среда для замораживания семени быков

Формула изобретения

Среда для замораживания семени быков, включающая лактозу, желток куриных яиц, глицерин и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит комплексонаты макро- и микроэлементов - кальциевый комплексонат этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-кальций), цинковый комплексонат (ЭДТА-цинк), медный комплексонат (ЭДТА-меди) и антибиотики - пенициллин, стрептомицин и полимиксин при следующих соотношениях компонентов:

Лактоза	105-115 г
ЭДТА-кальций	0,45-0,80 г
ЭДТА-цинк	1,0-1,7 г
ЭДТА-меди	0,45-0,80 г
Глицерин	40-70 мл
Желток куриных яиц	170-200 мл
Пенициллин	250-750 тыс.ед.
Стрептомицин	250-750 тыс.ед.
Полимиксин	1,0-2,0 млн. ед.
Вода дистиллированная	до 1000 мл

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к животноводству, в частности к способам размножения животных, а именно к средам для замораживания семени быков-производителей.

Известна унифицированная комплексонатная среда для разбавления и замораживания семени сельскохозяйственных животных. В се состав на 1000 мл дистиллированной воды входят:

- сахар-рафинад	100 г
- этилендиаминтетрауксусной кислоты
динатриевая соль, кальциевый комплексонат
6-водная	3 г
- этилендиаминтетрауксусной кислоты
дикалиевая соль, магниевый комплексонат,
водная	3 г
- натрий фосфорнокислый, 2-замещенный	0,7 г
- калий фосфорнокислый, 1-замещенный	1,5 г
- 2,6-ди-трет-бутил-1,4-крезол	0,5 г
- глицерин	40 мл
- желток куриного яйца, оранжевой
окраски	50 мл
- спермосан-3	500-700 ед.

(Животноводство, 1985, № 7, с.39-41). Среда имеет преимущество над другими своей универсальностью. Она в определенной мере предохраняет от разрушения и обогащает макро- и микроэлементный комплекс семени, а соли ЭДТА снижают нуклеазную активность среды. Однако использование в этой среде сахарозы не обеспечивает в необходимой мере обменные процессы в плазматической мембране живчиков; наличие натриевых солей не обеспечивает оптимальных характеристик поверхностного электрического потенциала плазматических мембран живчиков; уменьшенное содержание желтка в среде вызывает недостаток лецитина и других веществ криопротекторного характера.

Известна среда для разбавления и замораживания семени быка, используемая в Литовской технологии содержания племенных быков (П.Пакенас. Литовская технология содержания и использования племенных быков. МСХ Литвы, 1993). Среда включает (на 100 мл дистиллированной воды):

- лактозу	10,5 г
- натрий лимоннокислый, 3-замещенный,
5-водный	0,2 г
- глицерин	5 мл
- желток куриного яйца	20 мл
- спермосан-3	50 ед.
или спермосан-ППК	50-100 ед.

Известна среда для разбавления семени сельскохозяйственных животных, состоящая из:

- сахар	101,1-101,3 г
- комплексная соль этилендиаминтетра
уксусной кислоты	5,9-6,1 г
- желток куриного яйца	49-51 мл
- глицерин	39-41 мл
- пенициллин	250-350 тыс.и.е.
- стрептомицин сернокислый	250-350 тыс.и.е.
- 2,3,5,7,8-Пента-гидрокси-
6-этил-1,4-нафто-хинон	0,0049-0,0051 г
- вода дистиллированная	до 1000 мл.

(SU 1080819 A, A61D 19/02,23.03.1984. Бюл. № 11).

Данная среда, по сравнению с контрольной, обеспечила абсолютный показатель подвижности сперматозоидов выше на 1,9; полупериод подвижности и живучести на 4 часа, сохранность акросом - на 10%. Однако она содержит сравнительно небольшой удельный объем куриного желтка, что снижает ее криопротекторные свойства. Кроме того, сахароза обладает менее выраженными диэлектрическими свойствами в сравнении с лактозой, а это, в свою очередь, отрицательно влияет на распределение электрических зарядов по поверхности спермиев. В среде отсутствует источник макро- и микроэлементов.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому результату является синтетическая среда для разбавления и замораживания семени быка (в форме гранул) в составе:

- лактоза	11,5 г
- желток куриного яйца	20,0 мл
- глицерин	5 мл
- спермосан-3	50,0 тыс.ед.
- вода дистиллированная	100 мл

Среда была рекомендована для работы станций и предприятий по искуственному осеменению сельскохозяйственных животных («Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных», МСХ СССР, Гл. упр. животноводства. М., Колос, 1981, 159 с.).

Данная среда содержит лактозу, достаточное количество желтка куриных яиц и глицерина. Однако в ней отсутствуют комплексонаты макро- и микроэлементов и компоненты, в достаточной мере обеспечивающие ее бактериостатические свойства.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение сохранности биологической полноценности сперматозоидов и улучшение показателя стельности коров, осемененных семенем с использованием предложенной среды.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложена среда для замораживания семени быков, включающая лактозу, желток куриных яиц, глицерин и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит комплексонаты макро- и микроэлементов - кальциевый комплексонат этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-кальций), цинковый комплексонат (ЭДТА-цинк), медный комплексонат (ЭДТА-меди) и антибиотики: пенициллин, стрептомицин и полимиксин - при следующем соотношении компонентов:

- лактоза	105-115 г
- ЭДТА-кальций	0,45-0,80 г
- ЭДТА-цинк	1,0-1,7 г
- ЭДТА-меди	0,45-0,80 г
- глицерин	40-70 мл
- желток куриных яиц	170-200 мл
- пенициллин	250-750 тыс.ед.
- стрептомицин	250-750 тыс.ед.
- полимиксин	1,0-2,0 млн ед.
- вода дистиллированная	до 1000 мл

В предложенной среде наличие комплексонатов металлов обеспечивает стабилизацию макро- и микроэлементного состава и снижение ее нуклеазной активности. Наличие ионов меди в комплексе с антибиотиками повышает бактериостатические свойства предлагаемой среды.

Изотонические концентрации компонентов среды найдены криоскопическим (расчетным) методом с последующим уточнением по подвижности и выживаемости живчиков.

Оптимальное соотношение компонентов определяли с использованием биологического метода, то есть по показателям подвижности и выживаемости сперматозоидов после замораживания в том или ином варианте сред (таблица 1).

Таблица 1 Качество замороженного семени быков в связи с разной концентрацией лактозы и комплексонатов в среде
Соотношение объемных долей изотонических растворов лактозы и комплексонатов	Подвижность спермиев (%)	Выживаемость после оттаивания (час)	Сохранность акросом (в %)
После замораживания	После оттаивания
80% лактозы + 4% ЭДТА-кальция + 4% ЭДТА меди + 12% ЭДТА цинка	80	50	9,0	82
90% лактозы + 2% ЭДТА-кальция + 2% ЭДТА меди + 6% ЭДТА цинка	80	60	9,5	84
95% лактозы + 1% ЭДТА-кальция + 1% ЭДТА меди + 3% ЭДТА цинка (взята за основу)	80	60	9,5	86

При испытании разных вариантов состава среды применяли метод так называемого расщепленного эякулята, то есть для всех вариантов использовали семя из одного и того же эякулята.

Нуклеазную активность сред в связи с включением в них комплексонатов определяли по степени деградации контрольного образца ДНК (таблица 2).

Таблица 2 Нуклеазная активность сред для замораживания семени быка в связи с включением в них комплексонатов металлов
Среды	Степень деградации контрольного образца ДНК фага-лямбда (по длине фрагментов, в нуклеотидных парах). Инкубация - 1 час при + 37°С
Лактозная (контроль)	400-500
Лактозная + комплексонаты	5000-6000

Из представленных в таблице 2 данных следует, что добавление комплексонатов в рекомендуемых количествах способствует снижению нуклеазной активности и меньшей степени деградации контрольного образца ДНК (5000-6000 пар нуклеотидов вместо 400-500 в контроле).

Для замораживания использовали общепринятую технологию. Гранулы замораживали на сухом льду, соломинки - в парах жидкого азота.

Пример 1. В лабораторных условиях ВИЖ было проведено испытание качества бычьего семени, замороженного в предлагаемой среде. Согласно полученным результатам качество семени, замороженного в предлагаемой среде, было выше, чем качество семени, замороженного в известной среде, при всех вариантах степеней разбавления (таблица 3).

Таблица 3 Показатели качества оттаянного семени в зависимости от примененной разбавляющей среды и степени разбавления. Средние данные по 14 экспериментам
Среда для замораживания	Кратность разбавления семени	Показатели сразу после оттаивания	Показатели через 5 час инкубации при +37°С
% спермиев с ППД*	% спермиев с целой акросомой	% спермиев с ППД	% спермиев с целой акросомой
Предлагаемая	10	51±4,9	79±9,2	34,6±14,9	54,5±13,6
То же	12,5	52±5,7	68±13,6	32,3±15,7	52,7±2,7
То же	16,7	50±5,1	68±8,7	26,8±15,5	48,8±11,6
То же	25	49±2,6	63±4,8	28,4±12,9	41,8±10,7
Среда-прототип	10	45±6,5	60±9,1	14,3±11,2	35,4±6,8
То же	12,5	44±5,0	58±7,5	12,8±11,2	35,0±7,0
То же	16,7	37±8,2	59±7,3	7,7±8,2	33,6±5,0
То же	25	35±0,1	52±7,2	7,7±8,5	30,0±6,3
* - ППД - сперматозоиды с прямолинейно-поступательным движением.

Как видно из данных таблицы 3, при всех вариантах степени разбавления лабораторные показатели качества семени, замороженного в предлагаемой среде, выше, чем в семени, замороженном в среде-прототипе. Причем при использовании предлагаемой среды (в сравнении со средой-прототипом) увеличение степени разбавления до 25 раз не вызывает снижения показателей качества оттаянного семени.

Пример 2. На фермах экспериментального хозяйства ВИЖ «Кленово-Чегодаево» было осеменено 205 коров с использованием предлагаемой среды и 183 коровы - с использованием среды-прототипа. При использовании предложенной, лактозо-комплексонатной, среды стельность коров после первого осеменения была на 8% выше по сравнению с использованием среды-прототипа.

Изобретение применимо на станциях и предприятиях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных.