способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака nicotiana tabacum l., содержащего ген интерлейкина-18 человека

Формула изобретения

1. Способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, включающий получение эксплантов, индукцию каллусогенеза, и последующее субкультивирование, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют сегменты проростков, полученных из семян трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18 человека, для чего упомянутые семена стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток, полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят их на гормональную питательную среду со следующими дополнениями, мг/л:

2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты	0,5-2
индолилуксусной кислоты	1-2,5
кинетина	0,1

и инкубируют в темноте в течение 3-4 недель с образованием каллуса.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутую стерилизацию проводят в растворе следующего состава, объемных долей:

96%-ный этанол	7,5
37%-ная перекись водорода	1
вода	1

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для субкультивирования используют модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга со следующими дополнениями, мг/л:

2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	1,0-3,0
6-бензиламинопурин	0,1-0,3

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при культивировании поддерживают температуру окружающей среды 25-27°С при влажности 65-70%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологической промышленности для выращивания биомассы клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L. и в исследовательских целях при изучении функционирования генов, введенных в растения.

Известно применение трансгенных растений в качестве продуцентов белков медицинского назначения, в частности, в лабораторных условиях созданы трансгенные растения - источник лекарственных вакцин против гепатита-В, малярии, а также вакцины, повышающие иммунитет человека и животных.

В 1989 г. была показана возможность сборки функционально активных иммуноглобулинов класса IgG и IgA из легкой и тяжелой цепей в растениях табака (Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish К. Production of antibodies in transgenic plants. // Nature. 1989. V.342. P.76-78). Затем в ведущих биотехнологических центрах мира были получены трансгенные растения - продуценты различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов, в частности, трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита человека HbsAg (Mason H., Ball J., Shi J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V.33. P.5335-5340). Такие растения названы «съедобными вакцинами».

На базе института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск) методом агробактериального переноса генетических конструкций получены генетически модифицированные растения табака Nicotiana tabacum L., включающие гены интерлейкина человека IL-10 и IL-18 (Дейнеко Е.В., Шумный В.К. и др. Заявка РФ № 2005133963 на изобретение «Рекомбинантная плазмидная ДНК pBin101 - IL18, кодирующая синтез интерлейкина-18 человека в трансгенных растениях». Решение о выдаче патента РФ от 17 января 2007 года). В настоящее время полученные трансгенные растения человека могут служить источником интерлейкина-18. Прототипом данного изобретения являются растения Nicotiana tabacum L., включающие гены интерлейкина человека и продуцирующие белки IL-18 в трансгенных растениях. Синтезируемые белки обладают стабильностью и могут сохраняться в них длительное время без выделения (Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Сенников С. В., Козлов В.А., Шумный В.К. Получение трансгенных растений табака - продуцентов интерлейкина-18 человека. // Доклады АН. 2004. Т.395(5). С.704-707. Выбрано за прототип).

Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в интактном растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен недостатков. Среди них необходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Выход конечного продукта недостаточен для промышленного использования. Интеграция чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена с проблемой биобезопасности, поскольку не исключен выход трансгена из-под контроля. Рядом исследователей было предложено использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения (Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A. et al. A self-contained system for the field production of plant recombinant interleukin. // Mol. Breeding. 2001. V.8. P.177-185). Однако это не решает проблему повышения уровня биобезопасности при использовании генетически модифицированных растений.

Одним из путей получения рекомбинантного белка с использованием трансгенных растений является культивирование трансгенных клеток in vitro, что является более технологичным и экологически безопасным процессом. Известно, что изолированная растительная клетка сохраняет генетическую информацию родительского растения (тотипотентность). При определенных условиях, например, при благоприятном температурном и световом режиме, при подборе необходимых фитогормонов, делящаяся клетка in vitro дает аморфное образование - клеточную культуру, или каллус, состоящую, в основном, из недифференцированных клеток. Методы извлечения белковых структур из клеточной биомассы известны и широко используются в фармакологии.

Культивирование трансгенных клеток in vitro имеет ряд преимуществ перед другими способами экспрессии чужеродных генов. Во-первых, для наращивания биомассы могут быть использованы семена растений трансгенного табака, где уровень биодеградации ниже, чем в обводненных тканях (листья, плоды). Это способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка, которая достигает 2,5-3% от суммарного белка (Vandekerckhove J. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins. // Bio/Technology. 1989. V.7. P.929-932). Во-вторых, выращивание клеточной культуры растений не требует сложного оборудования и не зависит от сезонности сельскохозяйственных работ, а масштабы культивирования гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и терапевтического использования.

Техническая задача изобретения - получение in vitro клеточной культуры трансгенных растений Nicotiana tabacum L. - продуцента белка интерлейкин-18 человека, в необходимых количествах. Способы получения и культивирования in vitro трансгенных культур, содержащих интерлейкин-18, в доступных патентных и литературных источниках не обнаружены.

Поставленная задача решается тем, что вместо использования интактных растений табака получают экспланты, индуцируют каллусогенез и проводят последующее субкультивирование. В качестве эксплантов используют сегменты проростков, полученных из семян трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18 человека, для чего упомянутые семена стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток, полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят их на гормональную питательную среду с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации 0,5-2 мг/л, индолилуксусной кислоты в концентрации 1-2,5 мг/л и кинетина в концентрации 0,1 мг/л и инкубируют в темноте в течение 3-4 недель с образованием каллуса.

Таким образом, в отличие от способа-прототипа, использующего биомассу интактных растений, заявляемый способ включает стерилизацию и проращивание семян трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18, сегментирование проростков и индукцию каллусогенеза на питательной среде МС с добавлением органических компонентов (агар, сахароза), а также необходимых витаминов и гормонов.

Для упомянутой стерилизации используют раствор, состоящий из 96%-ного этанола, 37%-ной перекиси водорода и воды в объемном соотношении 7,5:1:1 соответственно.

В таблице 1 приведен оптимальный состав питательной среды для получения проростков.

В таблице 2 приведен состав питательной среды для инкубации подготовленных эксплантов (агаризованная среда МС с добавлением ауксинов и цитокинина).

В таблице 3 приведен состав модифицированной питательной среды МС для субкультивирования клеточной культуры.

Способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, по изобретению осуществляют следующим образом:

В подготовленные стерильные контейнеры для выращивания проростков разливают стерильную агаризованную безгормональную питательную среду № 1.

Получение эксплантов. Семена растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18 человека после исследования их жизнеспособности подготавливают к посеву на фильтре. Для решения задачи стерилизации семян подбирают компоненты стерилизующего раствора и оптимизируют их количественное содержание. В условиях асептики (ламинарный бокс) помещают бумажные фильтры в чашки Петри, с помощью пипетки-дозатора смачивают фильтр стерилизующим раствором (4-5 мл). Семена помещают на смоченный фильтр. Открытые чашки Петри оставляют под УФ-излучением на 10 мин, после чего фильтры оставляют в ламинарном шкафу на 40-45 мин до высыхания. Семена с подсохшего фильтра высаживают в подготовленные контейнеры на застывшую питательную среду. Закрывают контейнеры парафилмом и помещают в культуральную комнату на белый свет (интенсивность I=1000 лк, фотопериод 16/8, температура t=25-27°С). Примерно через 28 дней полученные стерильные проростки табака сегментируют и используют для получения каллусной культуры.

Индукция каллусогенеза. В условиях ламинарного бокса проростки табака извлекают пинцетом из контейнеров. С помощью скальпеля рассекают проростки на сегменты площадью 0,2-0,3 см² . Полученные экспланты помещают на модифицированную гормональную среду МС (таблица 2). Оптимальному составу гормонов соответствует среда № 2б. Пробирки или чашки Петри с эксплантами переносят в культуральную комнату, где поддерживают температуру воздуха t=25-27°С при 65-70%-ной влажности.

Образовавшийся каллус, содержащий ген интерлейкина-18 человека, пересаживают на модифицированную питательную среду МС (таблица 3) и субкультивируют в течение 21-28 суток. Оптимальному составу гормонов соответствует среда № 3б. Требуемую биомассу клеточной культуры выращивают пассированием. Как получение, так и дальнейшее выращивание клеточной культуры осуществляют в темноте. В лабораторных условиях пассировано несколько поколений клеточной культуры трансгенного табака, в которых не обнаружено явления сайленсинга ("замолкания") трансгенов интерлейкина-18. Присутствие рекомбинантного белка в каллусе соответствует его содержанию в интактном растении.

Для определения заявленных пределов компонентов испытаны различные варианты питательных сред, приведенные в таблицах 2 и 3: ниже и выше заявленных пределов способ показывает неудовлетворительные результаты. Ниже приведен пример реализации способа. В примере использованы варианты сред № 1, № 2б, № 3б.

Пример.

Заявленным способом культивируют in vitro клеточные культуры трансгенной линии растений табака IL18 № 7-1 и исходной линии SR1 (дикая линия).

Семена трансгенного табака стерилизуют в растворе заявленного состава: 30 мл 96%-ного этанола+4 мл воды+4 мл 37%-ной перекиси водорода. В контейнеры, чашки Петри или колбы Эрленмейера разливают по 30 мл питательной среды. Производят посев семян на питательную среду МС № 1. Через 26 суток образовавшиеся на свету in vitro проростки используют в качестве эксплантов. Из листовых эксплантов трансгенной линии табака IL18 № 7-1, культивируемых в темноте на заявленной модифицированной среде № 2 с гормонами, образуется каллус, пассируемый в дальнейшем на заявленных питательных средах № 3. Одновременно в тех же условиях культивируют клеточную культуру линии SR1.

Субкультивирование Nicotiana tabacum L. включает посадку полученной каллусной культуры на среду № 3, выращивание биомассы и отбор ее части для дальнейшего культивирования. Для получения значительных объемов биомассы каллусной культуры табака через 10-15 суток после образования каллуса отбирают активно растущую биомассу, пересаживают в количестве 0,5 г в каждую колбу на свежую питательную среду № 3, культивирование ведут в течение 3-4 недель.

Морфометрические показатели клеток. По сравнению с исходной линией SR1, которая состоит из клеток правильной округлой или овальной формы, трансгенная линия IL18 № 7-1 имеет клетки, вытянутые в длину, объемы которых в 1,5-2 раза превышают родительскую линию. Каллусные культуры трансгенной линии IL18 № 7-1 отличаются от линии SR1 уплотненной структурой и желтой окраской. Подобные различия сохраняются на протяжении последующих трех пассажей.

Жизнеспособность каллусной культуры определяют по стандартной методике, путем окрашивания клеток метиленовым синим (Паушева З.П., 1988; Мигранова И.Г. и др., 2000). Ростовые характеристики каллусной культуры определяют, определяя сухую и сырую биомассу, подсчитывая количество клеток в камере Фукса-Розенталя. Прирост сырой биомассы оценивают по средней начальной и средней конечной массе каллусной культуры по общепринятому показателю - ростовой индекс. Свежую биомассу клеточной культуры используют для выделения растворимого белка.

Промышленная применимость технического решения обусловлена свойством изолированных растительных клеток сохранять генетическую информацию родительского растения и получением на практике клеточной культуры трансгенного табака, содержащего интерлейкин-18 человека, в количествах, достаточных для клинических испытаний и терапевтического использования.

Новизна технического решения определяется тем, что способы культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, не известны из уровня техники.

Изобретательский уровень настоящего изобретения заключается в том, что определена последовательность операций и найдены неочевидные условия, обеспечивающие каллусогенез и интенсивный рост клеточной культуры.

Источники информации

1. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. // Nature. 1989. V.342. P.76-78.

2. Mason H., Ball J., Shi J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V.33. P.5335-5340.

3. Дейнеко Е.В., Шумный В.К. и др. Заявка РФ № 2005133963 на изобретение «Рекомбинантная плазмидная ДНК pBin101 - IL18, кодирующая синтез интерлейкина-18 человека в трансгенных растениях».

4. Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Сенников С. В., Козлов В.А., Шумный В.К. Получение трансгенных растений табака - продуцентов интерлейкина-18 человека. // Доклады АН. 2004. Т.395(5), с.704-707.

5. Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A. et al. A self-contained system for the field production of plant recombinant interleukin // Mol. Breeding. 2001. V.8. P.177-185.

6. Vandekerckhove J. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins. // Bio/Technology. 1989. V.7. P.929-932.

Среда № 1 для получения проростков - безгормональная питательная среда МС рН 5,8 Таблица 1
Компоненты	Содержание, мг/л
неорганические
KNO3	1900
КН 2PO4	170
NH 4NO3	1650
MgSO 4×7H2O	370
CaCl 2×2H2O	440
FeSO 4×7Н2О	37,3
Na 2EDTA×2H2O	27,8
KI	0,83
Н3 BO3	6,2
MnSO 4×4H2O	22,3
CoCl 2×6Н2О	0,025
CuSO 4×5Н2O	0,025
ZnSO 4×7H2O	8,6
Na 2MoO4×2H2O	0,25
органические
сахароза	30000
агар	7500-8500
тиамин-HCl	0,5-1,5
пиридоксин-HCl	0,4-0,6
никотиновая кислота	0,4-0,6
вода дистиллированная	до 1 л

Среда № 2 для инкубации подготовленных эксплантов - агаризованная гормональная среда МС с дополнениями, мг/л Таблица 2
Дополнения	№ 2а	№ 2б	№ 2в
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	0,5	1	2
индолилуксусная кислота	1	2	2,5
кинетин	0,1	0,1	0,1
ростовая активность	+	++	+
+умеренный рост
++активный рост

Среда № 3 для выращивания клеточной культуры - модифицированная питательная среда МС с дополнениями, мг/л Таблица 3
Дополнения	№ 3а	№ 3б	№ 3в
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	1,0	2,0	3,0
6-бензиламинопурин	0,1	0,2	0,3
ростовая активность	+	++	+
+умеренный рост ++активный рост