свободная от агрегатов уратоксидаза для приготовления неиммуногенных полимерных конъюгатов

Формула изобретения

1. Очищенный препарат грибковой или бактериальной уриказы, в котором не более 2% агрегатов уриказы от общего количества уриказных субъединиц превышают размеры октамера.

2. Очищенный препарат грибковой или бактериальной уриказы по п.1, в котором уриказа является рекомбинантной.

3. Очищенный препарат грибковой или бактериальной уриказы по п.1, в котором уриказа является химерной.

4. Очищенный препарат грибковой или бактериальной уриказы по п.2, в котором уриказа содержит «N-конец» и «С-конец», и в котором уриказа усечена на одном конце или на обоих концах.

5. Очищенный препарат грибковой или бактериальной уриказы по п.1, который является препаратом рекомбинантной уриказы из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. или Candida utilis.

6. Очищенный препарат уриказы беспозвоночного, в котором не более 2% агрегатов уриказы от общего количества уриказных субъединиц превышают размеры октамера.

7. Очищенный препарат уриказы беспозвоночного по п.6, в котором уриказа является рекомбинантной.

8. Очищенный препарат уриказы беспозвоночного по п.6, в котором уриказа является химерной.

9. Очищенный препарат уриказы беспозвоночного по п.8, в котором уриказа содержит «N-конец» и «С-конец», и в котором уриказа усечена на одном конце или на обоих концах.

10. Очищенный препарат уриказы беспозвоночного по п.6, в котором уриказа беспозвоночного выделена из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura или который является препаратом рекомбинантной уриказы из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura.

11. Очищенный препарат уриказы растительной, в котором не более 2% агрегатов уриказы от общего количества уриказных субъединиц превышают размеры октамера.

12. Очищенный препарат уриказы растительной по п.11, в котором уриказа является рекомбинантной.

13. Очищенный препарат уриказы растительной по п.11, в котором уриказа является химерной.

14. Очищенный препарат уриказы растительной по п.12, в котором уриказа содержит «N-конец» и «С-конец», и в котором уриказа усечена на одном конце или на обоих концах.

15. Очищенный препарат уриказы растительной по п.11, который выделен из клубеньков Glycine max или является препаратом рекомбинантной уриказы корневых клубеньков Glycine max.

16. Очищенный препарат уриказы, в котором не более 2% агрегатов уриказы от общего количества уриказных субъединиц превышают размеры октамера.

17. Конъюгат активной уриказы, полученный связыванием очищенного препарата грибковой или бактериальной уриказы по п.1, очищенного препарата уриказы беспозвоночного по п.6 или очищенного препарата растительной уриказы по п.11 с полиалкиленоксидом.

18. Конъюгат по п.17, в котором упомянутый полиалкиленоксид является полиэтиленгликолем.

19. Конъюгат по п.18, в котором упомянутый полиэтиленгликоль является монометоксиполиэтиленгликолем.

20. Конъюгат по п.17, в котором упомянутое объединение достигается связью, выбранной из группы, состоящей из уретановой (карбаматной), вторичной аминной или амидной связей.

21. Конъюгат по п.18, в котором упомянутый полиэтиленгликоль имеет молекулярный вес 5-30 кДа.

22. Конъюгат по п.21, в котором упомянутый полиэтиленгликоль имеет молекулярный вес 10-20 кДа.

23. Конъюгат по п.18, в котором среднее количество молекулярных цепочек упомянутого полиэтиленгликоля, связанного с упомянутой уриказой, варьируется от двух до двенадцати на один элемент уриказы.

24. Конъюгат по п.23, в котором среднее количество молекулярных цепочек упомянутого полиэтиленгликоля, связанного с упомянутой уриказой, варьируется от шести до десяти на один элемент уриказы.

25. Конъюгат по п.23, в котором среднее количество молекулярных цепочек упомянутого полиэтиленгликоля, связанного с упомянутой уриказой, варьируется от семи до девяти на один элемент уриказы.

26. Конъюгат по п.17, в котором упомянутый полиэтиленгликоль является разветвленным.

27. Конъюгат по п.18, в котором упомянутый полиэтиленгликоль не является разветвленным.

28. Фармацевтическая композиция для снижения уровня мочевой кислоты в жидкостях и тканях организма, включающая конъюгат с активной уриказой по п.17 и фармацевтически допустимый носитель.

29. Фармацевтическая композиция по п.28, в которой упомянутая композиция стабилизирована лиофилизацией и может быть растворена посредством реконституции для получения раствора, пригодного для парентерального применения.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Изобретение относится к очищению и химическому модифицированию белков для продления времени их циркуляции и снижения их иммуногенности. Конкретнее, изобретение относится к удалению агрегатов больших, чем октамеры, из уратоксидаз (уриказ) перед конъюгированием поли(этиленгликолей) или поли(этиленоксидов). Это практически исключает иммуногенность уриказы, не ухудшая ее уриколитическое действие.

Описание аналогов

Известно что уратоксидазы (уриказы; Е.С. 1.7.3.3) являются ферментами, которые катализуют окисление мочевой кислоты до более растворимого продукта, алантоина, пуринового метаболита, который выделяется проще.

Люди не вырабатывают ферментативно активную уриказу из-за нескольких мутаций в гене уриказы, произошедших в ходе эволюции высших приматов. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34: 78-84. Вследствие этого у чувствительных индивидов избыточные концентрации мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) и в моче (гиперурикозурия) могут приводить к болезненному артриту (подагре), отложениям солей мочевой кислоты (подагрическим узлам) и почечной недостаточности. У некоторых пораженных индивидов доступные медикаменты, такие, как аллопуринол (ингибитор синтеза мочевой кислоты) вызывают ограничивающие лечение побочные эффекты или не облегчают эти состояния адекватным образом. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76: 47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4: 177-192. Инъекции уриказы могут ослабить гиперурикемию и гиперурикозурию, по крайней мере, временно. Однако, поскольку уриказа является для людей чуждым ферментом, даже первая инъекция немодифицированного белка, взятого от Aspergillus flavus, вызвала анафилактические реакции у нескольких процентов подвергавшихся лечению пациентов (Pui, С-Н, et al., (1997) Leukemia 11: 1813-1816), а иммунологические реакции ограничивают ее полезность для постоянного или прерывающегося лечения. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Med 10: 711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50: 553-554.

Патентная заявка США № 09/370084 и опубликованная международная заявка № PCT/US 99/17514 раскрывают поли(этиленгликоль)-уратоксидазу (ПЭГ-уриказу), которая сохраняет по меньшей мере приблизительно 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и обладает значительно ослабленной иммуногенностью. В одной из таких очищенных уриказ каждая субъединица ковалентно связана со в среднем от 2 до 10 нитей ПЭГ, причем каждая молекула ПЭГ может иметь молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 100 кДа.

Известно также, что агрегирование белков увеличивает их иммуногенность. Это понимание внесло свой вклад в разработку способов преднамеренного агрегирования белков с помощью такой обработки, как термическое денатурирование и перекрестное связывание посредством выдерживания в глутаральдегиде перед приготовлением вакцин или для иммунизации животных с целью вырабатывания антисывороток.

Обнаружено также, что непреднамеренное агрегирование белков вносит вклад в иммунизацию или сенсибилизацию в ходе клинического использования терапевтических белков, например, для гамма-глобулина человека (Henney et al. (1968) N. Engl. J. Med. 278: 2244-2246) и для человеческого гормона роста (Moore et al. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51: 691-697). Вклад агрегатов в иммуногенность человеческого интерферона альфа был продемонстрирован на мышах BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14: 1472-1478), а для его измерения был разработан ферментно-связанный иммуносорбентный тест (ELISA) (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14: 1394-1400).

Таким образом при известности воздействия агрегирования на иммуногенность белков, заявителем не выявлено источников информации, из которых следовала бы известность воздействия агрегирования на иммуногенность белков, конъюгированных с поли(алкиленгликолями), такими, как ПЭГ.

Исходя из этого можно утверждать, что существует потребность в поли(алкиленгликоль)-уриказных конъюгатах, которые практически устраняют иммуногенность уриказы, не ухудшая ее уриколитическую активность. Настоящее изобретение обеспечивает такие соединения.

Сущность изобретения

Конъюгирование белков с поли(алкиленгликолями), в особенности, с ПЭГ, дает конъюгаты со сниженной иммуногенностью и увеличенной живучестью в потоке крови. При попытках получить практически неиммуногенные конъюгаты уриказы, сохраняющие практически всю уриколитическую активность немодифицированного препарата уриказы, было обнаружено, что следы больших агрегатов уриказы в начальном материале были неожиданно эффективны как при провоцировании формирования антител, так и при провоцировании ускоренного выведения из циркуляции, что в обоих случаях является ухудшающими факторами после повторных инъекций ПЭГ-конъюгатов, приготовленных из уриказы, содержащей такие агрегаты.

Изобретателями было установлено, что усиленная иммуногенность и ускоренное выведение происходили не из-за присутствия хорошо определенных, умеренного размера агрегатов субъединиц уриказы больших, чем оригинальный тетрамер, то есть агрегатов, содержащих восемь субъединиц (октамеров). Октамерная форма уриказы представлена в достаточно высоких концентрациях в большинстве препаратов уриказы, чтобы обнаруживаться за счет поглощения ею ультрафиолетового излучения, например, с длиной волны 214 нм или 276 нм, или за счет вклада в коэффициент отражения или с помощью других измерений концентрации белка. Тем не менее, было обнаружено, что вклад самих октамеров в иммуногенность и ускоренное выведение ПЭГ-уриказных конъюгатов минимален, в противоположность гораздо меньшим количествам еще больших агрегатов, которые не обнаруживаются путем ультрафиолетового поглощения в исследуемых условиях, но обнаруживаются путем статического (Рэлеевского) или динамического рассеивания света. Таким образом изобретателями было установлено, что удаление таких следов очень больших агрегатов перед конъюгированием с ПЭГ неожиданно сильно уменьшает иммуногенность и ускоренное выведение получающихся ПЭГ-уриказных конъюгатов.

Одним из вариантов реализации настоящего изобретения является очищенная уратоксидаза (уриказа), практически свободная от агрегатов больших, чем октамеры. Предпочтительно уриказой является уриказа млекопитающего. Более предпочтительно уриказой является уриказа свиной печени, бычьей печени или овечьей печени. В одном из аспектов данного предпочтительного выполнения уриказа является рекомбинантной. В еще одном аспекте данного предпочтительного выполнения уриказа в значительной степени имеет последовательность уриказы свиной, бычьей, овечьей печени или печени бабуина. Предпочтительно уриказа является химерной. Предпочтительно уриказа содержит аминотерминал и карбокситерминал, и уриказа усечена на одном терминале или на обоих терминалах. Преимущественно для настоящего изобретения уриказа является грибковой или микробной уриказой. Предпочтительно грибковая или микробная уриказа выделяется из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. или Candida utilis, или является рекомбинантным ферментом, имеющим в значительной степени такую же последовательность, что и одна из упомянутых уриказ. Альтернативно уриказа является уриказой беспозвоночного. Предпочтительно уриказа беспозвоночного выделяется из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura, или является рекомбинантным ферментом, имеющим в значительной степени такую же последовательность, что и одна из упомянутых уриказ. В еще одном аспекте данного предпочтительного выполнения уриказа является растительной уриказой. Предпочтительно растительная уриказа выделяется из корневых клубеньков Glycine max, или является рекомбинантным ферментом, имеющим в значительной степени такую же последовательность, что и одна из упомянутых уриказ.

В одном из аспектов данного предпочтительного выполнения описанная выше уриказа конъюгируется с поли(этиленгликолем) или полиэтиленоксидом) при таких условиях, чтобы уриказа в конъюгате была практически свободна от агрегатов больших, чем октамеры. Предпочтительно уриказа конъюгируется с поли(этиленгликолем или поли(этиленоксидом) через уретановую (карбаматную), вторичную аминную или амидную связь. В одном из аспектов данного предпочтительного выполнения поли(этиленгликоль) является монометокси поли(этиленгликолем). В еще одном аспекте данного предпочтительного выполнения поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 30 кДа. Предпочтительно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют молекулярный вес приблизительно между 10 кДа и 20 кДа. Преимущественно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 2 и 12 нитями на субъединицу уриказы. Более предпочтительно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 6 и 10 на субъединицу уриказы. Наиболее предпочтительно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 7 и 9 на субъединицу уриказы. Предпочтительно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) является линейным. Альтернативно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) является разветвленным.

Настоящее изобретение также обеспечивает выделенную уриказу, приготовленную в соответствии с вышеописанным способом.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует активность уриказы, общие концентрации белков и солей во фракциях, полученных из анионообменной колонны от Pharmacia Biotech Mono Q (1×10 см). Активность уриказы измерялась при комнатной температуре путем отслеживания уменьшения поглощения длины волны 292 нм 100 мкмоль мочевой кислоты в 200 ммоль бората натрия, рН 9,2. Общее количество белка определялось по площади под кривой пика поглощения уриказы при анализах ВПЖХ с исключением по размеру.

Фиг.2 иллюстрирует анализ с помощью ВПЖХ с исключением по размеру в колонне Pharmacia Superdex 200 (1×30 см) загрузки и избранных фракций, полученных при Mono Q хроматографии свиной уриказы, содержащей мутации R291K и T301S (PKS уриказа), показывающий данные, полученные детектором светорассеивания при 90°С (верхние кривые) и по поглощению при 276 нм (нижние кривые). Очевидны различные силы сигнала тетрамерных, октамерных и более высокоагрегированных форм уриказы в не разделенном на фракции образце (загрузке) и в различных фракциях. Загрузка была разбавлена в соотношении 1/5 с помощью буфера колонны Mono Q, фракция 5 была разбавлена в соотношении 1/3, а фракция 6 была разбавлена в соотношении 1/9. Фракции 5 и 6 комбинировались, формируя "слабосолевой пул".

Фиг.3 иллюстрирует анализы с исключением по размеру фракций, полученных из колонны Mono Q по фиг.1, показывающие данные, полученные детектором светорассеивания при 90° и по поглощению при 276 нм, как на фиг.2. Фракции, показанные на данном чертеже, использовались для формирования "сильносолевого пула", из которого ПЭГ-конъюгаты были приготовлены и инъецированы мышам BALB/c. Результирующие активности сыворотки и иммунологические реакции мышей BALB/c показаны на фиг.5 и 6.

Фиг.4 иллюстрирует содержание октамеров, определенное путем поглощения длины волны 276 нм и с помощью рассеивания света при 90°, рассчитанное по данным Фиг.2 и 3, в не разделенной на фракции PKS уриказе и в избранных фракциях, полученных с помощью хроматографии PKS уриказы в колонне Mono Q (фиг.1).

Фиг.5 иллюстрирует УФ-исследования, как и на фиг.1, активности уриказы после 4 часов инкубирования при 37°С, в сыворотках, изъятых спустя 24 часа после каждой из шести еженедельных инъекций 6×10 кДа ПЭГ-конъюгатов PKS уриказы или пулов фракций из колонны Mono Q.

Фиг.6 иллюстрирует анализы ELISA формирования антитела IgG к ПЭГ-конъюгатам PKS уриказы и к ПЭГ-конъюгатам пулов фракций из колонны Mono Q, показанной на фиг.1, в сыворотках, изъятых спустя 24 часа после каждой из шести еженедельных инъекций 0,2 мг уриказного белка на каждые 20 граммов веса тела самок мышей BALB/c. Для каждой мыши данные по крови 24 часа после первой - шестой инъекции показаны слева направо. Условия исследования описаны в примере 6. Данные для восьми мышей в каждой группе организованы в порядке возрастания иммунной реакции, слева направо.

Фиг.7А показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из Candida utilis в виде функции количества нитей PEG, связанных с подъединицей.

Фиг.7В показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из Candida utilis в виде функции общей массы PEG, связанного с подъединицей.

Фиг.8А показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из свиной печени в виде функции количества нитей PEG, связанных с подъединицей.

Фиг.8В показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из свиной печени в виде функции общей массы PEG, связанного с подъединицей.

Фиг.9А показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из Aspergillus flavus в виде функции количества нитей PEG, связанных с подъединицей.

Фиг.9В показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из Aspergillus flavus в виде функции общей массы PEG, связанного с подъединицей.

Фиг.10А показывает сохранение активности PEG-илированной рекомбинантной уриказы узелка соевого корня в виде функции количества нитей PEG, связанных с подъединицей.

Фиг.10В показывает сохранение активности PEG-илированной рекомбинантной уриказы узелка соевого корня в виде функции общей массы PEG, связанного с подъединицей.

Подробное описание предпочтительных вариантов выполнения изобретения

Предыдущие исследования показали, что когда значительное снижение иммуногенности и/или антигенности уриказы достигается путем конъюгирования с ПЭГ (ПЭГиляции), оно неизменно связано со значительной потерей уриколитической активности. В соответствии с настоящим изобретением установлено, что следы агрегатов уратоксидаз больших, чем октамеры, вносят значительный вклад в иммуногенность и ускоренное выведение ПЭГ-уриказных конъюгатов. Это явление, установленное изобретателями, наиболее применимо к отличным от уриказ белкам, в том числе к интерферонам и факторам роста.

На безопасность, удобство и финансовую выгоду биомедикаментов отрицательно действует снижение их силы и вытекающая из этого необходимость увеличения дозы введения. Таким образом, существует необходимость в безопасном и эффективном альтернативном средстве для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкостях организма, в том числе в крови и в моче. Настоящее изобретение обеспечивает производство уриказы, свободной от уриказных агрегатов больших, чем октамеры, для использования при синтезе ПЭГ-уриказы. Данная ПЭГ-уриказа сохраняет всю или почти всю уриколитическую активность немодифицированного фермента. Также настоящее изобретение обеспечивает создание очищенного препарата уриказы, практически свободной от агрегатов больших, чем октамеры. Термин "практически свободная" указывает на то, что очищенная уриказа содержит не более приблизительно 2%, а предпочтительно не более приблизительно 1% агрегатов больших, чем октамеры.

Настоящее изобретение обеспечивает получение очищенной уриказы, в которой агрегаты большие, чем октамеры, исключаются из очищенного препарата. Поскольку эти большие агрегаты являются сильно иммуногенными, их наличие в очищенном уриказном препарате нежелательно. В процессе очистки осуществляется отслеживание колоночных фракций с помощью светорассеивания вместо или в дополнение к поглощению ультрафиолетового излучения с длиной волны 280 нм, поскольку эти агрегаты могут быть слишком разбавлены, чтобы обнаруживаться с помощью поглощения ультрафиолетового излучения. Очищенная уриказа затем конъюгируется с водорастворимыми полимерами, предпочтительно с поли(этиленгликолями) или поли(этиленоксидами), как описано в совместно рассматриваемой патентной заявке США № 09/370084.

Устранение агрегированной уриказы из препарата, состоящего преимущественно из тетрамерной уриказы, может выполняться любым из способов, известных специалистам, в том числе путем хроматографии с исключением по размеру, ионообменной хроматографии, ультрафильтрации сквозь микропористую мембрану и центрифугирования, в том числе ультрацентрифугирования. Способ отделения может содержать разделение и анализ фракций и устранение или исключение тех фракций, которые содержат избыточные количества больших агрегатов. Получаемый уриказный препарат в большей степени пригоден для синтеза практически неиммуногенных конъюгатов уриказы, чем неразделенная на фракции уриказа. Для постоянного введения важно, чтобы ПЭГ-конъюгаты белков, например, ПЭГ-уриказа, имели низкую иммуногенность и не вызывали прогрессирующе быстрое выведение из потока крови после повторяющихся дозировок.

На основе очищенного препарата уриказы изготавливаются фармацевтические составы полимерно-уриказных конъюгатов. Эти конъюгаты являются практически неиммуногенными и сохраняют по меньшей мере 75%, предпочтительно 85%, а более предпочтительно 95% или более уриколитической активности немодифицированного фермента. Уриказы, пригодные для конъюгирования с водорастворимыми полимерами, включают в себя уратоксидазы естественного происхождения, выделенные из бактерий, грибов и тканей растений и животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, а также рекомбинантные формы уриказы, в том числе мутантные, гибридные и/или усеченные ферментативно активные варианты уриказы. Водорастворимые полимеры, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя линейные и разветвленные поли(этиленгликоли) или поли(этиленоксиды), совместно известные как ПЭГ. Примеры разветвленных ПЭГ являются предметом патента США № 5643575. Одним из предпочтительных примеров ПЭГ является монометокси ПЭГ с общей структурой СН₃О·(СН ₂СН₂O)_nН, где n варьируется от приблизительно 100 до приблизительно 2300.

Одним из вариантов выполнения настоящего изобретения является конъюгат уратоксидазы (уриказы), который сохраняет по меньшей мере приблизительно 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и обладает значительно сниженной иммуногенностью. Уриказа по данному аспекту изобретения может быть рекомбинантной. Является она рекомбинантной или нет, это может быть уриказа, происходящая от млекопитающего. В еще одном аспекте данного выполнения уриказа может быть химерической. Уриказа по настоящему изобретению, какого бы происхождения она не была, может также быть в усеченной форме, либо со стороны аминотерминала, либо со стороны карбоксилового терминала, либо с обоих сторон. Подобным же образом уриказа может быть грибной или микробной уриказой. В одном из аспектов данного варианта выполнения грибная или микробная уриказа может являться естественной или рекомбинантной формой уриказы из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. или Candida utilis. Альтернативно уриказа может быть уриказой беспозвоночного, такой, как, к примеру, естественная или рекомбинантная форма уриказы из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura. Уриказа по изобретению может быть также растительной уриказой, например, естественной или рекомбинантной формой уриказы из клубеньков соевого корня (Glycine max). ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 100 кДа; предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно между 8 кДа и 60 кДа; более предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес между приблизительно 10 кДа и приблизительно 40 кДа, например, от 10 до 20 кДа. Среднее количество ковалентно связанных нитей ПЭГ может составлять от 2 до 12 нитей на субъединицу уриказы; предпочтительно, среднее количество ковалентно связанных нитей составляет от 6 до 10 на субъединицу; более предпочтительно, среднее количество нитей ПЭГ составляет от 7 до 9 на субъединицу. В одном из аспектов данного выполнения уриказа может быть тетрамерной. Нити ПЭГ могут быть ковалентно связаны с уриказой через уретановые (карбаматные) связи, вторичные аминные связи и/или амидные связи. Если уриказа является рекомбинантной формой любой подразумеваемой здесь уриказы, то эта рекомбинантная форма может в значительной степени иметь последовательность естественной формы.

Одной из предпочтительных уриказ млекопитающего является рекомбинантная химерическая уриказа свиньи-бабуина, составленная из частей последовательностей уриказы свиной печени и печени бабуина, обе из которых были впервые определены Wu, et al., (1989). Один из примеров такой химерической уриказы содержит первые 288 аминокислот свиной последовательности (ПОСЛ. № 1), а последние 16 аминокислот бабуиновой последовательности (ПОСЛ. № 2). Hershfield, et al., International Publication WO 00/08196, Urate Oxidase, опубликовано 17 февраля 2000. Поскольку последняя последовательность отличается от свиной последовательности только в двух позициях, содержит лизин (К) вместо аргинина в остатке 291 и серин (S) вместо треонина в остатке 301, этот мутант обозначается как свиная-K-S, или PKS уриказа (ПОСЛ. № 3). PKS уриказа имеет на один лизиновый остаток больше и, следовательно, на один потенциальный сайт ПЭГилирования больше, чем свиная или бабуиновая последовательности.

кДНК для различных уриказ млекопитающих, в том числе PKS уриказы, были субклонированы, и были определены оптимальные условия для эксэкспрессии в Е.coli с помощью стандартных способов. См. Erlich, НА, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Рекомбинантные уриказы экстрагировались, очищались, а их стабильность и активность исследовались с помощью модификаций стандартных тестов. См. Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240: 2491-2494; Nishimura, et al., (1979), и Примеры 1 и 5.

В одном из вариантов выполнения изобретения уриказа может конъюгироваться с помощью биологически стабильной, нетоксичной, ковалентной связи с относительно небольшим количеством нитей ПЭГ. Такие связи могут быть уретановыми (карбаматными) связями, вторичными аминными связями и амидными связями. Различные активированные ПЭГ, пригодные для такого конъюгирования, доступны коммерчески у фирмы Shearwater Polymers, Huntsville, AL.

Например, уретановые связи с уриказой могут формироваться путем инкубирования уриказы в присутствии сукцинимидилкарбонатного (СК) или р-нитрофенилкарбонатного (НФК) производного ПЭГ. СК-ПЭГ может быть синтезирован с помощью процедуры, описанной в патенте США № 5612460. НФК-ПЭГ может быть синтезирован путем реагирования ПЭГ с р-нитрофенилхлорформатом в соответствии со способами, описанными в Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochen Biotechnol 11: 141-152, и в патенте США № 5286637. Способы, описанные в патенте '637, адаптированы для ПЭГ с большим молекулярным весом путем регулирования концентраций реагентов для поддержания подобной стехиометрии. Альтернативный способ синтеза НФК-ПЭГ описан в Buttner, W, et al., описание патента ГДР № 279486 A1.

Амидные связи с уриказой могут быть получены с помощью N-гидроксисукцинимидного сложноэфирного карбоксилово-кислотного производного ПЭГ (Shearwater Polymers). Вторичные аминные связи могут быть сформированы с помощью 2,2,2-трифторэтансульфонилового ПЭГ (тресил ПЭГ; Shearwater Polymers) или путем восстанавливающего алкилирования с помощью ПЭГ-альдегида (Shearwater Polymers) и цианборгидрата натрия.

В конъюгатах, содержащих ПЭГ с молекулярным весом 10 кДа, максимальное количество нитей ПЭГ, которые связывались с одной субъединицей при сохранении по меньшей мере 75% уриколитической активности немодифицированного фермента, составляло приблизительно 12 нитей для уриказ млекопитающих (например, PKS уриказы, мутеина свиной уриказы; см. условия теста в Примере 5). Последний объем ПЭГилирования соответствовал приблизительно 40% всех аминогрупп. В одном из вариантов выполнения изобретения среднее количество нитей ПЭГ, связанных с субъединицей уриказы, составляло приблизительно между 2 и 12. В предпочтительном выполнении среднее количество нитей ПЭГ, связанных с субъединицей уриказы, составляло приблизительно между 6 и 10. В более предпочтительном выполнении среднее количество ковалентно связанных с субъединицей уриказы нитей ПЭГ составляло приблизительно между 7 и 9. В еще одном выполнении молекулярный вес ПЭГ, использованных в реакции связывания, составлял приблизительно между 5 кДа и 30 кДа, предпочтительно приблизительно между 10 кДа и 20 кДа.

Существует несколько факторов, которые могут влиять на выбор оптимального молекулярного веса и количества нитей ПЭГ для связывания с определенной формой уриказы. В целом уменьшение или устранение иммуногенности без значительной потери уриколитической активности может потребовать связывания сравнительно большего количества нитей ПЭГ более низкого, молекулярного веса по сравнению с относительно меньшим количеством нитей ПЭГ более высокого молекулярного веса. Подобным же образом, каждая отличная форма уриказы может иметь различный оптимум по отношению и к размеру, и к количеству нитей. Оптимальное количество нитей ПЭГ и молекулярный вес ПЭГ могут быть определены с помощью описываемых здесь способов.

Если ПЭГ-конъюгаты уриказы млекопитающего были приготовлены из очищенных тетрамерных и октамерных форм фермента (содержащих четыре или восемь субъединиц весом приблизительно 35 кДа), они проявляли коренным образом ослабленную иммуногенность у мышей, в противоположность умеренной иммуногенности ПЭГ-конъюгатов препаратов уриказы, содержавших большие агрегаты (см. фиг.6), и очень высокой иммуногенности немодифицированного фермента.

Очищенные препараты естественных и рекомбинантных уриказ обычно содержат смесь очень больших агрегатов фермента вдобавок к тетрамерной (140 кДа) и октамерной (280 кДа) формам. Процент уриказы, находящейся либо в тетрамерной, либо в октамерной форме в каждом уриказном препарате, обычно варьируется приблизительно от 20% до 95% (см. фиг.2-4). Несмотря на очевидность того, что неПЭГилированные агрегаты нескольких других белков являются высокоиммуногенными (например, см. Moore, WV, et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51: 691-697), предшествующие исследования ПЭГ-уриказы не описывали никаких попыток ограничить содержание агрегатов, что говорит о том, что потенциальная иммуногенность ПЭГ-модифицированных агрегатов не рассматривалась. На основе наблюдений изобретателей представляется вероятным, что такие агрегаты присутствовали в ферментных препаратах, использовавшихся ранее для синтеза ПЭГ-уриказы. Их присутствие могло усложнять задачу приготовления неиммуногенных конъюгатов. Представляется также, что большие потери уриколитической активности, наблюдавшиеся при предыдущих попытках ПЭГилирования уриказы, были связаны с большим количеством нитей ПЭГ низкого молекулярного веса, которые связывались. С другой стороны, способы очистки и ПЭГилирования уриказы, описанные здесь, обеспечивают ковалентное присоединение 12 нитей ПЭГ на субъединицу, сохраняя при этом более 75% уриколитической активности, по меньшей мере для некоторых уриказ, например, PKS уриказы (мутеина свиных уриказ) и фермента из термофильной Bacillus sp.

В еще одном предпочтительном выполнении практически все большие агрегаты фермента могут быть удалены путем ионообменной хроматографии (фиг.1-3) или хроматографии с исключением по размеру при рН приблизительно между 9 и 10,5, предпочтительно 10,2 перед конъюгированием полученного практически свободного от агрегатов препарата уриказы с ПЭГ. Молекулярный вес уриказы в каждой фракции, полученной из препарационной колонны, может быть отслежен посредством любой зависящей от размера аналитической технологии, в том числе, например, ВПЖХ, общепринятой хроматографии с исключением по размеру, центрифугирования, светорассеивания, капиллярного электрофореза или гелевого электрофореза в неденатурирующем буфере. Для свободной от агрегатов уриказы, выделенной с помощью хроматографии с исключением по размеру, только фракции, содержащие формы фермента с весом 140 кДа и 280 кДа, могут объединяться и использоваться для конъюгирования с ПЭГ. Для тетрамерной и октамерной уриказы, выделенной с помощью ионообменной хроматографии, фракции, полученные из ионообменной колонны, могут анализироваться в отношении размера для определения того, какие фракции содержат значительные количества тетрамерных и октамерных форм без больших агрегатов, с помощью светорассеивания. В очищенном продукте нежелательные большие агрегаты могут, таким образом, составлять не более приблизительно 1% или менее от всей уриказы.

Результаты, представленные здесь, показывают, что, даже в случае сильного ПЭГилирования, формы PKS уриказы большие, чем октамеры, провоцируют ускоренное выведение (фиг.5) и являются в некоторой степени иммуногенными для мышей (фиг.6). Напротив, конъюгаты, приготовленные из уриказы, которая практически была свободна от больших агрегатов (обнаруживаемых с помощью светорассеивания), могут повторно инъецироваться по меньшей мере шесть раз с интервалом в одну неделю с гораздо менее заметным увеличением скоростей выведения (фиг.5) и без обнаруживаемого формирования антител, как было показано с помощью чувствительного ферментносвязанного иммунотеста (фиг.6). Использование высокоочищенной тетрамерной или октамерной уриказы дополнительно отличает улучшенные конъюгаты по настоящему изобретению от препаратов ПЭГ-уриказы, описанных ранее. Напротив, наличие значительного количества больших агрегатов в препаратах уриказы, использовавшихся некоторыми прежними исследователями, могло приводить к попыткам связывания большого количества нитей ПЭГ для подавления иммуногенности. Вследствие этого ферментативная активность получавшихся конъюгатов сильно ослаблялась.

ПЭГ-уриказные конъюгаты по настоящему изобретению полезны для снижения уровней мочевой кислоты в жидкостях и тканях организма млекопитающих, предпочтительно людей, и, таким образом, могут использоваться для лечения повышенных уровней мочевой кислоты, связанных с такими состояниями, как подагра, подагрические узлы, почечная недостаточность, трансплантация и злокачественное заболевание органа. ПЭГ-уриказные конъюгаты могут инъецироваться млекопитающему, имеющему избыточные уровни мочевой кислоты, любым из нескольких маршрутов, в том числе внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно и внутрибрюшинно. Альтернативно, они могут распыляться и ингалироваться. См. Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19: 3-36 и патент США № 5458135. Эффективная дозировка ПЭГ-уриказы по настоящему изобретению будет зависеть от уровня мочевой кислоты и размера индивида. В одном из вариантов выполнения этого аспекта изобретения ПЭГ-уриказа вводится в фармацевтически приемлемом наполнителе или разбавителе в количестве от приблизительно 10 мкг до приблизительно 1 г. В предпочтительном выполнении вводимое количество составляет приблизительно между 100 мкг и 500 мг. Более предпочтительно конъюгированная уриказа вводится в количестве между 1 мг и 100 мг, например, 5 мг, 20 мг или 50 мг. Массы, заданные для дозировок по вариантам выполнения, относятся к количеству белка в конъюгате.

Фармацевтические формулы, содержащие ПЭГ-уриказу, могут быть приготовлены посредством общепринятых технологий, например, как описано в Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Easton, PA: Mack Publishing Co. Пригодные наполнители для приготовления инъекционных растворов включают в себя, например, фосфатно-буферный солевой раствор, лактатный раствор Рингера, воду, полиоли и глицерин. Фармацевтические составы для парентеральной инъекции содержат фармацевтически приемлемые стерильные водные и неводные жидкости, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий прямо перед использованием. Эти формулы могут содержать такие дополнительные компоненты, как, к примеру, консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, буферы, антиоксиданты и разбавители.

ПЭГ-уриказа может также предоставляться в виде составов с управляемым высвобождением для имплантации индивиду для продолжительного управления повышенными уровнями мочевой кислоты в жидкостях организма. Например, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, регенерированный коллаген, поли-L-лизин, алгинат натрия, геллановая резина, хитозан, агароза, многопластинчатые липосомы и многие общепринятые формулы пролонгированного действия содержат биоэродирующие и биоразрушаемые материалы, которые могут вводиться в формулу с биологически активными составами. Эти материалы, будучи имплантированными или введенными путем инъекции, постепенно разрушаются и высвобождают активный материал в окружающую ткань. Например, один из способов инкапсулирования ПЭГ-уриказы содержит способ, раскрытый в патенте США № 5653974. Использование биоэродирующих, биоразрушаемых и прочих формул пролонгированного действия явно подразумевается в настоящем изобретении. Использование инфузионных насосов и систем матричного захвата для доставки ПЭГ-уриказы также входит в объем настоящего изобретения. ПЭГ-уриказа также может выгодным образом внедряться в мицеллы или липосомы. Технология липосомной инкапсуляции хорошо известна из уровня техники. См., например, Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press.

Фармацевтические составы с ПЭГ-уриказой, изготовленные в соответствии с настоящим изобретением, уменьшают потребность в гемодиализе для пациентов с высоким риском вызванной уратами почечной недостаточности, например, для пациентов с трансплантированным органом (см. Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56: 317-321) и пациентов с некоторыми злокачественными заболеваниями. У пациентов с большими отложениями кристаллических уратов (подагрическими узлами) такие фармацевтические составы улучшат качество жизни более быстро, чем доступные в настоящий момент лечения.

Последующие примеры, которые не следует рассматривать, как какое-либо ограничение изобретения, иллюстрируют различные раскрытые выше аспекты. Эти примеры описывают ПЭГ-уриказы, приготовленные путем связывания активированного ПЭГ (например, производного р-нитрофенил-карбоната) с мутеином свиной уриказы. Эти примеры дают специалисту руководство для производства практически неиммуногенных конъюгатов уриказы, которые сохраняют по меньшей мере приблизительно 75% уриколитической активности немодифицированного фермента и хорошо пригодны для постоянного введения.

Пример 1

Препаративная ионообменная хроматография уриказы

Препаративная ионообменная хроматография выполнялась на аппарате быстрой белковой жидкостной хроматографии (ББЖХ) (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Колонна Mono Q (1×10 см, Amersham Pharmacia) элюировалась градиентом от 50 ммоль карбоната натрия, рН 10,3, 0,1 моль NaCl (буфер А) до 50 ммоль карбоната натрия, рН 10,3, 0,6 моль NaCl (буфер Б) со скоростью потока 0,5 мл/мин, за исключением того, что образец загружался с более низкой скоростью потока. Эта технология использовалась для разделения на фракции 25 мл раствора PKS уриказы (рН 10,3), PKS уриказа была получена у фирмы Bio-Tecnology General Limited (Rehovot, Israel). Уриказа являлась рекомбинантной свиной уриказой, в которой один лизиновый остаток (К) и один сериновый остаток (S) заменили один аргининовый остаток и один треониновый остаток, соответственно, в родительской свиной последовательности (Lee et al., (1988) Science 239: 1288-1291; Wu et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 9412-9416). После загрузки образца колонна промывалась с помощью 100 мл буфера А. Пик уриказы начал элюировать в конце 31-мл линейного буфера Б с градиентом от 0 до 26%. Большая часть уриказы изократически элюировала за счет 7 мл буфера, содержащего 26% буфера Б. Остаток восстановленной уриказы элюировался с помощью линейного 89-мл буфера Б с градиентом от 26% до 100%. Фракции 4 мл или 6 мл собирались. Аликвотные количества фракций № 4-11 тестировались на уриказу и общее содержание белка (фиг.1) и анализировались путем высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВПЖХ) с исключением по размеру, как описано в Примере 2 (фиг.2 и 3). Оставшиеся части фракций № 5-10 связывались с ПЭГ, как описано в Примере 3. На основании результатов анализов Примера 2 ПЭГ-конъюгаты фракций № 5 и 6 комбинировались в качестве "слабосолевого пула", а ПЭГ-конъюгаты фракций № 7-10 комбинировались в качестве "сильносолевого пула", как показано на фиг.1.

Пример 2

Хроматография с исключением по размеру уриказы. отслеженной путем светорассеивания и ультрафиолетового поглощения

ВПЖХ с исключением по размеру выполнялась при комнатной температуре на колонне Superdex 200 (1×30 см, Amersham Pharmacia Biotech) над не разделенной на фракции PKS уриказой и над избранными фракциями из препарационной Mono Q-хроматографии PKS уриказы по Примеру 1. Элюат из монитора поглощения (UV 2000) Thermo Separations HPLC (Sunnyvale, CA) анализировался путем светорассеивания при угле падения света 90° с помощью детектора MiniDawn компании Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA).

Результаты, показанные на фиг.2-4, иллюстрируют различие между тетрамером, октамером и большими агрегатами субъдиниц уриказы и различные сигналы, зафиксированные от этих форм уриказы в различных образцах. В отличие от сигнала поглощения, который прямо пропорционален концентрации, сигнал светорассеивания пропорционален произведению концентрации и размера светорассеивающей единицы. Результирующая чувствительность детектора светорассеивания к очень малым количествам сильноагрегированной уриказы позволила обнаружить наличие самых больших агрегатов, которые элюировали при пустом объеме (приблизительно 7 мл).

Пример 3

Синтез ПЭГ-уриказных конъюгатов

Не разделенная на фракции PKS уриказа (от Bio-Technology General Limited) и уриказа в виде фракций из колонны Mono Q по Примеру 1 связывались с ПЭГ весом 10-40 кДа с помощью р-нитрофенилкарбонатного производства ПЭГ (НФК-ПЭГ), полученного от Shearwater Polymers (Huntsville, AL). Получение НФК-ПЭГ из ПЭГ с помощью фенилхлорформатов было описано в нескольких отчетах (например, Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11: 141-152; Kito, M, et al., (1996) J Clin Biochem Nutr 21: 101-111), а НФК-ПЭГ использовался для синтеза ПЭГ-белковых конъюгатов предыдущими исследователями, в том числе и настоящими изобретателями (например, Veronese, FM, выше; Sherman, MR, et al., в JM Harris, et al., (Eds.) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp.155-176) Washington, DC: American Chemical Society). Количество нитей ПЭГ весом 10-40 кДа, связанных с каждой субъединицей уриказы, определялось равным шести в соответствии со способом, описанным у Kunitani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588: 125-137.

Пример 4

Устойчивость и иммуногенность уриказы и ПЭГ-уриказы в сыворотке in vivo

ПЭГ-коъюгаты рекомбинантных уриказ млекопитающих, приготовленные в соответствии со способом по Примеру 3, регулировали до 1 мг белка в фосфатно-буферном солевом растворе (ФБС), рН 7,4 для инъецирования. Образцы были заморожены и хранились до анализа или инъецирования. Образцы нагревались до 37°С вплоть до 1 часа перед инъецированием группам из восьми самок мышей BALB/c. Группы мышей имели средний вес в диапазоне 18-22 г в начале исследования.

Вес всех мышей отслеживался и записывались показания по всем обратным реакциям на инъекции или прочим болезненным состояниям. Через двадцать четыре часа после каждой из шести еженедельных инъекций животным делалась анестезия с помощью кетамина, и ретроорбитально получалось 100-200 мкл крови, кроме случая умерщвления (обескровливания), когда собирался больший объем. Сыворотка была приготовлена из крови, которая свертывалась в течение от 4 до 32 часов при 2-8°С. Сыворотки хранились при -20°С. Сыворотки анализировались на уриколитическую активность, как описано в Примере 5, и анализировались на антитела к уриказам, как описано в Примере 6.

Пример 5

Тесты уриколитической активности ПЭГ-уриказы в сыворотках мышей, инъецированных ПЭГ-уриказой

Тест на активность, основанный на поглощении ультрафиолетового света (УФ тест), выполнялся с помощью 100 мкмоль мочевой кислоты в качестве субстрата в 200 ммоль бората натрия, рН 9,2, в микропластиночной адаптации способа I. Fridovich (J Biol Chem. (1965) 240: 2491-2494). Уменьшение поглощения длины волны 292 нм отслеживалось в течение 15 минут при комнатной температуре в 96-ячеечной пластине с прозрачным для УФ-излучения дном (Costar, Coming, NY) с помощью микропластиночного считывателя SpectraMAX 250 компании Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Данные анализировались путем нахождения максимальной крутизны характеристики (в милли-единицах поглощения в минуту) измерений поглощения, выполненных в ходе интервала, в течение которого окислилось от 10 до 40% субстрата. Результаты, полученные с помощью данного теста, проиллюстрированы на фиг.1 и 5.

Средний период полураспада в сыворотках мышей, инъецированных впервые с помощью PKS уриказы, связанной с шестью нитями ПЭГ весом 10 кДа на субъединицу (6×10-кДа ПЭГ PKS), составлял 29±4 часа на основании данных сывороток, полученных через 24 и 72 часа после инъекции.

В отдельных экспериментах было установлено, что обнаруживаемая уриколитическая активность в сыворотках мышей, инъецированных с помощью ПЭГ-уриказы, уменьшалась во время хранения при -20°С, и что максимальное восстановление данной активности достигалось путем 4-часового инкубирования при 37°С перед исследованием. Фиг.5 показывает, что восстановление уриколитической активности после повторных еженедельных инъекций 6×10-кДа ПЭГ PKS уриказы было наибольшим, когда фермент очищался посредством хроматографии в колонне Mono Q, как в Примере 1, перед ПЭГилированием в соответствии со способом по Примеру 3. Восстановление было наивысшим после инъецирования конъюгатов, приготовленных из пула сильносолевых элюатов по Примеру 1 (см. фиг.1), который имеет наименьшее содержание очень больших агрегатов (см. профили светорассеивания фракций 7-10 на фиг.3). Немедленное восстановление достигалось с помощью конъюгатов, приготовленных из пула слабосолевых элюатов из колонны Mono Q по Примеру 1, а наихудшее восстановление достигалось с помощью конъюгатов, выполненных из неразделенной на фракции PKS уриказы, которая имела наименьшее содержание очень больших агрегатов (см. фиг.2). Тот же порядок относительных активностей, восстановленных в сыворотке после повторных инъекций (сильносолевой пул > слабосолевой пул > неразделенная уриказа) наблюдался независимо от того, использовался ли описанный выше УФ-тест или колорометрический тест, адаптированный из способа Р. Fossati et al., (J. Clin Chem (1980) 26: 227-231), и независимо от того, инкубировались ли сыворотки при 37°С перед тестированием.

Пример 6

Ферментносвязанный иммуносорбентный тест (ELISA) сывороток мышей, инъецированных о помощью ПЭГ-уриказы

Неконкурирующие тесты ELISA производились на свиной уриказе, связанной с 96-ячеечными пластинами Immulon 2 (Dynex Technologies, VWR Scientific, San Francisco, CA). Первичные антисыворотки брались у мышей, инъецированных уриказой или 6×10-кДа ПЭГ-конъюгатами, приготовленными в соответствии со способом по Примеру 3. Вторичное антитело являлось козлиным антимышиным IgG, связанным с пероксидазой хрена (Calbio-chem-Novabiochem #401 253, La Jolla, CA), а субстратом являлся о-фенилендиаминдигидрохлорид (Sigma P-9187, St. Louis, МО), как описано в В.Porstmann et al. (J Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981) 19: 435-440).

Фиг.6 иллюстрирует результаты неконкурирующих тестов ELISA. Результаты демонстрируют, что 6×10-кДа ПЭГ-уриказа, синтезированная в соответствии со способом по Примеру 3 из сильносолевого элюата из колонны Mono Q по Примеру 1 (показанному на фиг.1), не вызывала обнаруживаемых иммунных реакций ни в одной из восьми мышей, получавших еженедельные инъекции в течение шести недель. Несколько мышей, инъецированных конъюгатами, приготовленными из не разделенной на фракции PKS уриказы в соответствии со способом по Примеру 3, проявили слабые, но обнаруживаемые иммунные реакции. Наиболее частые случаи иммунных реакций наблюдались у мышей, инъецированных конъюгатами, приготовленными в соответствии со способом по Примеру 3 из пула слабосолевых элюатов из колонны Mono Q по Примеру 1.

Без преимуществ детектора светорассеивания в анализах ВПЖХ с исключением по размеру, как описано в Примере 2, не было бы очевидно, что присутствие самых больших агрегатов неоктамерной формы уриказы связано с прогрессивно уменьшающимся восстановлением ПЭГ-уриказных конъюгатов после повторных инъекций, что наблюдалось в Примере 5 (фиг.5), и с увеличением иммуногенности у мышей BALB/c, что наблюдалось в Примере 6 (фиг.6). Эти результаты имеют важные следствия для спецификаций уриказы, используемой в качестве стартового материала для производства ПЭГ-уриказы для клинического использования.

Пример 7

Очистка тетрамерной формы уриказы

Тетрамерная форма уриказы (молекулярный вес ок. 140 кДа) был получен в чистом виде из раствора уриказы свиной печени путем препаративной размероисключающей или ионообменной хроматографии с последующей аналитической размероисключающей хроматографией. Уриказа свиной печени была приобретена у компании Sigms-Aldrich, St. Louis, МО, номер по каталогу U2350 или U3377; либо у компании Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.

Препаративная и аналитическая размероисключающая хроматография выполнялась при рН 10-10,5, предпочтительно 10,2 в 10 ммоль-натриевом буфере, содержащем 0,1 моль NaCl, в колоннах Superdex 200, предварительно откалиброванных с помощью белков известного молекулярного веса. Superdex были приобретены у Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Может использоваться любой буфер, способный поддерживать желательный уровень рН и совместимый с химией, которая предназначена для последующего связывания с PEG. Такие буферы хорошо известны из уровня техники. Ультрафиолетовое поглощение элюата из препаративной колонны наблюдалось при 280 нм, и содержащие уриказу части элюата, соответствующие молекулярному весу желательной тетрамерной формы, но свободные от соединений с большим молекулярным весом, собирались для использования при синтезе практически неиммуногенной PEG-уриказы, как описано в Примере 8. Альтернативно тетрамерные формы уриказы могут быть выделены с помощью другого размероисключающего средства, такого как Superose 12 (Amersham Pharmacia) или любого другого средства, совместимого с мягкими алкалиновыми растворами и имеющего диапазон фракционирования подходящего размера. Такие средства доступны и хорошо известны из уровня техники.

Ионообменная хроматография выполнялась при рН 10-10,5, предпочтительно 10,2, в колоннах Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), которые были сбалансированы с помощью 0,1-молярного натриево-карбонатного буфера. Любой буфер, совместимый с химией связывания с PEG и способный поддерживать желательный уровень рН, может быть использован при достаточно низкой ионной концентрации, обеспечивающей адсорбцию уриказы к колонне. Такие буферы хорошо известны из уровня техники. Ультрафиолетовое поглощение элюата наблюдалось на 280 нм в ходе элюирования уриказы из ионообменной смолы путем увеличения ионной концентрации подаваемого буферного раствора, например, посредством линейного градиента от 0 до 0,5 моль NaCl в натриево-карбонатном буфере. Затем использовалась размероисключающая ВПЖХ для идентификации фракций элюата, содержащих желательную тетрамерную форму уриказы без обнаруживаемых совокупностей, для синтеза практически неиммуногенной уриказы. Альтернативно тетрамерная форма уриказы может быть изолирована с помощью других ионообменных средств, таких как Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) или любого другого средства, которое совместимо с мягкими алкалиновыми растворами. Такие средства доступны и хорошо известны из уровня техники.

Активность уриказы была исследована с помощью модификации стандартных способов. См., например, Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). Растворы мочевой кислоты приготавливались ежедневно в 50-ммольном натриево-боратном буфере, рН 9,2 для обеспечения конечных концентраций в тесте от 6 до 150 мкмоль. Препараты уриказы растворялись в этом боратном буфере, содержащем альбумин бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, номер по каталогу А-7030), так что окончательная концентрация альбумина в данном тесте составляла 0,1 мг/мл. После смешивания различных растворов фермента с субстратом в ячейках пластинки микротитра в микропластиночном считывателе скорость исчезновения мочевой кислоты при 25°С отслеживалась при 292 нм каждые 4 секунды в течение 3 минут. Из образцов, в которых от 10% до 40% субстрата было потреблено в течение 3 минут, по меньшей мере 20 точек данных использовались для расчета максимальной скорости уменьшения поглощения в минуту. Одна международная единица (ME) активности уриказы определяется как количество фермента, которое потребляет один микромоль мочевой кислоты в минуту; конкретные активности выражаются в МЕ/мг белка. Некоторые данные для относительных активностей уриказы на фиг.7А-10В были получены с помощью 100 мкмоль мочевой кислоты в тесте. Прочие результаты для скорости при 100 мкмоль мочевой кислоты (V100) были рассчитаны из значений константы Михаэлиса (Км) и максимальной скорости (Vmax) для соответствующих ферментных препаратов с помощью формулы:

V100=100×Vmax/(Км+100),

где Км выражается в микромолях.

Пример 8

Связывание PEG с тетрамерной свиной уриказой

К раствору тетрамерной уриказы в 0,1-молярном натриево-карбонатном буфере, рН 10,2, к каждому молю подъединицы уриказы (молекулярный вес 35 кДа) добавлялось 10-200 моль активированного производного монометоксиPEG, например, 4-нитрофенил карбонат (НФК-PEG), различных размеров. Эти и прочие подходящие активированные PEG и поставляются компанией Shearwater Polymers. Инструкции по связыванию этих PEG с белками даны в каталоге Shearwater Polymers в Интернете на www.swpolymers.com, и в JM Harris, et al., (ред.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society. Реакция связывания протекает при 0-8°С до тех пор, пока объем связывания PEG не перестает существенно меняться со временем. Непрореагировавший PEG затем удалялся из продукта реакции путем хроматографии и/или ультрафильтрации.

Количество нитей PEG, связанных с каждой подъединицей уриказы, определялось посредством адаптации способов, описанных в Kunitani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588: 125-137; Saifer, et al., (1997) и Sherman, et al., (1997). Аликвотные количества смесей или фракций реакции PEG-илирования из препаративных ионообменных или размероисключающих колонн определялись посредством аналитической размероисключающей ВПЖХ на TSK 5000PW _XL при комнатной температуре в 10-ммольном натриево-карбонатном буфере, рН 10,2, содержащем 0,1 моль NaCl. Колонна ВПЖХ была приобретена у TosoHaas, Montgomeryville, PA. Белки и PEGи отслеживались детекторами ультрафиолетового поглощения и индекса рефракции. Количество белка в конъюгате рассчитывалось по площади пика индекса рефракции, скорректированного с учетом вклада белка в индекс рефракции, по отношению к площади пика индекса рефракции подходящего стандарта PEG.

Фиг.8А показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы свиной печени в виде функции количества нитей PEG, связанных с каждой подъединицей. Данные настоящих изобретателей ( , ) сравниваются с данными Chen, et al., (1981). Точка данных в большом круге обозначает конъюгат, который неиммунореактивен по данным Chen, et al., (1981). Как показано на фиг.8А, конъюгаты тетрамерной свиной уриказы, содержащие до 6 нитей PEG весом 30 кДа на каждую подъединицу, или содержащие до 7 нитей PEG весом 5 кДа на каждую подъединицу, сохраняли по меньшей мере 75% активности немодифицированного фермента. Очевидное увеличение специфической активности при увеличении количества нитей PEG весом 5 кДа или 30 кДа (до приблизительно 4 нитей на каждую подъединицу) может отразиться на относительной нерастворимости или нестабильности немодифицированного фермента по сравнению с конъюгатами. Как показано на фиг.8Б, конъюгаты свиной уриказы со в среднем более чем 3 нитями PEG весом 30 кДа на каждую подъединицу содержат большую массу PEG, чем было найдено достаточным для устранения иммунореактивности у Chen, et al., (1981).

Пример 9

Свойства PEG-конъюгатов тетрамерной рекомбинантной СБХ-уриказы

Рекомбинантная свино-бабуиновая химерическая (СБХ) уриказа была субклонирована в вектор экспресии pET3d (Novagen, Madison, WI), и результирующий плазмидный конструкт был преобразован в культуру Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) и экспрессирован в ней. Эти процедуры проводились с помощью способов, хорошо известных из уровня техники в молекулярной биологии. См. Erlich (1989); Sambrook, et al., (1989); Ausubel, F, et al., (ред.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons.

Последовательность СБХ-уриказы имела аминокислоты 1-225 свиньи (ИД. ПОСЛ. № 1 из WO 00/07629) и аминокислоты 226-304 бабуина (ИД. ПОСЛ. № 2 из WO 00/07629). Тетрамерная форма СБХ-уриказы изолировалась и связывалась с PEG различного молекулярного веса, как описано в Примерах 7 и 8. Конъюгаты, приготовленные с PEG весом 5 кДа, 10 кДа, 19 кДа, или 30 кДа, содержали до 10 нитей PEG на каждую подъединицу. Те из них, которые были приготовлены с помощью PEG весом по меньшей мере 10 кДа, сохраняли более 95% начальной специфической активности рекомбинантной уриказы.

Были проиллюстрированы следующие свойства конъюгата тетрамерной СБХ-уриказы с приблизительно 6 нитями PEG весом 10 кДа на каждую подъединицу: отсутствие иммуногенности и эффективность на уриказно-дефицитных мышах при

1) корректировании гиперурикемии и гиперуринурии;

2) снижении тяжести дефекта концентрирования мочи;

3) снижении тяжести нефрогенного несахарного диабета.

В дополнение к этому, данная PEG-уриказа снижала тяжесть связанного с мочевой кислотой поражения почек, как видно по данным магнитно-резонансной микроскопии.

Проверялась активность СБХ-уриказы в сыворотке мыши 24 часа спустя после каждой из четырех или пяти внутрибрюшинных инъекций PEG-уриказы по отношению к значению 24 часа спустя после первой инъекции. PEG-конъюгаты приготовлялись из трех различных препаратов СБХ-уриказы с помощью двух различных технологий активации PEG. Один препарат тестировался на уриказно-дефицитных (uox-1-) мышах; другие два тестировались на нормальных BALB/c мышах. Наиболее иммунореактивный препарат был приготовлен из очищенной СБХ-уриказы, содержащей неизвестное количество совокупностей уриказы, связанной со в среднем 7 нитями PEG весом 5 кДа на каждую подъединицу, с помощью сукцинимидилово-карбонатного производного PEG (CK-PEG). Zalipsky, патент США № 5612460, включенный сюда посредством ссылки. Умеренно иммунореактивный препарат был приготовлен путем связывания препарата СБХ-уриказы, содержащего 11% совокупностей со в среднем 2 нитями PEG весом 19 кДа на каждую подъединицу, с помощью 4-нитрофенилкарбонатного производного PEG (НФК-PEG). Sherman, et al., (1997). Наименее иммунореактивный препарат был приготовлен путем связывания в среднем 6 нитей НФК-PEG весом 10 кДа на каждую подъединицу с препаратом СБХ-уриказы, содержащим <5% аггрегированной уриказы.

Наблюдалась обратная зависимость между концентрациями мочевой кислоты в сыворотке и моче и активностью инъецированной PEG-уриказы в сыворотке уриказно-дефицитной (uox-/-) мыши. Инъекции в момент времени 0 и спустя 72 часа содержали 0,43 ME СБХ-уриказы, конъюгированной со в среднем 6 нитями PEG весом 10 кДа на каждую подъединицу фермента.

Лечение уриказно-дефицитных мышей с помощью PEG-модифицированной СБХ-уриказы снизило тяжесть дефекта концентрирования мочи.

Лечение уриказно-дефицитных мышей с помощью PEG-модифицированной СБХ-уриказы снизило тяжесть нефрогенного несахарного диабета, характеризующегося ненормально высоким потреблением воды и ненормально высоким выходом мочи.

Лечение уриказно-дефицитных мышей с помощью PEG-модифицированной СБХ-уриказы снизило тяжесть вызванной мочевой кислотой нефропатии.

Пример 10

PEG-конъюгация уриказы из Candida utilis

Уриказа из Candida utilis приобреталась либо у компании Sigma-Aldrich (St. Louis, МО; номер по каталогу U 1878), либо у компании Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; номер по каталогу URYW). Действуя по описаниям Примеров 7 и 8, тетрамерную форму изолировали, и синтезировали PEG-конъюгаты с помощью PEG весом 5 кДа, 10 кДа или 30 кДа (фиг.7А-7В). Фиг.7А показывает сохранение активности PEG-илированной уриказы из Candida utilis в виде функции количества нитей PEG, связанных с каждой подъединицей. Данные настоящих изобретателей ( , , ) сравниваются с данными Nishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda, et al., (1990) и Fujita, et al., (1991). Точки данных в больших кругах обозначают конъюгаты, которые описываются как неантигенные в Nishimura, et al., (1979 или 1981) или неиммунореактивные в Chen, et al., (1981).

Фиг.7В показывает сохранение активности PEG-илированной уриказой из Candida utilis в виде функции общей массы PEG, связанной с каждой подъединицей. Данные настоящих изобретателей ( , , ) сравниваются с данными тех же трудов, что и на фиг.7А. Точки данных в больших кружках имеют то же значение, что и на фиг.7А.

Как показано на фиг.7А и 7В, конъюгаты со в среднем до 6 нитей PEG весом 5 кДа или 30 кДа, либо 9 нитей PEG весом 10 кДа на каждую подъединицу сохраняют по меньшей мере 75% активности немодифицированного фермента. Очевидное увеличение специфической активности при прикреплении увеличенного количества нитей PEG весом 30 кДа (до 5 или 6 нитей на каждую подъединицу) может отражать относительную нерастворимость или нестабильность немодифицированного фермента по сравнению с конъюгатами.

Пример 11

PEG-конъюгация уриказы из Aspergillus flavus

Уриказа из Aspergillus flavus приобреталась у компании Sanofi Whinthrop (Gentilly Cedex, France). Действуя, как описано в Примере 8, синтезировали конъюгаты с помощью PEG различного молекулярного веса (фиг.9А-9В). Конъюгаты, приготовленные путем связывания фермента из A.flavus со в среднем до 12 нитей PEG весом 5 кДа или до 7 нитей PEG весом 30 кДа на каждую подъединицу, сохраняли 75% начальной специфической активности этой грибной уриказы.

Пример 12

PEG-конъюгация уриказы сои

Рекомбинантная уриказа из узелка соевого корня (называемая также нодулин 35) приготовлялась и очищалась, как описывали Kahn и Tipton (Kahn, К, et al., (1997) Biochemistry 36: 4731-4738), и была предоставлена доктором Типтоном (University of Missouri, Columbia, МО). Действуя по описаниям, данным в Примерах 7 и 8, изолировали тетрамерную форму и приготавливали конъюгаты с помощью PEG различного молекулярного веса (фиг.10А-10В). В противоположность уриказе из Candida utilis (фиг.7А), свиной уриказы (фиг.8А) и уриказы из Aspergillus flavus (фиг.9А), соевый фермент переносил связывание только приблизительно 2 нитей PEG весом 5 кДа или 30 кДа на каждую подъединицу с сохранением по меньшей мере 75% начальной уриколитической активности.

Пример 13

PEG-конъюгация уриказы из Arthrobacter globiformis

Уриказа из Arthrobacter globiformis приобреталась у компании Sigma-Aldrich (номер по каталогу U7128). См. патент Японии № 9-154581. Действуя по описаниям, данным в Примерах 7 и 8, изолировали тетрамерную форму и приготавливали конъюгаты с PEG весом 5 кДа и 30 кДа. Хотя конъюгаты со в среднем более 3 нитей PEG весом 5 кДа на каждую подъединицу сохраняли менее 60% начальной специфической активности, конъюгаты со в среднем приблизительно 2 нитями PEG весом 30 кДа на каждую подъединицу сохраняли по меньшей мере 85% начальной специфической активности.

Пример 14

PEG-конъюгация амино-усеченной свиной и СБХ-уриказ

Рекомбинантные свиная и СБХ-уриказы, в которых уничтожены первые шесть аминокислот со стороны аминотерминала, экспрессируются в Е.coli и очищаются от нее посредством стандартных методов, как описано в Примере 9. Действуя по описаниям, данным в Примерах 7 и 8, синтезировали PEG-конъюгаты амино-усеченных уриказ для получения неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности.

Пример 15

PEG-конъюгация свиной и СБХ-уриказ, усеченных со стороны карбоксилового терминала либо как со стороны аминотерминала, так и со стороны карбоксилового терминала

Рекомбинантные свиная и СБХ-уриказы, в которых уничтожены последние три аминокислоты со стороны карбоксилового терминала, экспрессируются в Е.coli и очищаются от нее посредством стандартных методов, как описано в Примере 9. Это карбоксилово-терминальное уничтожение может улучшить растворимость немодифицированных ферментов, поскольку оно удаляет пероксисомно-целевой сигнал. См. Miura, et al., (1994). Действуя по описанию, данному в Примерах 7 и 8, синтезировали PEG-конъюгаты карбоксил-усеченных уриказ для получения практически неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности. Эта уриказа экспрессируется, очищается и PEG-илируется, как описано в Примерах 7-9, для получения практически неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности.

Пример 16

PEG-конъюгация мутантов свиной уриказы, содержащих увеличенное количество мест присоединения PEG

Рекомбинантные свиные уриказы, в которых потенциальное количество мест присоединения PEG увеличено путем замены одного или более аргининовых остатков лизином, приготовлены, как описано в Примере 9. См. Hershfield, MS, et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 7185-7189. Аминокислотная последовательность одного из примеров такого мутанта (CKS-уриказа), в которой аргинин в остатке 291 заменен лизином, а треонин в остатке 301 заменен серином. Действуя по описаниям, данным в Примерах 7 и 8, PEG конъюгировали с этой уриказой для получения практически неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности рекомбинантной уриказы.

Пример 17

PEG-конъюгация мутанта рекомбинантной уриказы бабуина

С помощью стандартных способов молекулярной биологии, как и в Примере 9, конструируется уриказа бабуина, имеющая аминокислотное замещение (гистидин вместо тирозина) в позиции 97. Действуя по описаниям, данным в Примерах 7 и 8, синтезировали PEG-конъюгаты тетрамерной формы мутанта рекомбинантной уриказы бабуина для получения конъюгатов со значительно сниженной иммуногенностью, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности рекомбинантной уриказы.

Пример 18

Иммуногенность PEG-конъюгатов из Candida utilis, Aspergillus flavus и Arthrobacter globiformis

Уриказы из Candida utilis, Aspergillus flavus и Arthrobacter globiformis получены, как описано в Примерах 10, 11 и 13, соответственно. Действуя по описаниям, данным в Примерах 7 и 8, синтезировали PEG-конъюгаты с PEG весом 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа или 30 кДа. Иммуногенность этих конъюгатов сильно снижена или устранена.

Хотя изобретение было описано иллюстративно с некоторыми подробностями и в виде примеров в целях ясности понимания, специалисту будет понятно, в свете описания в данном изобретении, что в изобретение могут быть внесены определенные изменения и модификации без отхода от сущности и объема, который описан и составляет формулу изобретения.