится здесь в качестве ссылки), чтобы подвергнуть их дедифференцировке так, чтобы у дедифференцированных взрослых стромальных клеток можно было затем индуцировать экспрессию генотипических или фенотипических признаков, отличных от генотипических или фенотипических признаков клеток, полученных из жировой ткани. Дедифференцированные клетки, полученные из жировой ткани, модифицируют таким образом, чтобы включить в них последовательность неэндогенного гена, с целью продуцирования требуемого белка или пептида. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения дедифференцированную клетку, полученную из жировой ткани, можно вводить реципиенту в двумерной или трехмерной матрице с целью достижения желаемого терапевтического эффекта. В одном способе осуществления настоящего изобретения дедифференцированную клетку получают аутогенно из собственных клеток пациента. В качестве альтернативы дедифференцированную клетку получают аллогенно.

В еще одном способе осуществления настоящего изобретения дифференцированные клетки по настоящему изобретению дизагрегируют и переносят в суспензии суспендированных клеточных культур с использованием способов, аналогичных приведенным в международной заявке WO 97/15310, поданной The University of Florida Research Foundation, в котором приводятся способы in vitro выращивания функциональных островков Лангерганса из стволовых клеток, полученных из ткани поджелудочной железы, и выращивают до тех пор, пока не появятся явные признаки образования кластеров островковых клеток. Среды, которые содержат кластеры, затем можно проанализировать стандартными методами биохимического анализа, известными специалистам в данной области техники, на присутствие инсулина или других гормонов, которые являются индикаторами эндокринной функции поджелудочной железы. Кластеры или агрегаты могут быть введены инъекцией или инплантированы в ткань реципиента с целью генерации или регенерации ткани.

Инкапсулирование

В настоящем изобретении предлагается способ инкапсулирования дифференцированных клеток, полученных из жировой ткани, в биоматериал, совместимый с методами трансплантации млекопитающему, предпочтительно человеку. Материал для инкапсулирования должен быть выбран таким образом, чтобы он не затруднял высвобождение требуемого белка, который секретируется взрослыми стромальными клетками, полученными из жировой ткани. Используемые материалы включают, однако ими не ограничиваются, производные коллагена, гидрогели, альгинат кальция, агарозу, хиалуроновую кислоту, производные полилактоновой/полигликолевой кислоты и фибрин.

D) Генетические процедуры с клетками по изобретению, полученными из жировой ткани

В еще одном способе осуществления настоящего изобретения клетки, полученные из жировой ткани, которые экспрессируют по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы, генетически модифицируют таким образом, чтобы они могли экспрессировать экзогенные гены или могли подавлять экспрессию эндогенных генов. В настоящем изобретении предлагается способ генетического модифицирования указанных клеток и популяций клеток.

Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая промотор и исследуемую последовательность, может быть введена в прокариотическую или эукариотическую клетку-реципиент в виде нереплицирующейся молекулы ДНК (или РНК), которая может быть либо линейной молекулой, либо, что более предпочтительно, замкнутой ковалентной циклической молекулой. Поскольку подобные молекулы не способны к автономной репликации без источника репликации, то экспрессия гена может осуществляться путем временной экспрессии введенной последовательности. В качестве альтернативы постоянная экспрессия может быть осуществлена посредством интегрирования введенной последовательности ДНК в хромосому реципиента.

В одном из способов осуществления настоящего изобретения используют вектор, который способен интегрировать требуемую генную последовательность в хромосому клетки-хозяина. Клетки, в хромосомы которых стабильно интегрирована введенная ДНК, могут быть отобраны путем дополнительного введения оного или более маркеров, позволяющих осуществить селекцию клеток-хозяев, содержащих требуемую последовательность нуклеиновой кислоты. Если необходимо, маркер может привнести прототрофию ауксотрофному хозяину, биоцидную резистентность, т.е. резистентность к действию антибиотиков или тяжелых металлов, таких как медь и т.д. Последовательность селектируемого генетического маркера может быть как непосредственно присоединена к генной последовательности ДНК, которая будет экспрессироваться, так и введена в ту же самую клетку с помощью котрансфекции. Предпочтительно экспрессию маркера можно количественно оценить и нанести графически.

В предпочтительном способе осуществления настоящего изобретения введенная молекула нуклеиновой кислоты встраивается в плазмидный или вирусный вектор, способный к автономной репликации у реципиента хозяина. Для этих целей может быть использован любой вектор из широкого разнообразия. Важными факторами при выборе конкретного плазмидного или вирусного вектора являются: легкость, с которой клетки реципиента, содержащие вектор, могут быть распознаны и отделены от тех клеток реципиента, которые не содержат указанный вектор; количество копий вектора, которые необходимо осуществить у конкретного хозяина; и то, требуется ли, чтобы он был способен, как челнок , передавать вектор между различными типами клеток хозяина.

Предпочтительные эукариотические клетки включают, например, вирус коровьей оспы, SV40, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и большое разнообразие коммерчески доступных векторов экспрессии млекопитающих на основе плазмиды, которые известны специалистам в данной области техники.

Как только вектор или конструкция (конструкции), содержащая(щие) молекулу нуклеиновой кислоты, подготовлены для экспрессии, конструкцию (конструкции) ДНК вводят в подходящую клетку-хозяин с использованием разнообразных подходящих методов, например, трансформацией, трансфекцией, вирусным инфицированием, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, с помощью технологии «генного ружья», методом преципитации фосфата кальция, прямой микроинъекцией и т.п. После введения вектора клетки-реципиенты выращивают в селекционной среде, в которой селективно растут клетки, содержащие вектор. Экспрессия молекул(ы) клонированного гена приводит к продуцированию гетерологичного белка.

Термин поддержание введенной ДНК в клетках следует понимать таким образом, что введенная ДНК продолжает присутствовать практически во всех представляющих интерес клетках по мере того, как они продолжают расти и пролиферировать. Это означает, что введенная ДНК не вымывается из большинства клеток в процессе многочисленных циклов деления клеток. Он скорее реплицируется в процессе пролиферации клеток, и по крайней мере одна копия введенной ДНК сохраняется практически во всех дочерних клетках. Введенная ДНК может быть сохранена в клетках любым из двух способов. Во-первых, она может непосредственно интегрироваться в геном клетки. Это происходит довольно редко. Во-вторых, она может существовать как внехромосомный элемент или эписома. Для того, чтобы эписома не вымывалась в процессе пролиферации клеток, в веденную ДНК может быть включен селектируемый генный маркер, а клетки выращивают в условиях, где требуется экспрессия генного маркера. Даже в том случае, когда введенная ДНК интегрирована в геном, селектируемый генный маркер может быть включен для предотвращения удаления ДНК из хромосомы.

Генетически измененные клетки могут быть введены в организм разнообразными методами в условиях, пригодных для in vivo экспрессии трансгена. Так, в предпочтительном способе осуществления настоящего изобретения трансген может быть кодирован для продуцирования инсулина. Клетки, содержащие трансген на инсулин, могут быть введены в поджелудочную железу больного человека или другого животного. В качестве альтернативы клетки, содержащие трансген, вводят внутрибрюшинно инъекцией или в какое-либо другое подходящее место для размещения запасного органа.

E) Определение свойств клеток

Под определением свойств полученных дифференцированных клеток понимают идентификацию поверхностных и внутриклеточных белков, генов и/или других маркеров, которые указывают на коммитирование подвергнутых дифференцировке стромальных клеток определенному терминальному состоянию дифференцировки. Эти способы могут включать, однако ими не ограничиваются, (a) определение поверхностно-клеточных белков иммунофлуоресцентными методами с использованием белокспецифичных моноклональных антител, связанных с помощью вторичной флуоресцентной метки, в том числе с использованием методов проточной цитометрии; (b) определение внутриклеточных белков иммунофлуоресцентными методами с использованием белокспецифичных моноклональных антител, связанных с помощью вторичной флуоресцентной метки, в том числе с использованием методов проточной цитометрии; (c) определение генов клетки полимеразной цепной реакцией, in situ гибридизацией и/или анализом по методу нозерн-блоттинга. Определение свойств терминально дифференцированных клеток может быть проведено идентификацией поверхностных и внутриклеточных белков, генов и/или других маркеров, которые указывают на коммитирование стромальных клеток определенному терминальному состоянию дифференцировки. Эти методы, которые приведены выше, включают, однако ими не ограничиваются, (a) определение поверхностно-клеточных белков с помощью иммунофлуоресцентных анализов, таких как проточная цитометрия или in situ иммунное окрашивание белков на поверхности стромальных клеток, полученных из жировой ткани, таких как алкалинфосфатаза, CD44, CD146, интегрин бета-1 или остеопонтин (Gronthos et al., 1994 Blood 84: 4164-4173), инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид, нестин, PDX1, GLUT2, neuroD и нейрогенин; (b) определение внутриклеточных белков с помощью иммунофлуоресцентных методов, таких как проточная цитометрия или in situ иммунное окрашивание стромальных клеток, полученных из жировой ткани, с использованием специфических моноклональных антител; (c) определение экспрессии селективных к линии дифференцирования молекул мРНК, таких как HNF3 , Isl-1, Brain-4, Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, PDX-1, Nkx6-2, Ngn-3, инсулин и Glut-2, такими способами, как полимеразная цепная реакция, in situ гибридизация и/или другой блоттинг-анализ (см. Gimble et al., 1989 Blood 74: 303-311).

F) Использование клеток по настоящему изобретению в качестве терапевтических средств

Клетки и популяции по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве терапевтических средств. В общем случае подобные методы включают перенос клеток в требуемую ткань или в запас. Клетки переносят в требуемую ткань любым подходящим способом, который обычно изменяется в зависимости от типа ткани. Например, клетки можно переносить на трансплантант методом окунания в ванну или его инфузией средой для культивирования, содержащей клетки. В качестве альтернативы клетки можно высеять в требуемом месте внутри ткани для создания популяции. Клетки могут быть перенесены в нужные места in vivo с использованием средств, хорошо известных специалистам в данной области техники, например, с помощью катетеров, троакаров, канюлей или стентов, на которые высеяны клетки, и т.п.

Клетки по настоящему изобретению находят использование для терапии различных заболеваний. Особый интерес представляют заболевания, связанные с эндокринной недостаточностью поджелудочной железы, или заболевания, которые можно лечить с помощью глюкагона, инсулина, панкреатического полипептида или соматостатина.

i) Заболевания, связанные с инсулином

Трансформированные клетки могут быть использованы для лечения любых инсулинзависимых заболеваний, таких как сахарный диабет, в частности, сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа и сахарный диабет II типа у молодых (MODY). Диабетические состояния, для лечения которых используются клетки по настоящему изобретению, могут быть любой этиологии, включая, однако ими не ограничиваясь, генетическую, инфекционную, травматическую или химическую. Другие заболевания, которые лечат клетками по настоящему изобретению, включают заболевания, вызванные липодистрофией, заболевания, индуцированные химическими веществами, заболевания, вызванные панкреатитом, или заболевания, вызванные травмой. Болезненное состояние может быть результатом, например, аутоиммунной дисфункции, или вирусной инфекции, или инфекции другого инфекционного агента.

ii) Заболевания, связанные с глюкагоном

Глюкагонпродуцирующие клетки могут быть использованы для лечения: больных хронической гипогликемией в качестве имплантантов, которые высвобождают глюкагон системно или по требованию; слизистого колита или аналогичных состояний, которые требуют релаксации гладких мышц; и ожирения путем стимулирования глюкагоном липолиза жировых клеток, с целью сокращения массы жировой клетчатки.

iii) Заболевания, связанные с панкреатическим полипептидом

Клетки, секретирующие панкреатический полипептид, могут быть имплантированы и использованы для лечения: инсулиннезависимого сахарного диабета, ожирения или любого состояния, которое приводит к гипертрофии островковых бета-клеток поджелудочной железы, резистентности к инсулину или ненормальному продуцированию глюкозы печенью.

iv) Заболевания, связанные с соматостатином

Трансформированные клетки могут быть использованы для лечения любого заболевания, для которого полезным является введение соматостатина. Так, в настоящем изобретении предполагается, что дифференцированные клетки, которые экспрессируют по крайней мере один признак дельта-клеток (т.е. соматостатинпродуцирующих клеток) поджелудочной железы, применяют для лечения и профилактики заболеваний, в которых участвует соматостатин как таковой или физиологический процесс, который он регулирует. Они включают заболевания эндокринной системы, желудочно-кишечной системы, ЦНС, ПНС, сердечно-сосудистой системы и иммунной системы, а также рак. Таким образом, дифференцированные соматостатинпродуцирующие клетки используют: 1) для ингибирования различных гормональных секреций и трофических факторов у млекопитающих; 2) для лечения заболеваний, включающих, например, секрецию аутокринных и паракринных трофических факторов, включая рак груди, мозга, простаты и легкого (эпидермоида как малых клеток, так и больших клеток), а также гепатомы, нейробластомы, рака толстой кишки и аденокарциномы поджелудочной железы (рака панкреатических протоков), хондросаркомы и меланомы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соматостатинпродуцирующие клетки по настоящему изобретению используют непосредственно для лечения рака или для повышения чувствительности клеток рака для комбинированного лечения с использованием других схем лечения, включая радиотерапию или химиотерапию.

Другие использования указанных клеток также включают супрессию определенных эндокринных секреций, таких как секреция инсулина, глюкагона, пролактина и фактора роста, который, в свою очередь, может далее супрессировать секрецию различных трофических факторов, таких как IGF-1. Клетки по настоящему изобретению, таким образом, показаны для лечения заболеваний с этиологией, охватывающей или связанной с избыточной секрецией фактора роста или трофического фактора. Способность супрессировать указанные секреции полезна при лечении таких заболеваний, как акромегалия. Эта активность также полезна при лечении нейроэндокринных опухолей, таких как карциноиды, ВИПомы, инсулиномы и глюкагономы. Соматостатинпродуцирующие клетки по настоящему изобретению применимы также для лечения диабетов и диабетсвязанных патологий, включая ангиопатию, феномен повышения уровня глюкозы в крови перед едой, нейропатию и ретинопатию (Grant et al., Diabetes Care 2000, 23, 504-509).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения соматостатинпродуцирующие клетки, являющиеся целью настоящего изобретения, используют для лечения сосудистых заболеваний, включая связанные с кровотечением заболевания желудочно-кишечного тракта, такие, которые задействуют систему кровообращения внутренних органов и варикоз пищевода, связанные с такими заболеваниями, как цирроз. Способность соматостатина опосредовать сужение кровеносных сосудов делает соматостатинпродуцирующие клетки применимыми для лечения гистаминной головной боли и мигрени.

Соматостатинпродуцирующие клетки по настоящему изобретению могут быть также использованы для подавления пролиферации эндотелиальных клеток сосудов, а потому показаны для использования при лечении болезней трансплантантов сосудов, таких как рестеноз или закупорка сосудов с последующим инсультом сосудов, таких как ангиопластина, васкулопатия алло- и ксенотрансплантантов, атеросклероз трансплантантов сосудов, и для использования при трансплантации органов (например, трансплантантов сердца, печени, легкого, почки или поджелудочной железы (Weckbecker et al., Transplantation Proceedings 1997, 29, 2599-2600)). Соматостатинпродуцирующие клетки по настоящему изобретению могут также использоваться для ингибирования ангиогенеза и показаны для использования при заживлении ран и лечения рака на стадии метастаз, включая, однако этим не ограничивается, рака легкого, рака груди и рака простаты.

Соматостатинпродуцирующие клетки по настоящему изобретению могут также использоваться для ингибирования желудочной секреции и экзокринной и эндокринной секреции поджелудочной железы и высвобождения различных пептидов желудочно-кишечного тракта. Так, соматостатинпродуцирующие клетки применимы для лечения желудочно-кишечных заболеваний, например, для лечения пептической язвы, язвы, вызванной нестероидным антивоспалительным лекарством (NSAID), язвенного колита, острого панкреатита (например, у пациентов после эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографии), энтерокожного и панкреатокожного свища, нарушения сократительной способности желудочно-кишечного тракта, непроходимости кишечника, хронического атрофического гастрита, неязвенного расстройства пищеварения, склеродермы, слизистого колита, болезни Крона, демпинг-синдрома, синдрома водянистого стула и диареи, вызванной такими заболеваниями, как СПИД или холера (см. O'Dorisio et al., Advances in Endocrinology Metabolism 1990, 1: 175-230).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения приведенные в настоящем изобретении соматостатинпродуцирующие клетки также выполняют свои функции там, где соматостатин необходим в качестве нейромодулятора в центральной нервной системе, с полезным применением при лечении нейродегенеративных заболеваний, таких как инсульт, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и другие формы старческого слабоумия, нарушения психического здоровья (такие как тревожность, депрессия и шизофрения) и при лечении других неврологических болезней, таких как боль и эпилепсия (A.Vezzani et al., European Journal of Neuroscience 1999, 11, 3767-3776).

Соматостатинпродуцирующие клетки могут также применяться в сочетании с другими терапевтическими средствами. Так, в случае проведения трансплантации органов примеры других терапевтических средств включают циклоспорин и FK-506. При лечении опухолей примеры других агентов включают тамоксифен и альфа-интерферон. Для диабета примеры других соединений включают метформин или другие бигуаниды, акарбозу, тиазолидиндионы сульфонилмочевины или другие инсулинсенсибилизирующие соединения, включая, но этими примерами не ограничиваясь, соединения, которые действуют как агонисты гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксимы (PPAR-gamma), инсулин, инсулиноподобный фактор роста I, глюкагоноподобный пептид I (glp-I) и доступные агенты, способствующие насыщению, такие как дексфенфлурамин или лептин.

IV. Тканевая инженерия

Клетки, рассматриваемые в настоящем описании, могут быть использованы для тканевой инженерии. В изобретении предлагаются способы продуцирования животного вещества, которые включают поддержание клеток по настоящему изобретению в условиях, достаточных для их размножения и дифференцировки в требуемое вещество. Вещество может включать, например, часть или даже целую поджелудочную железу. В этом качестве клетки, приведенные в настоящем описании, полезны в сочетании с любыми известными методами тканевой инженерии, включая, однако этими примерами не ограничиваясь, технологии, предлагаемые в следующих публикациях:US Patent Nos. 5902741 and 5863531 to Advanced Tissue Sciences, Inc.; US Patent No. 6139574, Vacanti et al.; US Patent No. 5759830, Vacanti et al.; US Patent No. 5741685, Vacanti; US Patent No. 5736372, Vacanti et al.; US Patent No. 5804178, Vacanti et al.; US Patent No. 5770417, Vacanti et al.; US Patent No. 5770193, Vacanti et al.; US Patent No. 5709854 , Griffith-Cima et al.; US Patent No. 5516532, Atala et al.; US Patent No. 5855610, Vacanti et al.; US Patent No. 5041138, Vacanti et al.; US Patent No. 6027744, Vacanti et al.; US Patent No. 6123727, Vacanti et ai.; USPatent No. 5536656, Kemp et al.; US Patent No. 5144016, Skjak-Braek et al.; US Patent No. 5944754, Vacanti; US Patent No. 5723331, Tubo et al.; and US Patent No. 6143501, Sittinger etal.

Для получения подобных структур клетки и популяции по настоящему изобретению поддерживают в условиях, подходящих для их размножения и деления с образованием органа. Это может быть осуществлено путем переноса клеток или их популяций животному, обычно в то место, в котором необходимо новое вещество. Так, использование настоящего изобретения может ускорить регенерацию клеток поджелудочной железы животного в том месте этих тканей, куда имплантированы клетки.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки заставляют дифференцировать и размножаться с образованием ткани in vitro. В этом качестве клетки культивируют на субстратах, которые облегчают формирование трехмерной структуры, способствующей развитию тканей. Так, например, клетки культивируют или высевают на биосовместимую решетку, например, такую решетку, которая включает материал внеклеточного матрикса, синтетические полимеры, цитокины, факторы роста и т.п. Такой решетке можно придать желаемые формы с целью облегчения развития типов тканей.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается композиция, включающая клетки и клеточные популяции и биологически совместимую решетку. Решетку можно изготовить из полимерного материала, содержащего волокна в виде сетки или губки, при этом расстояния между волокнами обычно составляют порядка от 100 мкм до приблизительно 300 мкм. Такая структура имеет достаточную поверхность, на которой могут расти и пролиферировать клетки. Желательно, чтобы решетка была биоразлагаемой с течением времени так, чтобы она поглотилась животным веществом по мере его развития. Применимые полимеры могут быть получены из таких мономеров, как гликолевая кислота, молочная кислота, пропилфумарат, капролактон и т.п. Другой полимерный материал может включать белок, полисахарид, полиоксикислоту, полиортоэфир, полиангидрид, полифосфоцен или синтетический полимер, в частности биоразлагаемый полимер, или любые их сочетания. Решетка может, если необходимо, включать также гормоны, такие как факторы роста, цитокины, морфогены (например, ретиновую кислоту и т.п.), требуемые материалы внеклеточного матрикса (например, фибронектин, ламинин, коллаген и т.д.) или другие материалы (например, ДНК, вирусы, клетки других типов и т.д.).

Для получения композиции клетки вводят в решетку таким образом, чтобы они проникали в ее интерстициальное пространство. Например, матрицу можно опустить на некоторое время в раствор или суспензию, содержащую клетки, или же клетки можно ввести в матрицу путем инфузии или инъекции. Предпочтительно используют гидрогель, который получают путем сшивки суспензии, содержащей полимер, а также диспергированные в ней клетки по настоящему изобретению. Такой способ получения позволяет диспергировать клетки по всей решетке и тем самым обеспечивает более равномерное проникновение клеток в решетку. Композиция, конечно, может включать зрелые клетки требуемого фенотипа или их предшественники, в частности, с тем, чтобы позволить ввести в решетку стимулирующие клетки или способствовать продуцированию внутри решетки гормонов, таких как инсулин или глюкагон.

Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что решетки, подходящие для включения в композицию, могут быть получены из любого подходящего источника, например матригеля, и могут, конечно, включать коммерческие источники подходящих решеток. Другая подходящая решетка может быть выделена из неклеточной части жировой ткани, например, жировой ткани внеклеточного матрикса, по существу без клеток. Обычно подобная решетка, полученная из жировой ткани, включает белки, такие как протеогликаны, гликопротеины, гиалуронин, фибронектины, коллагены и т.п., которые все служат превосходными субстратами для роста клеток. Кроме того, подобная решетка, полученная из жировой ткани, может включать гормоны, цитокин, фактор роста и т.п. Специалистам в данной области техники известны способы выделения подобной решетки, полученной из жировой ткани, например, способы, описанные в международной заявке WO 00/53795, подданной The University of Pittsburgh, которая приводится здесь в качестве ссылки.

В еще одном способе осуществления настоящего изобретения получают ткань, подобную ткани поджелудочной железы, с использованием методов изготовления твердых форм произвольного вида, позволяющих осуществить регенерацию и рост тканей. Подобные методы описаны, например, в патенте США № 6138573, выданном авторам Vacanti et al., и позволяют создать части органов или органы целиком для имплантации нуждающемуся в них человеку. В частности, эти методы позволяют создать часть поджелудочной железы или поджелудочную железу целиком для имплантации. Создание подобных частей или целых органов проводится с помощью клеток по настоящему изобретению, которые получают аутогенно. В качестве альтернативы подобные части или целые органы создают из клеток по настоящему изобретению, которые получают аллогенно. Предполагается, что для инженерии тканей из клеток по настоящему изобретению применим любой метод, известный специалистам в данной области техники. Например, в патентах США № 6022743 и № 5516681, выданных авторам Naughton et al. (Advanced Tissue Science), описываются методы создания трехмерных систем для культивирования клеток с целью получения ткани, подобной ткани поджелудочной железы. Эти методы включают высевание и имплантирование клеток в матрицу для формирования ткани органа и структурных компонентов, которые дополнительно могут обеспечивать контролируемое высвобождение биоактивных агентов. Матрица характеризуется сетью полостей, которые функционально эквивалентны природной сосудистой сети ткани, сформированной имплантированными клетками, и которые, кроме того, выстланы слоем эндотелиальных клеток. Матрица далее связывается с кровеносными сосудами или другими протоками в процессе имплантации с образованием сети сосудов или протоков по всей матрице. Методики изготовления твердых форм произвольного вида относятся к любому методу, известному из области техники для построения комплексного трехмерного объекта в результате формирования последовательности двумерных слоев. Методы могут быть приспособлены для использования разнообразных полимерных, неорганических и композитных материалов для построения структур с заданными составами, прочностями и плотностями. Таким образом, с помощью указанных методов внутри матрицы можно создать каналы и поры заданного размера с целью контролирования последующего роста и пролиферации внутри матрицы клеток одного или большего количества типов, которые выполняют заданные функции. Подобным образом дифференцированные клетки по настоящему изобретению, соответствующие различным типам клеток поджелудочной железы (т.е. клеток, обладающих по крайней мере одним генотипическим или фенотипическим признаком альфа-, бета-, гамма- или дельта-клетки поджелудочной железы), могут быть объединены с образованием части органа или целого органа. Подобные клетки объединяют в матрицу для получения сети сосудов, выстланных клетками эндотелия, промежутки в которой усеяны клетками. Другие структуры могут быть сформированы для использования в качестве лимфатических протоков, желчных и других экзокринных или экскреторных протоков внутри органа.

Клетки, популяции, решетки и композиции по настоящему изобретению используют в тканевой инженерии и для регенерации тканей. Таким образом, настоящее изобретение относится к пригодным к имплантации структурам, обладающим любыми из рассмотренных в настоящем изобретении особенностей. Конкретный тип имплантанта будет изменяться в зависимости от предназначенного использования. Имплантант может включать зрелую ткань или может включать незрелую ткань или решетку. Так, например, имплантант может содержать популяцию клеток по настоящему изобретению, дифференцирующихся в клетки поджелудочной железы, которые необязательно высеяны внутри решетки подходящего размера и формы. Подобный имплантант вводят с помощью инъекции или вживляют реципиенту для стимулирования генерации или регенерации у пациента зрелой ткани поджелудочной железы.

Полученную из жировой ткани решетку удобно использовать как часть набора клеточной культуры. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается набор, включающий полученную из жировой ткани решетку по настоящему изобретению и один или более других компонентов, таких как гидратирующие агенты (например, воду, физиологически совместимые солевые растворы, приготовленные среды для культивирования клеток, сыворотку или их сочетния или их производные), субстраты для культивирования клеток (например, чашки, пробирки для планшетов и т.д.), среды для культивирования клеток (как в жидкой, так и в порошкообразной форме), антибиотики, гормоны и т.п. Хотя набор может включать любые из указанных ингредиентов, он предпочтительно содержит в правильной комбинации все ингредиенты, необходимые для культивирования и поддержания роста требуемых клеток. Требуемый набор может также включать клетки, которые высевают на решетку, как уже было описано ранее.

Настоящее изобретение теперь будет рассмотрено более подробно с помощью следующих примеров. Настоящее изобретение однако может быть осуществлено во многих различных формах, и его не следует рассматривать как ограниченное приведенными в описании вариантами его осуществления; скорее, эти варианты приведены для того, чтобы описание было доскональным и законченным и полностью раскрывало специалистам в данной области техники объем притязаний по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Методы in vitro индуцирования

Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, выделяют из отходов липосакции по описанной методике (Sen et al., 2001, J. Cell Biochem. 81, 312-319). Эти клетки культивируют в присутствии (однако ими не ограничиваются) следующих сред: Neurobasal (InVitrogen), дополнительно содержащая или не содержащая сыворотку плода коровы (FBS), N2, B27 (InVitrogen), и основной фактор роста фибробластов (bFGF). Проводят модуляцию уровней глюкозы в средах. Клетки высевают с различной плотностью и подкармливают с интервалами в 3-6 дней. Более предпочтительно их высевают с плотностью приблизительно от 1000 до 500000 клеток/см ².

В течение периода культивирования кондиционную среду анализируют с помощью коммерчески доступного радиоиммуноанализа или твердофазного иммуносорбентного анализа на эндокринный гормон поджелудочной железы - инсулин (American Laboratory Products), глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид (Peninsaula Labs Inc.).

Экспрессию фенотипического маркера, связанного с дифференцировкой в направлении различных клеток поджелудочной железы, исследуют путем анализа мРНК по методу OT-ПЦР с использованием специфических праймеров для следующих (однако ими не ограничиваются) генов: HNF3 , Isl-1, Brain-4, Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, PDX-1, Nkx6.2, Nkx2.2, Ngn-3, инсулин и Glut2. Присутствие указанных маркеров и их связь с эндокринными клетками поджелудочной железы была описана ранее (Ramiya et al., 2000, Nat. Med. 6, 278-282; Schwitzgebel et al., 2000, Development 127, 3533-3542; Fernandes et al., 1997, Endocrinology 138, 1750-1762; Zulewski et al., 2001, Diabetes 50, 521-533; Gradwohl et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97, 1607-1611). Проводят также иммуногистохимический анализ (IHC) с использованием антител (однако ими не ограничиваются) против любого из указанных ранее фенотипических маркеров.

Пример 2

Методы генотерапии

Этот метод включает встраивание и экспрессию любого гена, в результате чего у взрослой стволовой клеток индуцируется дифференцировка в клетку, экспрессирующую по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы. Эти гены могут включать, однако ими не ограничиваются, контролируемую экспрессию факторов транскрипции HNF3 , Isl-1, Brain-4, Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, PDX-1, Nkx6.2, Nkx2.2 и Ngn-3. Потенциальные методы введения нуклеиновых кислот в клетки включают, однако ими не ограничиваются, электропортацию, преципитацию фосфатом кальция, ретровирусную, аденовирусную или опосредованную липидом доставку, как детально описано ранее. Клетки анализируют на предмет дифференцировки так же, как подробно описано ранее в примере 1.

Пример 3

In vivo трансплантация

Клетки по настоящему изобретению in vivo имплантируют животным с терапевтической целью и человеку для лечения заболеваний, вызванных расстройством функций эндокринных тканей поджелудочной железы, таких как диабет I типа. Существующие модели грызунов для указанных применений включают мышей без ожирения c инсулиннезависимым сахарным диабетом (мыши NOD-линии), и у мышей или крыс искусственно вызывают диабет путем разрушения островков действием стрептозотоцина (Lumelsky et al., 2001, Science 292, 1389-1394; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). Мышей NOD-линии используют для имплантации островков поджелудочной железы или островков, полученных из стволовых клеток протоков поджелудочной железы (Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415; Lumelsky et al., 2001, Science 292, 1389-1394; Stegall et al., 2001). Дифференцированные клетки по настоящему изобретению, которые экспрессируют по крайней мере один генотипический или фенотипический признак клетки поджелудочной железы, используют для имплантации животным NOD-линии, жизнеспособность которых в обычных условиях поддерживают ежедневными инъекциями инсулина. Подготовка животных для имплантации включает хирургическую операцию, во время которой в надкапсулярной области оболочки почки с помощью иглы номер 27 создают маленький канал, как описано ранее (Ramiya et al., 2000, Nat. Med. 6, 278-282). Исходное количество, составляющее в интервале 10³-10⁶ , эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из зрелых стволовых клеток человека, имплантируют с помощью небольшого катетера и канал прижимают. Можно рассмотреть альтернативную процедуру, в которой подготавливают подкожное место на плече и проводят имплантацию клеток (Ramiya et al., 2000, Nat. Med. 6, 278-282). В обеих этих моделях имплантации в качестве контрольных используют мышей NOD-линии, которым провели симуляцию операции, и мышей NOD-линии, с которыми никаких процедур не проводили. В течение 2-7 дней после проведения хирургической операции животным перестают делать инъекции инсулина. В качестве показателя на функционально дееспособные инсулинпродуцирующие клетки у животных проводят контроль уровней глюкозы в крови на разных стадиях с помощью анализатора глюкозы AccuChek-EZ (Roche). Проводят ELISA анализ на инсулин человека и другие эндокринные гормоны поджелудочной железы. Кроме того, проводят иммуногистохимический анализ мест проведения имплантации с использованием специфических антител человека против инсулина и других белков, которые потенциально могут продуцироваться имплантантом.

Пример 4

Инкапсулирование

Клетки, которые имплантировали, как описано выше, могут быть отторгнуты иммунной системой. Для противодействия этому были разработаны способы с использованием инкапсулированных матриц, которые позволяют проходить секретируемым гормонам из инкапсулированной ткани, но служат защитным барьером против иммунной атаки. См. Ramiya et al., 2000, Nat. Med. 6: 278-282. Подобные барьеры могут включать гель Restalyne на основе хиалуроновой кислоты (Q-Med Sweeden, Упсала, Швеция). В этом подходе исходное количество, составляющее в интервале 10³-10⁶, эндокринных клеток поджелудочной железы, выделенных из зрелых стволовых клеток человека, инкапсулируют в гель. Имплантант помещают в подкожное место, животным прекращают вводить инсулин и проводят анализы, как описано выше в примере 3.

Пример 5

Аллогенная трансплантация

Описан один пример животной модели для изучения аллогенной трансплантации (Stegall et al., 2001, Transplantation 71, 1549-1555). Два штамма (штамм A и штамм B; например, CBA (H-2k) и BALB/c (H2-d)) мышей используют в качестве доноров взрослых стволовых клеток и в качестве реципиентов эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из взрослых стволовых клеток. Донорные эндокринные клетки поджелудочной железы получают из взрослых стволовых клеток штамма A или штамма B, выделенных из донорной популяции мышиных гонадных адипоцитов по аналогии с методикой, описанной выше для стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека. У реципиентов штамма A или штамма B искусственно вызывают диабет действием стрептозотоцина (Stegall et al., 2001, Transplantation 71, 1549-1555). Трансплантацию осуществляют таким образом, чтобы получить следующие комбинации донор/реципиент: 1) изогенная, штамм A - штамму A и штамм B - штамму B; 2) аллогенная, штамм A - штамму B и штамм B - штамму A; 3) в третьей модели в качестве реципиентов донорных клеток штамма A или штамма B используют голых мышей (иммунодефицитных), у которых вызывают диабет с помощью стрептозотоцина. Контроль за животными, которым вводят трансплантант, и проведение анализов осуществляют так же, как описано в примере 3.

Пример 6

Анализ на инсулин

В любой из клеточных культур по настоящему изобретению продукцию инсулина определяют следующим образом. Если коротко, то клетки, выращенные в любом из приведенных выше примеров, промывают трижды не содержащей сыворотку средой, включающей от 5 до 25 ммол/л глюкозы, и инкубируют в 3 мл не содержащей сыворотки среды по крайней мере в течение 2 часов. После этого кондиционированную среду отделяют и уровни инсулина определяют с помощью иммуноферментного анализа на микрочастицах (AXSYM system Insulin kit code B2D010; Abbott Laboratories), который позволяет обнаружить инсулин без возникновения перекрестной реакции с проинсулином или С-пептидом.

Пример 7

Образование кластеров из островков

Трехмерные кластеры из островков формируют, например, по способу Lumelsky et al. (2001, Science 1389-1394). Если коротко, то клетки культивируют с использованием методов, которые описаны в приведенном в данном описании примере 1. Клетки вначале выращивают таким образом, чтобы получить в суспензии сильно обогащенную популяцию нестинположительных клеток, а затем их дополняют не содержащей сыворотки средой ITSFn. Было показано, что в этих условиях пропорция нестинположительных клеток возрастает. Затем клетки размножают в присутствии основного фактора роста фибробластов (bFGF) в не содержащей сыворотки среде N2. Для индуцирования дифференцировки и морфогенеза инсулинсекретирующих островковых кластеров bFGF отделяют от среды, которая содержит добавку среды B27 с никотинамидом. Далее полученные агрегаты или кластеры идентифицируют и проверяют на способность продуцировать инсулин любыми способами, известными специалистам в данной области техники.

Пример 8

Выделение специфических типов клеток поджелудочной железы, дифференцированных из стромальных клеток, полученных из жировой ткани

Одиночные островковые клетки крысы первоначально инкубируют с антителом, специфичным к поверхности бета-клеток (K14D10 мышиный IgG) в течение 20-60 мин. Еще на 15 мин добавляют суспензию иммуномагнитных бусинок Dynabead, покрытых вторым антителом (анти-мышиным IgG), после чего из покрытых бусинками Dynabead клеток немедленно изготавливают таблетку контактированием между трубкой и магнитом (Dynal MPC). Для подтверждения того, что покрытые бусинками Dynabead клетки содержат инсулин и для оценки эффективности метода используют иммуноцитохимический анализ. Покрытые и непокрытые бусинками Dynabead клетки окрашивают на инсулин и глюкагон.

Иммуноочисткой с использованием бусинок Dynabead с выходом 95% получают инсулинсодержащие бета-клетки, которые высвобождают инсулин в ответ на действие изобутилметилксантина и глюкагоноподобного полипептида-1. Содержание инсулина в покрытых бусинками Dynabead клетках значительно выше, чем не покрытых клетках. Успешное разделение получают, используя в качестве исходного материала всего лишь 30 островков. При использовании кометного анализа покрытые бусинками Dynabead клетки показывают одинаковую чувствительность к индуцированному цитокином повреждению ДНК с непокрытыми клетками (Hadjivassiliou et al., Diabetologia 2000 Sep; 43(9): 1170-7).

После ознакомления с представленным выше описанием для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение, должны быть очевидны модификации и другие варианты осуществления настоящего изобретения. Следует поэтому понимать, что приведенные специфические варианты его осуществления не ограничивают настоящее изобретение и что модификации и другие варианты осуществления настоящего изобретения должны быть включены в объем притязаний, изложенных в приведенной далее формуле изобретения. Хотя в описании изобретения приведены специфические термины, они используются лишь как общие и описательные, а не с целью ограничить настоящее изобретение.