способ определения микроорганизмов рода salmonella

Формула изобретения

1. Способ определения микроорганизмов рода Salmonella, включающий отбор биоматериала, выделение ДНК, выявление геномной ДНК микроорганизма рода Salmonella в ПЦР с использованием специально подобранных праймеров, отличающийся тем, что для выявления геномной ДНК микроорганизма рода Salmonella в ПЦР используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-GAGCATATTCGTGGAGCAATG-3' и 5'-AATAACATCCTCAACTTCAGCAG-3 и флуоресцентный зонд Taqman FAM-TGCTCGTAATTCGCCGCCATTGG-гаситель.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исследуемого биоматериала используют клоакальные смывы или патологический материал сельскохозяйственных птиц.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относиться к молекулярной биологии и ветеринарной медицине и может быть использовано для контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий при сальмонеллезах сельскохозяйственных животных и птицы.

Известен способ обнаружения ДНК микроорганизмов рода Salmonella (заявка RU № 97119187/13, кл. C12Q 1/68, оп. 27.10.1999). Для выявления сальмонелл детектируют геномный полинуклеотидный локус, который определяется амплификацией праймерами, имеющими последовательность: 5'-GAIIIIGCIGGIGA(T/C)GGIACIACIAC-3' (SEQ ID 3) или 5'-(Т/С) (T/G) I (Т/С) (T/G)ITCICC(A/G)AAICCIGGIGC (Т/С) ТТ-3' (SEQ ID 4), или праймерными последовательностями, в основном комплементарными им.

Однако данный способ не предназначен для количественного определения микроорганизмов рода Salmonella.

Наиболее близким к заявляемому способу-прототипом, является способ определения микроорганизмов рода Salmonella, включающий отбор биоматериала, выделение ДНК и выявление геномной ДНК микроорганизмов рода Salmonella в ПЦР с использованием специально подобранных праймеров. Геномную ДНК микроорганизмов рода Salmonella в воде и в смывах с тушек цыплят определяют с использованием метода мембранной фильтрации пробы и последующей Real-time PCR с использованием флуоресцентного красителя SYBR green I (Wolffs, Petra F.G.; Glencross, Kari; Thibaudeau, Remain; Griffiths, Mansel W. Direct Quantitation and Detection of Salmonellae in Biological Samples without Enrichment, Using Two-Step Filtration and Real-Time PCR. / Applied & Environmental Microbiology, Jun 2006, vol.72 Issue 6 (EBSCO) 3896-3900). Известный способ не предназначен для контроля количественного содержания сальмонелл в клоакальных смывах, кишечном содержимом и патологическом материале.

Недостатками данного способа являются ограниченная функциональная возможность и низкая специфичность, связанная с вероятностью появления неспецифических положительных реакций, обусловленных синтезом неспецифических ампликонов.

Технической задачей заявляемого технического решения является расширение функциональных возможностей способа и повышение его специфичности и чувствительности.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающемся в количественном выявлении геномной ДНК микроорганизмов рода Salmonella у птицы и/или сельскохозяйственных животных, подвергнутых тем или иным ветеринарным мероприятиям.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

В качестве исследуемого материала (пробы) используют клоакальные смывы или патологический материал сельскохозяйственных птиц. Отбор материала производят любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Выделение ДНК производят любым известным способом. Например, ДНК из суспензии кишечного содержимого выделяют силико-сорбционным методом.

Для постановки ПЦР реакцию проводят на любом реалтайм - амплификаторе с использованием канала РАМ с заданным температурным режимом.

В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'GAGCATATTCGTGGAGCAATG-3' (Sm1), 5'-AATAACATCCTCAACTTCAGCAG-3 (Sm2) и флуоресцентный зонд Taqman FAM-TGCTCGTAATTCGCCGCCATTGG-гаситель (Sm3).

Для количественного учета реакции ставят контроли с заведомо известным содержанием микроорганизмов в пробе, в количестве не менее 4-х контрольных точек.

Реакцию учитывают общепринятым методом с использованием реал-тайм амплификатора на основании калибровочных кривых, полученных с использованием стандартных образцов с различным содержанием микроорганизмов в пробе. Способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность к микроорганизмам рода Salmonella, что позволяет достоверно и количественно определять наличие последних в исследуемых пробах.

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

1. Для выявления геномной ДНК микроорганизмов рода Salmonella в ПЦР используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'GAGCATATTCGTGGAGCAATG-3' (Sm1) и 5'-AATAACATCCTCAACTTCAGCAG-3 (Sm2), что позволяет получить более короткий ампликон (синтезируемый фрагмент ДНК), обеспечивающий повышение эффективности протекания реакции (ПЦР).

2. Для количественного определения содержания геномной ДНК микроорганизмов рода Salmonella в ПЦР используют специфический зонд TGCTCGTAATTCGCCGCCATTGG (Sm3), что снижает негативное воздействие фона, позволяет увеличить количество циклов и использовать более высокие концентрации праймеров, не опасаясь появления неспецифических реакций.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

У птицы с подозрениями на сальмонеллез отбирали пробы внутренних органов (печени) в количестве 100 мг.

Выделение ДНК проводили традиционным силико-сорбционным методом.

Для постановки ПЦР реакцию проводили со следующим температурным режимом (табл.1):

Таблица 1.
Этап	Температура, °С	Число циклов	Время, мин
1	2	3	4
1	95	1	пауза
2	95	1	3
3	95	48	0,2
63	48	0,5

ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис-HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl₂; 0,01% Твин 20; 0,2 mM дНТФ; 0,5 ткМ растворы олигонуклеотидных праймеров со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'GAGCATATTCGTGGAGCAATG-3' (Sm1), 5'-AATAACATCCTCAACTTCAGCAG-3 (Sm2), а также с ДНК зондом Sm3 Taqman FAM-TGCTCGTAATTCGCCGCCATTGG-гаситель. Для количественного учета реакции ставили контроли с заведомо известным содержанием микроорганизмов в пробе, в количестве не менее 4-х контрольных точек.

Реакцию учитывают общепринятым методом с использованием реал-тайм амплификатора «Miniopticon» на основании калибровочных кривых, полученных с использованием стандартных образцов с различным содержанием микроорганизмов в пробе. В результате анализа определили, что концентрация сальмонелл в пробах варьировала от 6 млн. геномных эквивалентов в пробе у птицы с яркими патологоанатомическими изменениями, до 450 геномных эквивалентов на пробу у птицы, погибшей от другого заболевания.

Пример 2.

Для оценки эффективности антибиотикопрофилактики птицы против сальмонеллеза были отобраны несколько групп цыплят 8-10 дневного возраста из неблагополучной по сальмонеллезу птицефабрики. Из клоаки были отобраны 10 проб с группы, которые были протестированы на наличие геномной ДНК микроорганизмов рода Salmonella заявляемым способом. Далее исследуемые группы птицы подвергались обработке различными антибиотиками, после чего пробы из клоаки были отобраны повторно и также протестированы на наличие геномной ДНК микроорганизмов рода Salmonella заявляемым способом. Геномную ДНК выделяли следующим образом. На одноразовые стерильные тампоны наносили содержимое клоаки. С тампонов соскоб смывали 0,5 мл 4М раствором гуанидинизотиоцианата. По 300 мкл смыва переносили в пробирки Эппендорфа, тщательно перемешивали, инкубировали при 56°С в течение 5 минут и центрифугировали при 4 тыс.об/мин в течение 3-х минут. Надосадочную жидкость переносили в другие пробирки и туда же вносили по 50 мкл ДНК сорбента (silica). Пробы тщательно перемешивали, инкубировали 5 минут, перемешивали на вортексе и центрифугировали при 5 тыс. об/мин, в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость сливали, сорбент промывали буфером для промывки, ДНК элюировали 50 мкл ТЕ буфера при 56°С.

Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2.
группа	антибиотик	Размеры выборки	Результаты ПЦР на сальмонеллу, % инфицированности
1	2	3	4
1	До обработки	10	20
2	До обработки	10	30
3	До обработки	10	20
4	До обработки	10	20
1	Флубактин	10	0
2	Энроксил	10	0
3	Энроксил	10	10
4	Эгосцин	10	10

Анализ таблицы показывает, что инфицированность цыплят сальмонеллой составляет от 0 до 30%, кроме того, различные антибиотики в различной степени эффективны при их применении in vivo. В подобной ситуации использование ПЦР в качестве критерия эффективности антибиотикотерапии позволяет учесть весь комплекс факторов, который определяет эффективность того или иного профилактического мероприятия, в частности антибиотикотерапии (например, антибиотик, эффективный в отношении чистой культуры сальмонелл, может быть неэффективен в организме, инфицированном сальмонеллами из-за провокации дисбактериоза, плохого всасывания, ферментативной инактивации и др.).

Пример 3.

С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, данную реакцию ставили с геномной ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые могут присутствовать в организме птицы. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3
№ трека	Вид микроорганизма	Наличие ампликона, специфичного для микроорганизмов рода Salmonella
1	Pseudomonas auregenosa	-
2	Staphilococcus aureus	-
3	Serratia marcescens	-
4	E.coli ATCC 25922	-
5	Проба, положительная на сальмонеллу при микробиологических исследованиях	+
6	Listeria monocitogenes	-
7	Yersinia pseudotuberculosis	-
8	Salmonella cholerasuis	+
9	E.coli (полевой изолят)	-
10	E.coli О157 H7	-
11	Проба, содерж. сальмонеллу по результатам микробиологических и ПЦР исследований.
12	Проба, положительная на сальмонеллу при микробиологических исследованиях	+
13	Salmonella tiphimurium	+

Из таблицы 3 видно, что заявляемый способ обладает достаточной специфичностью для определения микроорганизмов рода Salmonella.

Пример 4.

Для оценки чувствительности способа была проведена серия десятикратных разведений культуры S. Tiphimurium с начальной концентрацией 1×10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР с использованием заявляемого способа.

Таблица 4.
Концентрация микроорганизма рода Salmonella в пробе, кое/проба	Результаты ПЦР заявляемого способа	Количество сальмонелл в пробах (геномных эквивалентов в пробе)
1	2
100000	Положительно	100000
10000	Положительно	10000
1000	Положительно	1000
100	Положительно	100
10	Положительно	10
1	Отрицательно	0
0	Отрицательно	0

Как следует из таблицы 4, чувствительность ПЦР в заявляемом способе составляет не менее 10 кое/пробу. Этому способствуют 2 фактора - более короткий ампликон (синтезируемый фрагмент ДНК), что повышает эффективность протекания реакции, и наличие специфического олигонуклеотидного зонда, что снижает негативное воздействие фона и позволяет увеличить количество циклов и использовать более высокие концентрации праймеров, не опасаясь появления неспецифических реакций.

Таким образом, заявляемый способ позволяет более точно на количественном, популяционном уровне контролировать эффективность противосальмонеллезных мероприятий и корректировать противоэпизоотические мероприятия. Использование заявленного способа позволит повысить достоверность анализа, а также более точно, с учетом всей совокупности факторов, определяющих взаимодействие микроорганизма, макроорганизма, самого профилактического мероприятия и объектов окружающей среды, контролировать эффективность противоэпизоотических мероприятий против сальмонеллеза.