способ определения воздействия белка на ткани мозга

Формула изобретения

Способ определения противовоспалительного воздействия белка на ткань мозга при моделировании геморрагического инсульта, включающий подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации срезов в инкубационной среде с белком, и определение воздействия по сопоставлению исходных параметров и параметров после воздействия белком, отличающийся тем, что

исходно взвешивают срезы,

инкубируют часть срезов в инкубационной среде с концентрацией белка 5-10 мг/мл в течение 30 мин,

инкубируют все срезы в аутокрови в течение 360 мин,

обсушивают срезы, инкубировавшиеся только в аутокрови, фильтровальной бумагой и взвешивают их,

обсушивают срезы, инкубировавшиеся в инкубационной среде с белком и в аутокрови, фильтровальной бумагой и взвешивают их,

определяют прибавки веса при сопоставлении веса срезов после инкубации с исходными,

определяют способность белка защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при сопоставлении прибавок веса срезов после инкубации только в аутокрови и срезов после инкубации в инкубационной среде с белком и в аутокрови, с исходным весом срезов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к физиологии, в частности к способу определения воздействия белка на ткани мозга в эксперименте in vitro.

Известен способ определения воздействия белка на ткани мозга [1], принятый за прототип, включающий подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации в срезе с исследуемым белком и определение воздействия по сопоставлению параметров исходных и после воздействия.

Цель - определение воздействия белка на ткани мозга при моделировании геморрагического инсульта.

Сущность предложенного способа определения воздействия белка на ткани мозга, включающего подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации срезов в среде с исследуемым белком и определение воздействия по сопоставлению параметров исходных с последующими, состоит в исходном взвешивании срезов, инкубации части срезов в среде с белком в концентрации 5-10 мг/мл в течение 30 мин, последующей инкубации всех срезов в аутокрови в течение 360 мин, взвешивании срезов, инкубированных только в аутокрови, обсушивании остальных фильтровальной бумагой и взвешивании обсушенных срезов. При сопоставлении веса срезов, инкубированных только с аутокровью, с исходными определяют прибавку их веса. При сопоставлении обсушенных срезов с весом срезов, не подвергавшихся воздействию белка, определяют способность белка защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.

Способ поясняется примером определения воздействия на ткани мозга белка теплового шока с молекулярным весом 70 кДа (БТШ70) и дипептида L-карнозина.

Пример 1.

Определение воздействия белка БТШ70 на ткани мозга.

Все переживающие срезы нервных клеток мозга крыс после их приготовления взвешивают на торсионных весах ВТ-500, часть срезов помещают в стеклянные виалы с БТШ70 в концентрации 10 мг/мл, растворимым в физиологическом растворе объемом 1 мл, и выдерживают в нем 30 мин. Виалы устанавливают в аппарате Варбурга "WA-0110" с температурой водяной бани 37±0,2°С и с частотой горизонтального качания 120/мин. Затем инкубационную среду заменяют на аутокровь объемом 2 мл и все срезы в ней выдерживают 360 мин, что моделирует геморрагический инсульт, а 360 мин - продолжительность "терапевтического окна", после которого наступают необратимые нарушения функционирования нервных клеток. Затем срезы извлекают из аутокрови, обсушивают фильтровальной бумагой и снова взвешивают.

При сопоставлении веса срезов после инкубации только с аутокровью с исходными определяют прибавку их веса, их набухание и, соответственно, воспаления.

При сопоставлении веса срезов, прошедших предварительную инкубацию с БТШ70, а затем уже с аутокровью определяют способность белка защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.

Результаты взвешиваний и сопоставление прибавок веса приведены в таблице 1.

Таблица 1.
Воздействие БТШ70.
Вес среза при различных видах их инкубации	Средний вес среза (мг)	% изменения веса по отношению к исходному
Вес среза исходный после их изготовления	33	100% (n=8)
Вес среза после инкубации в физиологическом растворе (1 мл)	37	111% (n=8)
Вес среза после инкубации в аутокрови (2 мл)	42	154% (n=12)
Вес среза после предварительной инкубации с БТШ70 (10 мк/мл) и в аутокрови (2 мл)	39	118% (n=16)

Как видно из представленных данных в таблице, аутокровь вызывает значительное набухание нервных клеток, эти данные статистически достоверно отличаются (U=12, n=8 - контроль, n=12 - аутокровь; p 0,05), что свидетельствует о развитии процессов воспаления в них. Предварительное воздействие на нервные клетки БТШ70 до действия крови протектирует их от сильного набухания и, следовательно, от развития воспалительных процессов в них, различия в весе при этом являются недостоверными (U=25, n=8 - контроль, n=16 - БТШ70; p 0,05). Это свидетельствует о выраженных антивоспалительных свойствах БТШ70.

Отметим, что при действии БТШ70 процесс набухания срезов ингибировался и составлял не более 18% по сравнению с исходным весом. Следовательно, БТШ70 является надежным нейропротективным, антивоспалительным препаратом при моделировании геморрагического инсульта.

Пример 2.

Определение воздействия белка дипептида L-карнозина на ткани мозга.

Все подготовленные переживающие срезы нервных клеток мозга крыс взвешивают исходно на торсионных весах ВТ-500, затем помещают часть срезов в виалы с L-карнозином в концентрации 5 мг/мл, растворенным в физиологическом растворе объемом 1 мл, и выдерживают в нем 30 мин. Затем все срезы выдерживают 360 мин - продолжительность "терапевтического окна" - в аутокрови. После этого срезы, не инкубировавшиеся в L-карнозине, взвешивают, а остальные - обсушивают фильтровальной бумагой и уже после этого взвешивают. При сопоставлении веса срезов после инкубации с аутокровью и исходного определяли прибавку веса за счет их набухания, характерного для воспаления.

При сопоставлении веса срезов, прошедших предварительную инкубацию с L-карнозином, а затем уже с аутокровью, определяют способность дипептида L-карнозина защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.

Результаты взвешиваний и сопоставлений прибавок веса приведены в таблице 2.

Таблица 2.
Воздействие дипептида L-карнозина
Вес среза при различных видах их инкубации	Средний вес среза (мг)	% изменения веса по отношению к исходному
Вес среза исходный после их изготовления	24	100% (n=8)
Вес среза после инкубации в физиологическом растворе (1 мл)	27	113% (n=8)
Вес среза после инкубации в аутокрови (2 мл)	42	154% (n=12)
Вес среза после предварительной инкубации с L-карнозином (5 мк/мл) и в аутокрови (2 мл)	26	108% (n=16)

Как видно из представленных данных в таблице, аутокровь вызывает значительное набухание нервных клеток, что свидетельствует о развитии процессов воспаления в них. Различия в весе срезов после инкубации в крови достоверно отличаются от контрольных значений (U=27, n=8 - контроль, n=12 - аутокровь; p 0,05).

Предварительное воздействие на нервные клетки L-карнозина до действия аутокрови протестирует их от сильного набухания и, следовательно, от развития в них воспалительных процессов. Эти данные статистически достоверно отличаются от контроля (U=19, n=8 - контроль, n=16 - L-карнозин; p 0,05), что свидетельствует о выраженных антивоспалительных свойствах L-карнозина.

Необходимо отметить, что БТШ70 и L-карнозин имеют эндогенное происхождение и, следовательно, не будут вызывать негативных побочных эффектов, кроме того, известно, что дипептид L-карнозин выполняет функции антиоксиданта [2, 3, 4]. Эти качества придают дополнительные преимущества этим веществам при их использовании в качестве антигеморрагического терапевтического средства при моделировании геморрагического инсульта.

Источники информации

1. Мокрушин А.А., Павлинова Л.И., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Эффекты экзогенного белка теплового шока (hsp70) на глутаматергическую синаптическую передачу в обонятельной коре мозга крыс in vitro // ДАН, 2004, т.395, № 4, с.551-553. Прототип.

2. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М.: Изд-во МГУ, 1998. 320 с.

3. Decker E.A. The role of phenolics, conjugated linoleic acid, carnosine, and pyrroloquinoline quinone as nonessential dietary antioxidants // Nutr. Rev.1995. V.53. P.49-58.

4. Decker E.A., Crum A.D., Calvert J.T. Differences in the antioxidant mechanisms of carnosine in the presence of copper and iron // J. Agric. Food Chem. 1992. V.40. P.756-759.