способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота

Формула изобретения

1. Способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий отбор проб сыворотки крови от животных, выделение РНК вируса, синтез олигонуклеотидных праймеров, амплификацию РНК вируса в полимеразной цепной реакции, идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза, отличающийся тем, что праймеры имеют следующий олигонуклеотидный состав:

5' AGATCCACCCTTATGAGGCA 3'

5' TGTTTCACCCAGTTATACATGC 3', реакция проводится в один раунд, в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 731 н.п.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявление вируса осуществляют в объединенных пробах сыворотки крови, полученных от 20-ти животных стада крупного рогатого скота в возрасте от новорожденных до 12 мес.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в случае выявления персистентно инфицированных телят обследуют их коров-матерей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) путем исследования проб сывороток крови в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Персистентную форму инфекции у крупного рогатого скота вызывает только нецитопатогенный биотип вируса ВД-БС КРС. Животные инфицируются внутриутробно в период с 90-го по 125-й дни своего развития, когда иммунная система плода еще окончательно не сформирована. У них после рождения регистрируется постоянная виремия, они практически пожизненно выделяют вирус во внешнюю среду и служат скрытыми источниками вируса. Вируснейтрализующие антитела у таких животных не выявляются. Потомство персистентно инфицированных коров также персистентно инфицировано, в результате чего могут возникать персистентно инфицированные «семьи» животных. Превалентность персистентно инфицированных животных в общей популяции крупного рогатого скота колеблется от 1 до 3%. Инцидентность инфекции в первом триместре стельности рассматривается как 3,3% на всю популяцию. Истинное количество персистентно инфицированных телят установить удается редко и принято считать, что в среднем их количество составляет 100 на 1000 отелов.

Введение в стадо животного, переносящего инфекцию в персистентной форме, может привести к ее распространению среди восприимчивого поголовья в течение короткого периода времени.

До настоящего времени основными способами выявления персистентно инфицированных животных в пробах сыворотки крови является иммунопероксидазный микрометод окрашивания инфицированных вирусом культур клеток (ИПМ) и иммуноферментный (ИФМ) метод (Saliki J.T., Fulton R.W., Hull S.R., Dubovi E.J. Microtiter Virus Isolation and Enzyme Immunoassays for Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus in Cattle Serum // Journal of Clinical Microbiology. - 1997. - Vol.35. - No.-4. - pp.803-807). Микрометод выделения вируса в культуре клеток проводится с использованием 96-луночных панелей. Через 4-5 дней культивирования вируса монослой культуры клеток окрашивают при помощи красителя, конъюгированного с моноклональными антителами (ИПМ). Результаты ИПМ учитывают по наличию красного окрашивания внутриклеточных преципитатов, ИФМ - по желтому окрашиванию реакционного раствора в лунках микропанелей. Оптимальное окрашивание монослоя в ИПМ достигается путем его фиксирования 20-30%-ным ацетоном, а оптимальным для ИФМ является использование цикла высушивания-отмывки и повторного высушивания. ИФМ и ИПМ имеют одинаковую чувствительность и специфичность, но ИФМ является более быстрым, а использование спектрофотометра для учета реакции повышает точность диагностики. Сравнение обеих методик со стандартным методом выделения вируса в культуре клеток при исследовании проб от животных показало чувствительность, равную 85%, при 100%-й специфичности. При исследовании проб сыворотки от животных, подозреваемых в персистентном вирусоносительстве, чувствительность обоих методов составила 100%. Оба метода, особенно ИФМ, пригодны для поголовного тестирования стад крупного рогатого скота с целью выявления персистентно инфицированных животных с большой эффективностью и наименьшими экономическими затратами.

К недостаткам иммунопероксидазного метода (ИПМ) относится необходимость поддержания и использования для выделения вируса культур клеток, а также окраски монослоя клеток после проведения нескольких пассажей для его выявления, что является длительной и трудоемкой процедурой.

К недостаткам иммуноферментного метода (ИФМ) относятся длительная и не всегда доступная диагностическим лабораториям процедура получения моноклональных антител к белкам вируса, конъюгирования их с ферментами, а также необходимость приобретения специального дорогостоящего оборудования для его постановки и автоматизированного учета.

Наиболее близким с точки зрения описанных недостатков и принятым за прототип является способ выявления РНК вируса ВД-БС КРС в пробах цельной крови и сыворотки крови, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение РНК вируса, синтез олигонуклеотидных праймеров на ген NS5B, амплификацию РНК вируса в гнездовой ПЦР, специфическую идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза в 2% геле агарозы (Gilbert.A., Burton К.М., Prins S.E., Deregt D. Typing of Bovine Viral Diarrhea Viruses Directly from Blood of Persistently Infected Cattle by Multiplex PCR // Journal of clinical microbiology. - Vol.37, No.6. - p.2020-2023).

Наружные праймеры для первого раунда амплификации:

5' AAGATCCACCCTTATGA(A/G)GC 3'

5' AAGAAGCCATCATC(A/C)CCACA 3'.

Множественные внутренние праймеры для второго раунда ПЦР:

5' TGGAGATCTTTCACACAATAGC 3',

5' GGGAACCTAAGAACTAAATC 3',

5' GCTGTTTCACCCAGTT(A/G)TACAT 3'

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он проводится методом гнездовой ПЦР, требующей синтез двух пар праймеров (внутренних и наружных) и, соответственно, проведения реакции в два раунда, а также низкую чувствительность 30-50 ТЦД _50/мл. Данный способ не предполагает исследовать объединенные пробы сыворотки крови от телят, а только раздельно.

Задачей изобретения является выявление животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС), сокращение сроков исследования и увеличение количества обследуемых животных.

Поставленная задача решается тем, что в заявляемом способе выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающем отбор проб сыворотки крови от животных, выделение РНК вируса, синтез олигонуклеотидных праймеров, амплификацию РНК вируса в полимеразной цепной реакции, идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза, согласно изобретению, отличающийся тем, что праймеры имеют следующий олигонуклеотидный состав:

5' AGATCCACCCTTATGAGGCA 3',

5' TGTTTCACCCAGTTATACATGC 3', реакция проводится в один раунд, в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 731 н.п.

2. Сущность способа заключается также в том, что выявление вируса осуществляют в объединенных пробах сыворотки крови, полученных от 20-ти животных стада крупного рогатого скота в возрасте от новорожденных до 12 месяцев.

3. Сущность способа заключается также в том, что в случае выявления персистентно инфицированных телят обследуют их коров-матерей.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Отбор проб от животных и получение сыворотки проводят методом ее отстоя по общепринятой методике (А.А.Кудрявцева, Л.А.Кудрявцева. Клиническая гематология животных. Москва, Колос. - 1974).

Пример 2. Выявление РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота в пробах сыворотки крови телят с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Выделение РНК вируса ВД-БС КРС из проб сывороток крови осуществляют с использованием набора для выделения РНК/ДНК сорбцией на силикагеле «Рибо-сорб» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Этап 2. Проведение реакции обратной транскрипции для получения кДНК.

Для проведения реакции обратной транскрипции РНК применяют комплект «Реверта-L» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Этап 3. Амплификация участка к-ДНК вируса ВД-БС КРС, кодирующего ген NS5B. Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl₂, 25 mM KCl, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,1 мкг каждого праймера, 1.25 U Taq-ДНК-полимераза, 5 мкл продукта обратной транскрипции.

Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: 95°С - 2 мин - 1 цикл; 95°С - 30 с, 60°С - 45 с, 72°С - 45 с - 35 циклов; 72°С - 1 мин.

Этап 4. Определение размера продуктов диагностической ПЦР.

Продукты ПЦР анализируют методом горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-ацетатном буфере (рН 8,0).

Для определения размера продукта ПЦР используют маркер молекулярного веса 100 bp. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 731 нуклеотидные пары.

Таким образом, указанный способ позволяет выявлять РНК вируса ВД-БС КРС в сыворотках крови персистентно инфицированных телят.

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности ПЦР.

Контрольный штамм вируса ВД-БС КРС Oregon С24 с инфекционным титром 10⁵ТЦД _50/мл подвергают титрованию путем десятикратных разведений до конечного разведения 10^-7 и амплифицируют в ПЦР. Чувствительность данного способа выявления РНК вируса составляет 1 ТЦД_50/мл.

Результаты опытов по определению специфичности реакции представлены в таблице 1.

Таблица 1
Вирус (штамм)	Результаты ПЦР
Вирус ВД-БС КРС (NADL)	Положительно
Вирус ВД-БС КРС (Oregon С24)	Положительно
Вирус ВД-БС КРС (ТМ)	Положительно
Вирус ВД-БС КРС (ВК-1)	Положительно
Герпесвирус КРС 1-го типа (Оренбург)	Отрицательно
Герпесвирус КРС 2 типа (М)	Отрицательно
Герпесвирус КРС 4-го типа (Movar-33/63)	Отрицательно
Вирус чумы свиней	Отрицательно
Аденовирус КРС 1 типа (BV-10)	Отрицательно
Риновирус КРС 1-го типа (SD-1)	Отрицательно
Культура клеток КСТ	Отрицательно

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении РНК штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС.

Пример 4. Определение чувствительности ПЦР при исследовании проб сыворотки крови от животных, искусственно контаминированной вирусом ВД-БС КРС.

Контрольный штамм вируса ВД-БС КРС Oregon С24 с инфекционным титром 10 ⁵ТЦД_50/мл в объеме 0,001 мл смешивают с пробами сыворотки крови крупного рогатого скота, не содержащей вирус ВД-БС КРС и антител к нему. Для этого предварительно пробы сыворотки крови смешивают по 0,1 мл в пулы, насчитывающие 10, 20, 30 и 40 объединенных проб в конечном объеме 1 мл. Пробирки, содержащие пробы сыворотки крови и вирус, тщательно перемешивают и подвергают исследованию в ПЦР согласно примеру 2.

Таблица 2
№ п/п	Количество проб сыворотки в объединенной пробе	Титр вируса ВД-БС КРС в объединенной пробе (ТЦД50/0,1 мл )	Результат исследования в ПЦР
1	10	10	Положительно
2	20	1	Положительно
3	30	0,1	Отрицательно
4	40	0,01	Отрицательно

Чувствительность данного способа выявления РНК вируса ВД-БС КРС в объединенных пробах сыворотки крови крупного рогатого скота, искусственно контаминированной вирусом, составляет 1 ТЦД _50/мл.

Таким образом, наиболее эффективное выявление вируса осуществляется при условии объединения проб сыворотки крови по 10 и 20 в один пул.

Пример 5. Отбор и исследование проб сыворотки крови для выявления персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС телят.

Для исследования на ВД-БС КРС отбирают пробы сыворотки крови у всех телят обследуемого хозяйства в возрасте от новорожденных до 12 месяцев. Из каждой пробы сыворотки крови, полученной по стандартной методике методом отстоя, отбирают по 100 мкл и объединяют по 20 проб, далее исследуют как одну пробу. Пробы помещают в отдельные пробирки, нумеруют и доставляют для исследования в лабораторию в замороженном виде. Реакцию проводят согласно примеру 2.

В случае положительного результата исследования объединенной пробы каждую пробу сыворотки крови исследуют отдельно.

Результаты определения чувствительности разработанной методики при исследовании проб от животных, подозреваемых в персистентном инфицировании, приведены в таблице 3.

Таблица 3
№ п/п	Количество проб сыворотки в объединенной пробе	Результат исследования в ПЦР
1	10	Положительно
2	20	Положительно
3	30	Отрицательно
4	40	Отрицательно

Таким образом, чувствительность разработанного метода совпадает при исследовании как проб сыворотки крови, искусственно контаминированной вирусом ВД-БС КРС, так и от животных, подозреваемых в персистентном вирусоносительстве, полученных непосредственно из стада крупного рогатого скота. Количество проб сыворотки, объединенных в одну пробу, составляет 20.

Пример 6. Выявление персистентно инфицированных животных в стаде крупного рогатого скота. При обнаружении вируса в объединенных пробах сыворотки крови исследуют каждую пробу из партии раздельно с целью выявления индивидуальных животных, персистентно инфицированных вирусом.

Результаты исследований приведены в таблице 4.

Таблица 4
n=400
№ п/п	Количество проб сыворотки в объединенной пробе	Количество индивидуальных проб, давших положительный результат в ПЦР/%
Телята
1	2	3
1	20	1
2	20	0
3	20	0
4	20	0
5	20	0
6	20	4
7	20	0
8	20	0
9	20	0
10	20	3
11	20	1
12	20	0
13	20	5
14	20	1
15	20	0
16	20	0
17	20	0
18	20	3
19	20	0
20	20	0
Итого:	400	16/3,75

Пример 7. Выявление РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота в пробах сыворотки крови коров-матерей персистентно инфицированных телят с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

После выявления телят, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС, обследуют их матерей на определение их статуса в отношении персистентной формы инфекции ВД-БС КРС. Для этого у них отбирают пробы сыворотки крови и исследуют методом ПЦР согласно примеру 2. Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5.
№ п/п	Количество обследованных пар «теленок-корова» в стаде	Выявлено персистентно инфицированных телят (гол)	Процент выявления	Выявлено персистентно инфицированных коров-матерей (гол)	Процент выявления	Процент выявления персистентно инфицированных животных в стаде
1	400	11	2,75	4	1	3,75

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, за счет выявления РНК вируса в полимеразной цепной реакции.

Использование данного способа выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, позволит оптимизировать систему противоэпизоотических мероприятий при этой болезни за счет поголовного обследования телят, выявление персистентных вирусоносителей и удаление их из стада. Выявление коров-матерей, также персистентно инфицированных вирусом, предотвратит рождение персистентно инфицированных телят в будущем, что может значительно снизить риск распространения возбудителя инфекции в стаде и риск возникновения массовых респираторных и гинекологических болезней в нем.