штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки heliothis armigera hbn, используемый для получения инсектицидного препарата

Формула изобретения

Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armigera Hbn, НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06, используемый для получения инсектицидного препарата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем хлопчатника и многих других культурных растений.

Применение биологических средств защиты растений является экологически оправданым. В отличие от химических средств защиты, этот вирус вызывает заболевание и гибель только личинок хлопковой совки, не оказывая вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных). Кроме того, стоимость получения вируса в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается сравнимой со стоимостью используемых в настоящее время химических пестицидов.

Известен ряд химических препаратов, применяемых для борьбы с хлопковой совкой. Например, известен препарат «Регент», однако он является химическим препаратом и оказывает негативное влияние не только на вредителей, но и на человека и теплокровных животных.

Известен штамм ВЯП Mamestra brassicae (Pd-1-5) ВКПМ virus-1, используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки (АС СССР № 1638161, кл. C12N 7/00, опубл. 30.03.91). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма Pd-1-5 для гусениц Mamestra brassicae, составляет LD50 0,2×10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма Pd-1-5 является низкая вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.

Известен штамм ВЯП Mamestra brassicae (КС-3-86) ГКВ № 2155, используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки (Патент РФ № 2153258, кл. A01N 63/00, опубл. 27.07.2000). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма КС-3-86 для гусениц Mamestra brassicae, составляет (2,3-7,0)×10 ² полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма КС-3-86 является недостаточная вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм ВЯП ХС-2, на основе которого получают препарат Вирин ХС-2 (ТУ 10.01.41-91). Он вызывает специфически направленную гибель хлопковой совки, безвреден для других животных, нетоксичен. Однако требует двухкратных обработок посевов. Эффективность достигает 77%.

Технической задачей изобретения является получение штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armigera Hbn, используемого для получения инсектицидного препарата, который бы обладал большей вирулентностью по отношению к хлопковой совке по сравнению с прототипом.

Поставленная задача решается получением нового штамма вируса ядерного полиэдроза ХС-17 (авторское название), который задепонирован в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ "Вектор" (НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером VB-06.

Предлагаемый штамм ХС-17 выделен в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях хлопчатника Таджикистана и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории.

Стандартные условия культивирования: гусеницы хлопковой совки содержатся при температуре 28°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС) следующего состава: мука люцерновая - 88 г, мука кукурузная - 35 г, дрожжи кормовые - 44 г, кислота аскорбиновая - 4,4 г, бензойная кислота - 2,0 г, агар - 15 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: штамм прошел 4 пассажа при заражении гусениц хлопковой совки лабораторной линии перорально.

Чувствительность к химическим веществам: чувствителен к эфиру, формалину, хлорамину, хлороформу; нечувствителен к ацетону.

Физико-химические свойства: размеры полиэдров (мкм) 1-3, размеры вирионов (нм) 400×80, нуклеокапсидов 310×50 нм. Тип включения вирионов - одиночный. ДНК кольцевая ковалентнозамкнутая, мол.вес 121,4 МД.

Рестрикционный анализ ДНК вируса: сайты рестрикции (количество) для PstI - 7, BamHI - 9, SlaI - 7.

Белковый состав вируса: 27 полипептидов. Мол.вес основных: от 64 до 18 МД.

Биологическая активность: LD50=1.336±0.314 (на гусеницах 3-го возраста хлопковой совки лабораторной популяции), ЛВ50=4.5 суток при заражении дозой ЛД90. Выход вируса при заражении гусениц 4-го возраста 1-6×10⁹ полиэдров на гусеницу.

Антигенные свойства штамма: преципитирующая активность антисывортки с гомологичным вирусом методом двойной иммунодиффузии составляет 1/32.

Способ хранения: штамм хранится при -30°С в сухой форме виде порошка белого цвета с титром не менее 2×10¹⁰ полиэдров/г.

Круг хозяев: хлопковая совка.

Патогенность для человека: непатогенен.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Технология получения вирусного препарата.

Технология производства вирусных препаратов осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.

Партию гусениц хлопковой совки по достижении ими третьей возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм ХС-17). Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма ХС-17 с титром 2×10 ⁵ полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам ХС. Гусениц ХС содержат при 27±1,5°С и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 8-10 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают с помощью вакуумного насоса с давлением (8,7±0,1)×10 ⁴ Па в посуду из толстостенного стекла, добавляют раствор диэтилтиокарбоната натрия до конечной концентрации 0,1% и хранят при температуре от минус 5 до минус 10°С не более года. Для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора. Полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм, затем фильтрат осаждают центрифугированием. Осадок высушивают на лиофильной установке. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее 2×10¹⁰ полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1×10¹⁰ полиэдров/мл.

Пример 2. Исследование токсичности и патогенности вирусного препарата на основе штамма ХС-17.

Проведена инфекционно-токсикологическая оценка препарата на основе штамма ХС-17. Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с "Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г." и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева, 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов.

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности препарата на мышах. 5 группам мышей (массой 18-20 г) по 10 в каждой вводили суспензию препарата в желудок и в брюшину из расчета по 1 мг препарата на 1 г веса. Контрольной группе вводили раствор 0,9% NaCl по 0,2 мл.

Введение дозы 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок. При внутрибрюшинном введении LD50 составляет 1000 мг/кг веса. При вскрытии погибших животных выявлено наличие уплотненного воспалительно-некротического очага, а также мелкие комковатые скопления введенного материала в брюшной полости (нерастворимые частицы наполнителя), у 20% животных отмечена увеличенная селезенка как следствие реакции на выведение кремнийсодержащих материалов. При этом термометрия, взвешивание, гематологические исследования живых мышей не выявили существенных отклонений от физиологической нормы. Серологические исследования, проведенные иммуноферментным и иммунофлуоресцентным методом, не выявили специфического бакуловирусного антигена ВЯП ХС в крови и органах животных на 28 день обследования.

Кожно-резорбтивное действие изучалось на гвинейских свинках при разовом и многократном нанесении препарата на основе штамма ХС-17, а также его действующего начала на неповрежденную и скарифицированную кожу. Контрольным группам наносили 0,9% NaCl.

Было установлено, что во всех случаях однократное нанесение не вызывало заметных местных или общих реакций у животных при воздействии всеми испытуемыми материалами. Также не выявлено отклонений от показателей в опытных группах при термометрии или взвешивании животных в течение 14 дней. Многократное нанесение на скарифицированную кожу сопровождалось местной реакцией раздражения, которое проходило через 4-5 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия препарата на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 5-7 дней после последнего воздействия. Повреждений роговицы и повышения температуры не отмечено.

Инфекционная оценка препарата проведена на теплокровных. Исследования проводили на культуре клеток эмбриональной ткани человека (ЧЭТ). Культуры инфицировали вирионами ВЯП ХС по 0,02 мл на пробирку с титром 1/512 по ИФА. Было проведено 7 пассажей патогенов. С помощью ИФА и ИФ-метода выявляли возможную адаптацию или репродукцию вируса. Установлено, что инфицирование ЧЭТ вирионами ВЯП ХС не приводит к цитопатическим изменениям монослоя клеток. В процессе пассажей исходного материала специфический антиген в культурах не выявлялся.

Проводили инфицирование лабораторных животных различного возраста при разных способах введения (в желудок, в нос, в брюшину, в вену, под кожу) суспензией полиэдров или вирионов ВЯП ХС. С помощью специально разработанных тест-систем определяли динамику антигенов в крови и внутренних органах испытуемых животных методами ИФА и РИФ. В результате проведенных исследований установлено, что вирусный антиген в крови и во внутренних органах теплокровных животных не накапливается и обычно элиминируется из организма к 7-14 дню после введения. Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного препарата на основе штамма ХС-17 показали, что препарат можно отнести к малотоксичным веществам (четвертая группа по гигиенической классификации). ЛД50 при введении в желудок лежит за пределами 2500 мг/кг, при внутрибрюшинном - за пределами 1000 мг/кг. Действующее начало препарата ВЯП ХС-17 нетоксично для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 3. Испытание опытных образцов вирусного препарата на основе штамма ХС-17.

Испытания проведены в фермерском хозяйстве Дилфуза-Хасанбай-Зухрахол Чартакского района Наманганской области согласно «Методическим указаниям по испытанию инсектицидов, акарицидов, моллюскоцидов в растениеводстве, Москва, 1986» и «Методическим указаниям по испытанию инсектицидов, акарицидов, биологически активных веществ и фунгицидов, Ташкент, 2004». Посев хлопчатника сорт С-65-24 произведен 10 апреля 2007 года. Высота стояния 85-90 см. Густота - 8-9 растений в 1 погонном метре.

Препарат использовался с титром 2×10 ¹⁰ полиэдров/г в виде водного 0,02%-ного раствора с глицерином. Всего обработана территория площадью 10 га. Расход препарата составил 40 г/га. Всего израсходовано препарата 800 г. Обработка проводилась при помощи ручного опрыскивателя К-90 и тракторного опрыскивателя ОВХ-28.

В процессе испытаний установлено: гибель насекомых наступала через 7-10 суток после обработки. При обследовании гусениц ХС через 7 суток обнаружено, что процент их гибели составляет 75%, а при последующем обследовании через 11 суток - 92%.

Биологическая эффективность препарата на основе штамма ХС-17 составляет 88-92%.

Пример 4. Сравнительные данные биологической активности заявляемого штамма ХС-17 штаммов-аналогов.

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал на основе известных штаммов Pd-1-5, КС-3-86 и заявляемого штамма ХС-17.

Биологическую активность штаммов вирусов оценивали путем определения величины LD50 - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и LT50 время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 10 ⁷ полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводили по методу Кербера, гибель насекомых определяли с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с.82-93). Данные приведены в таблице.

Таблица
Наименование штамма	Биологическая активность, LD50
% разведения штамма	Полиэдры/1 гусеница
ХС-17	0,003	(1-2)×102
КС-3-86	0,003	(2,3-7,0)×10 4
Pd-1-5	0,003	0,2×105
Примечание. Процент разведения стандарта штамма (1×10 9 полиэдров в 1 мл, a LT50 по каждому штамму находится в интервале 7-8 суток.

Анализ таблицы показывает, что заявляемый штамм ХС-17 позволяет получить вирусный инсектицидный препарат, который патогенен для гусениц ХС Heliothis armigera Hbn, причем по своей активности превышает инсектициды, полученные на основе известных штаммов Pd-1-5, КС-3-86 и ХС-2.

Препарат на основе предлагаемого штамма ВЯП ХС-17 удобен для применения в производственных условиях с использованием любых существующих марок мелкодисперсных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.