линия клеток ico яичников неполовозрелого карпа (cyprinus carpio) для вирусологических исследований

Формула изобретения

Линия клеток ICO яичников неполовозрелого карпа Cyprinus carpio, предназначенная для вирусологических исследований, депонированная в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под № 66.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток рыб, пригодных для выделения и изучения вирусов рыб разных таксономических групп, разводимых в условиях аквакультуры.

Вирусные болезни - один из главных факторов, тормозящих развитие мировой аквакультуры. На сегодня известны около 400 вирусов рыб, и число их продолжает расти. В настоящее время весьма актуальна задача получения постоянных (перевиваемых) линий клеток, чувствительных к широкому кругу вирусов рыб. Карп (Cyprinus carpio) является одним из наиболее распространенных объектов разведения в аквакультуре.

Известны 24 постоянных линии клеток, полученных из разных органов и тканей карпа, и только одна из них (GON) была получена из гонадной ткани [1]. Однако чувствительность ее к вирусам рыб не была определена, что не позволяет использовать ее в работах по выделению и изучению вирусов, вызывающих опасные заболевания рыб.

Целью изобретения является получение постоянной клеточной линии карпа, пригодной для проведения вирусологических исследований карпа и чувствительной к другим вирусам рыб.

Поставленная цель достигается получением постоянной линии клеток ICO яичников неполовозрелого карпа (Cyprinus carpio), используемой в вирусологических исследованиях и чувствительной к 6 вирусам разных видов рыб.

Постоянная клеточная линия ICO получена путем многократного пассирования первично-трипсинизированной культуры клеток яичников 3-х неполовозрелых (2-ая стадия зрелости по шкале Киселевича) четырехгодовиков карпа (Cyprinus carpio).

Постоянная клеточная линия ICO депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под № 66.

Постоянная клеточная линия ICO характеризуется следующими признаками.

Кулътуральные свойства. Жизненный цикл клеточной линии ICO, при котором сохраняются ее основные биологические показатели, составляет 690 пассажей. При посевной дозе 200-250×10³ клеток/см² монослой формируется через сутки культивирования при 25°С и сохраняется без смены среды в течение 10-14 дней, если через 2-3 суток после его образования инкубацию продолжить при 15°С. Коэффициент пересева 1:4-1:5.

Клеточную линию ICO культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов (2МЕМ) с 10% сыворотки эмбрионов коров. Для диспергирования клеточного монослоя при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 5:7 при комнатной температуре. Урожай клеток с флакона площадью 20 см² составляет 12-15 млн. клеток.

Для криоконсервирования при температуре -196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды 2МЕМ, 20% сыворотки эмбрионов коров и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 5-6×10 ⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 75-80%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-х пассажей.

Морфологические признаки. Клетки ICO эпителиоподобные, мелкие, преимущественно однородные, их форма близка к кубической, ядра крупные округлые, число ядрышек от 1 до 3, чаще 1.

Кариологическая характеристика. (2n=100). Интервал варьирования хромосом от 95 до 104. Модальное число 100 хромосом. Величина модального класса 56%.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими и олекулярно-генетическими методами.

Контроль клеточной линии ICO на посторонние контаминанты. При исследовании клеточной линии ICO на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Клеточная линия ICO может быть использована для выделения, накопления, титрования и изучения следующих вирусов рыб: весенней виремии карпа (SVCV), вирусной геморрагической септицемии (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), рабдовируса европейского угря (Rhabdovirus anguilla), рабдовируса мальков щуки (PFRV) и иридовируса карпа (CCIV).

Клеточная линия ICO может быть также использована для детектирования анти-SVCV-антител в сыворотках переболевших рыб.

Список литературы

Chen S.N., Kou G.H. Establishment, characterization and application of 14 cell lines, derived from warm-water fish. In: "Invertebrate and Fish Tissue Culture". (Eds. by E. Kurstak and Y. Kuroda), Japan Scientific Press - Springer - Verlag. 1987, P. 218-227.