биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий для разложения метилфосфоновой кислоты и ее эфиров

Формула изобретения

Биокатализатор для разложения метилфосфоновой кислоты и ее эфиров, являющихся продуктами химического разложения фосфорорганических отравляющих веществ типа зарина, зомана и Vx, содержащий иммобилизованную биомассу клеток бактерий и криогель поливинилового спирта в качестве носителя, отличающийся тем, что биокатализатор содержит клетки индивидуальных бактериальных культур Pseudomonas species 78Г, Escherichia coli DH5 /pTrcTE-OPH, Escherichia coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, способных к деградации фосфорорганических соединений с С-Р-связью и включенных в криогель поливинилового спирта, формирование которого происходит в среде воздуха, и имеет следующий компонентный состав, мас.%:

Биомасса бактериальных клеток	0,125÷0,725
Криогель поливинилового спирта	7,6÷12,8
Водная фаза	До 100

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, и представляет собой биокатализатор на основе иммобилизованных бактериальных клеток, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют микробиологическое разложение метилфосфоновой кислоты и ее эфиров.

Метилфосфоновая кислота (МФК) и ее эфиры являются продуктами химической детоксикации фосфорорганических отравляющих веществ (ФОБ), а именно зарина, зомана и Vx, которые относятся к группе фосфорорганических боевых отравляющих веществ нервно-паралитического действия [Committee on Review and Evaluation of International Technologies for the Destruction of Non-Stockpile Chemical Materiel, National Research Council, Review of International Technologies for Destruction of Recovered Chemical Warfare Materiel. Washington, DC: National Academies Press, 2006, 128 p.], запасы которых в соответствии с требованиями Международной Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия (принята Государственной Думой 31.10.1997) должны быть уничтожены. Специфическая особенность ликвидации запасов отравляющих веществ, в соответствии с требованиями Конвенции, состоит в необходимости дополнительной переработки первичных продуктов детоксикации до состояния, исключающего возможность их использования для повторного синтеза исходных веществ. Также наряду с самими ФОБ первичные продукты их детоксикации (эфиры МФК и сама МФК) обладают определенной токсичностью [Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F., Hauschild V. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products.// Environ. Health Perspect., 1999, V.107(12), p.933-974.], что обуславливает необходимость их разложения.

При реализации химических методов разложения эфиров МФК проводят щелочной гидролиз с использованием высококонцентрированных растворов гидроксидов калия или натрия с добавлением растворов различных солей [Патент РФ № 97100230, 1999. Способ утилизации отравляющего вещества типа Vx].

Недостатком данного способа является необходимость применения коррозионно стойкого оборудования, высоких температур (80-400°С) и соблюдения длительных временных интервалов экспозиции реакционных масс (до 3-х месяцев).

Необходимо отметить, что С-Р-связь характеризуется чрезвычайно высокой устойчивостью к термической деструкции и химическому разложению, даже в присутствии сильных кислот и оснований, в связи с чем химический гидролиз не приводит к разрушению С-Р-связи в молекуле самой МФК. При этом разрыв С-Р-связи является основным показателем эффективной деструкции отравляющих веществ, так как в результате разрыва именно С-Р-связи процесс гидролиза становится необратимым.

На сегодняшний день большое внимание привлекают к себе биотехнологические способы разложения эфиров МФК и самой МФК, основанные на способности клеток микроорганизмов использовать для поддержания своей жизнедеятельности энергию различных химических связей, присутствующих в структуре веществ, в том числе и токсичных [Attaway Н., Nelson J.O., Baya A.M., Voll M.J., White W.E., Grimes D.J., Colwell R.R. Bacterial detoxification of diisopropyl fluorophosphate.// Appl. Environ. Microb., 1987, V.53(7), p.1685-1689; DeFrank J.J., Cheng T.C. Purification and properties of an organophosphorus acid anhydrase from a halophilic bacterial isolate.//J BacferW., 1991, V. 173(6), p.1938-1943; Konsaku M.A. Microbial carbon-phosphorus bond cleavage enzyme requires two protein components for activity.//J Bacteriol., 1989, V. 171(8), p.4504-4506; Osamura N., Murata K., Kimura A. Cytosolic C-P bond cleavage activity in bacterial cells isolated from soil.//./ J. Ferment. Bioeng., 1991, V.71(2), p.128-130; Pipke R., Amrhein N. Degradation of the phosphonate herbicide glyphosate by Arthrobacter atrocyaneus ATCC 13752.// Appl. Environ. Microb., 1988, V.54(5), p.1293-1296]. Биотехнологические способы экологически безопасны, основаны на функционировании внутриклеточных микробных ферментов, выступающих в роли биологических катализаторов, и выгодно отличаются от химических методов разложения токсичных веществ тем, что:

- обеспечивают разрыв химически стабильной С-Р связи,

- реализуются при мезофильных температурах (температурах окружающей среды);

- не требуют применения концентрированных щелочных растворов и оборудования, выполненного из специального коррозионно-стойкого материала.

Известен ряд способов биодеградации продуктов щелочного гидролиза зарина, зомана и Vx, основанных на использовании сложных по составу искусственных многокомпонентных консорциумов свободных клеток различных микроорганизмов [Патент США № 6599733 В1 (2003); Патент США № 7001758 В1 (2006) Microbial biodegradation of phosphonates. C12N 1/20, B09B 3/00], обеспечивающих разложение эфиров МФК или самой МФК. В состав этих консорциумов входят разные бактериальные культуры, представленные множеством различных штаммов (Methylobacterium radiotolerans штамм GB21, Agrobacterium tumefaciens штамм GB2GA, Klebsiella oxytoca штамм GB2CS и GB272, Aureobacterium sp. штаммы GB2, GB23, GB272 и GB292). Перед их использованием для непосредственного разложения изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты (ИПЭМФК) в концентрации выше 5 мМ проводят обязательную предварительную адаптацию клеток консорциума в аэробных условиях при постоянном перемешивании (150 об/мин) в течение 12 суток при 28-29°С в бесфосфатной среде, приготовленной на основе 50 мМ буфера HEPES (рН 7,2) и содержащей 2,7 мМ (329,4 мг/л) ИПЭМФК, 0,5 г/л KCl, 0,5 г/л (NH₄)₂SO₄, 10 мл/л стандартного раствора микроэлементов Wolin Salts (Sigma, США). Далее клетки переносят в среду аналогичного состава, содержащую 2,4-6,0 мМ ИПЭМФК, и проводят конверсию эфира МФК в МФК на 100% за 14 суток. Для разложения накопившейся МФК (230,4 мг/л) и утилизации продукта разложения МФК - фосфат-ионов - в среду вводится источник углерода (20 г/л кукурузного сиропа), и после 5 суток культивирования консорциума в тех же условиях, что указаны выше (рН, температура, перемешивание среды), достигается 90-92% степень разложения вещства с С-Р-связью. Время функционирования такого биокатализатора 14 суток.

Данный биокатализатор, представляющий собой консорциум свободных бактериальных клеток, предназначенный для разложения МФК и ее изопропилового эфира, обладает рядом существенных недостатков, которые заключаются в том, что:

- он обеспечивает низкие скорости разложения ИПЭМФК и МФК, которые, согласно данным разработчиков биокатализатора, составляют 0,87 мг/л/ч и 1,77 мг/л/ч соответственно;

- необходим контроль постоянства сложного состава микробного консорциума с целью обеспечения высокой эффективности его действия, притом что точный состав биокатализатора (концентрации различных клеток) разработчиками не указывается;

- необходима предварительная длительная адаптация клеток к токсичным субстратам (12 суток);

- необходима утилизации отработанной бактериальной биомассы и проведение культивирования клеток с целью накопления биомассы и приготовления на ее основе новой порции биокатализатора в виде консорциума после завершения каждого цикла процесса разложения МФК.

Применение иммобилизованных клеток при реализации многих биотехнологических процессов позволяет использовать многократно одни и те же клетки микроорганизмов и, таким образом, избегать необходимости решения проблемы постоянной утилизации накапливающейся биомассы. Кроме того, применение клеток в иммобилизованном виде позволяет повысить их устойчивость к воздействию различных неблагоприятных факторов (высокие концентрации токсичного субстрата, изменение рН среды и др.) и обеспечить более длительное и эффективное проведение процесса с их участием [Nedovic V., Willaert R. Fundamentals of cell immobilisation biotechnology // Kluwer Academic Publishers, 2004, 555 p.].

Основными характеристиками любого иммобилизованного биокатализатора, применяемого для разложения первичных продуктов гидролиза ФОБ являются:

- скорость разложения токсичного субстрата, предопределяющая общую длительность процесса;

- степень разложения токсичного субстрата (%);

- наличие/отсутствие необходимости подготовки биокатализатора к его использованию для разложения токсичных субстратов и длительность такой подготовки;

- длительность возможного эффективного использования биокатализатора в целевом процессе.

Эти основные характеристики целесообразно использовать для сравнительного анализа известных биокатализаторов, разработанных на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов для разложения МФК и ее эфиров.

Известен иммобилизованный биокатализатор для разложения эфиров МФК, представляющий собой активный ил, а именно совокупность автоселектированных самоиммобилизованных клеток различных микро- и макроорганизмов, которая складывается на очистных сооружениях речных вод [Harvey S.P., Carey L.F., Haley M.V., Bossle PC, Gillitt N.D., Bunton C.A. Sequencing batch reactor biodegradation of hydrolyzed sarin as sole carbon source // Bioremed J., 2003, V.7(3-4), p.179-185]. Состав такого иммобилизованного биокатализатора не известен.

Для активации иммобилизованного биокатализатора в виде активного ила и применения его для разложения ИПЭМФК и МФК в щелочных гидролизатах зарина проводят предварительную его адаптацию в течение 74 суток с постепенным увеличением концентрации ИПЭМФК и МФК в среде до 2,8 г/л и 250,4 мг/г соответственно. Применение иммобилизованного биокатализатора в виде адаптированного активного ила обеспечивает 99,6% рзложение эфира МФК до его остаточной концентрации 10 мг/л в среде в течение 15 суток, то есть скорость разложения ИПЭМФК составляет 7,75 мг/л/ч, но при этом биокатализатор не способен осуществлять разложение МФК, и наблюдается увеличение концентрации этого соединения в среде пропорционально количеству гидролизованного эфира (то есть в десятки раз). Биокатализатор может быть использован для разложения эфира МФК на протяжении 200 суток в реакторе периодического действия при 15-дневном циклическом удержании среды в реакторе.

К недостаткам этого биокатализатора следует отнести:

- неспособность биокатализатора осуществлять разложение МФК, которая является ключевым веществом с С-Р-связью, деструкция которого обеспечивает необратимость разложения ФОВ;

- необходимость предварительной длительной адаптации биокатализатора (в течение 74 сут.) к токсичному субстрату,

- конечный состав иммобилизованного биокатализатора в виде адаптированного активного ила не известен, что делает невозможным анализ и поддержание стабильного микробного состава биокатализатора и, следовательно, воспроизводимого уровня биодеградационной активности биокатализатора.

Известен иммобилизованный биокатализатор, на основе искусственного микробного бактериального консорциума GB2 [DeFrank J.J., Guelta M., Harvey S., Fry I.J., Earley J.P., Lupton F.S. Biodegradation of hydrolyzed chemical warfare agents by bacterial consortia // Netherlands: Kluwer Academic Publishers. In: B.Zwanenburg et al. (Eds.), Enzymes in Action: Green Solution for Chemical Problems, 2000, p.193-209]. Разработанный биокатализатор предназначен для разложения МФК, ИПЭМФК и этилового эфира метилфосфоновой кислоты (ЭЭМФК), образующихся, соответственно, при щелочном гидролизе зарина и вещества Vx, принятого на вооружение в армии США.

Для получения иммобилизованного биокатализатора в реактор (1 л) помещаются блоки вспененного полиуретанового носителя, которые удерживаются в реакторе с помощью полиуретановых полых цилиндров. Далее реактор заполняется средой, содержащей 3,8 об.% щелочного гидролизата ФОВ с одним из эфиров МФК в качестве источника фосфора, а также 1,2 г/л NH₄CI, 0,35 г/л КН₂ РО₄ и 10 мл/л стандартного раствора микроэлементов Wolin Salts, так, чтобы общий объем заполнения составил 600-800 мл. Далее в реактор вносится смесь клеток (Methylobacterium radiotolerans штамм GB21, Agrobacterium tumefaciens штамм GB2GA, Klebsiella oxytoca штамм GB2CS и GB272, Aureobacterium sp. штаммы GB2, GB23, GB272 и Gb292), составляющих консорциум. Происходит адгезивная иммобилизация клеток консорциума на пористом носителе.

Перед использованием иммобилизованного биокатализатора для целенаправленного разложения эфиров МФК проводят его адаптацию к токсичным субстратам (условия и сроки проведения адаптации разработчиками не указываются).

Далее адаптированный иммобилизованный биокатализатор применяется для разложения эфиров МФК. Для этого щелочные гидролизаты ФОВ, содержащие эфиры МФК, разбавленные в 1000 раз, вводятся в среду для культивирования иммобилизованных клеток так, чтобы исходная концентрация эфиров МФК в реакторе с биокатализатором составила 500 мг/л (~4 мМ). Дополнительно в среду вводится источник углерода: глюкоза, изопропанол, глицерин, меласса или глицерин в смеси с мелассой (точные концентрации веществ не указаны).

Максимальная степень разложения эфиров МФК и МФК под действием иммобилизованного биокатализатора составляет 40% за 15 суток вне зависимости от концентрации и источника углерода, вводимого в среду. Биокатализатор может функционировать на протяжении 40 суток в периодических условиях.

Основными недостатками этого иммобилизованного биокатализатора явлются:

- достаточно низкая скорость разложения соединений с С-Р-связью под действием иммобилизованного биокатализатора, которая составляет, согласно данным разработчиков, 0,56 мг/л/ч;

- необходимость использования многокомпонентного консорциума микроорганизмов для достижения указанной максимальной степени деградации и необходимость контроля и поддержания постоянного сложного микробного состава иммобилизованного биокатализатора для обеспечения его эффективного действия;

- необходимость проведения адаптации иммобилизованного биокатализатора к токсичным субстратам перед его использованием;

- использование для получения иммобилизованного биокатализатора метода адгезии клеток, составляющих микробный консорциум, на поверхности носителя приводит к неоднородности и гетерогенности состава биокатализатора, так как клетки разных бактериальных штаммов проявляют, в силу разного строения клеточных стенок, различную адгезивную способность к одному и тому же материалу, что сказывается на эффективности их удерживания на поверхности носителя. Также при выбранном способе иммобилизации возникают серьезные диффузионные проблемы для массообменных процессов, осуществляемых адгезированными клетками, находящимися в слоях, расположенных в непосредственной близости к поверхности носителя.

Известен другой иммобилизованный биокатализатор, который является прямым усовершенствованием вышеописанного биокатализатора на основе иммобилизованного консорциума [Патент США № 6080906 (2000) Demilitarization of chemical munitions, A62D 3/00]. Способ его получения и состав используемого микробного консорциума GB2 те же, что указаны выше, но в качестве носителя для адгезионной иммобилизации клеток используют кубические гранулы из вспененного полиуретана с линейным размером 1,25 см, содержащие включенные в полиуретановую матрицу частицы активированного угля. Носитель также удерживается в реакторе с помощью полиуретановых полых цилиндров. Точный состав иммобилизованного биокатализатора не известен.

Полученный иммобилизованный биокатализатор (680 мл) обеспечивает при 20-25°С и рН 6,0-9,0 в аэробных условиях при объеме жидкости в реакторе, равном 740 мл, 75%-ное разложение фосфорорганических соединений (ЭЭМФК и МФК) в течение 15 суток. Таким образом, этот результат достигается при концентрации иммобилизованного биокатализатора в среде 920 г/л. Скорость разложения эфира МФК и МФК под действием этого биокатализатора не известна, так как авторы этой разработки не указывают исходные концентрации веществ, необходимые для достижения 75%-ного разложения веществ за указанное время.

Биокатализатор может быть использован для обработки гидролизатов Vx, содержащих ЭЭМФК и МФК, в периодических условиях функционирования реактора на протяжении 8 рабочих циклов по 15 суток, что в целом составляет 120 сут.

Данный биокатализатор обладает всеми основными недостатками, указанными для вышеописанного биокатализатора, и дополнительно еще одним, который заключается в том, что частицы активированного угля, введенные в состав носителя, согласно данным разработчиков биокатализатоа, сорбируют из среды эфир МФК. В результате его значительное количество остается связанным в носителе и не подвергается разложению.

Известен биокатализатор на основе бактериального консорциума, иммобилизованного в криогель поливинилового спирта (ПВС) (Zhang Y., Autenrieth R.L., Bonner J.S., Harvey S.P., Wild J.R. Biodegradation of neutralized sarin // Biotechnol. Bioeng., 1999, V.64 (2), p.221-231), предназначенный для разложения ИПЭМФК, являющегося продуктом щелочного гидролиза зарина. Для получения биокатализатора используется консорциум бактериальных культур, выделенных из образцов воды, собранных на полигонах Эдживудского химико-биологического центра армии США. Точный микробный состав консорциума не известен.

Перед иммобилизацией клетки консорциума длительно (5 циклов по 7 сут) адаптируют к средам, содержащим источник углерода (глюкозу, глицерин или сукцинат натрия), 1,5 г/л NH₄Cl, 0,3 г/л КН₂РО ₄, 10 мл/л стандартного раствора микроэлементов Wolin Salts, 2 мг/л CoCl₂, 1 мг/л ZnCl₂ и ИЭМФК, при этом от цикла к циклу концентрацию ИЭМФК в среде увеличивают до конечной концентрации 0,35 г/л.

Иммобилизацию клеток, адаптированных к ИЭМФК, проводят включением биомассы бактерий в гранулы криогеля ПВС. Для этого клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, отделяют центрифугированием от среды, использованной для их адаптации, и смешивают с раствором ПВС так, чтобы их концентрация в смеси составляла 10%. Суспензию клеток закапывают в охлажденный раствор гексана, что приводит к быстрому охлаждению капель и образованию гранул с диаметром 2 мм. Полученные гранулы биокатализатора размораживают и тщательно отмывают 15 мМ HEPES-буфером от гидрофобного растворителя.

Иммобилизованный биокатализатор обеспечивает 85% разложение 350 мг/л ИЭМФК за 400 ч (~17 сут), а также разложение 297,5 мг/л МФК, накапливающейся в среде за тот же период времени, на 84,5%. Увеличение длительности обработки не приводит к увеличению степени деструкции ИЭМФК и снижению концентрации МФК в системе. Время функционирования биокатализатора составляет 17 суток.

Основными недостатками данного биокатализатора являются:

- применение бактериального консорциума неизвестного состава, контроль и поддержание которого невозможны для сохранения длительного и эффективного действия биокатализатора;

- необходима предварительная длительная адаптации клеток (в течение 35 сут) к токсичным субстратам перед их иммобилизацией,

- способ иммобилизации предусматривает применение гексана в качестве гидрофобной среды для формирования гранул биокатализатора на основе гидрофильного носителя, что требует последующей обязательной стадии тщательного удаления токсичного и гидрофобного растворителя с поверхности гранул, так как его присутствие приводит к образованию гидрофобной пленки, существенно снижающей доступность растворенных в среде веществ, в том числе кислорода, для клеток внутри гранул. В результате иммобилизованные клетки быстро теряют свою жизнеспособность, и, как следствие этого, эффективность действия биокатализатора быстро снижается. Применение гексана, являющегося сильно огнеопасным и токсичным для человека, а не только для микробных клеток веществом, для получения иммобилизованного биокатализатора требует соблюдения особых мер безопасности при работе с ним (транспортировке, хранении, применении), а также необходимость проведения специальной обработки вод, содержащих гексан и полученных после отмывки гранул биокатализатора от гидрофобного растворителя;

- достаточно низкая скорость разложения соединений с С-Р-связью под действием иммобилизованного биокатализатора, которая составляет, согласно данным разработчиков, 0,74 мг/л/ч как для ИЭМФК, так и для МФК.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого носителя (криогель ПВС), а также по методу иммобилизации клеток (включение в гель), используемых для получения биокатализатора, принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является получение высокоактивного биокатализатора для разложения МФК и ее эфиров, являющихся продуктами химической детоксикации ФОВ, а именно зарина, зомана и Vx, на основе клеток индивидуальных бактериальных культур, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта и способных обеспечить высокую скорость разложения токсичных субстратов на протяжении длительного времени.

Поставленная задача решается путем создания биокатализатора, который содержит клетки индивидуальных бактериальных культур Pseudomonas species 78Г, Escherichia coli DH5 /pTrcTE-OPH, Escherichia coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, способных к деградации фосфорорганических соединений с С-Р-связью и включенных в криогель поливинилового спирта, формирование которого происходит в среде воздуха, и имеет следующий компонентный состав (мас.%): биомасса бактериальных клеток - 0,125÷0,725, криогель поливинилового спирта - 7,6÷12,8, водная фаза - до 100.

Разложение МФК и ее эфиров с помощью предлагаемого биокатализатора на основе иммобилизованных клеток осуществляется при его внесении в питательную среду, содержащую целевые вещества, а также источник углерода.

Предлагаемый биокатализатор характеризуется длительным периодом функционирования (до 310 сут), а также способен осуществлять разложение эфиров МФК и МФК со скоростью до 21,4 мг/л/ч и 18 мг/л/ч соответственно.

В отличие от аналогов и прототипа для получения заявляемого биокатализатора используются клетки индивидуальных бактериальных культур, а не консорциумы бактерий, что позволяет существенно упростить процесс получения биокатализатора в больших количествах с хорошо воспроизводимыми свойствами и осуществлять контроль за его состоянием в процессе эксплуатации, а также легко устанавливать наличие/отсутствие контаминации биокатализатора посторонней микрофлорой.

В качестве индивидуальных культур, составляющих основу заявляемого иммобилизованного биокатализатора, используются клетки бактерий, обладающие высокой способностью к разрушению фосфорорганических соединений, например, клетки Pseudomonas species 78Г [Патент РФ № 2154103 (2000) Штамм Pseudomonas species 78Г, предназначенный для деградации продуктов деструкции фосфорорганических отравляющих веществ. C12N 1/20; 9/88], клетки Escherichia coli DH5 /pTrcTE-OPH [Патент РФ № 2232807 (2002) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-ОРН и продуцент фермента органофосфатгидролазы, C12N 1/21, 15/52, 15/70], клетки Escherichia coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH [Патент РФ № 2255975 (2003) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы, C12N 1/21, 15/52, 15/70]. Эти клетки являются продуцентами внутриклеточных высокоактивных ферментов, катализирующих разрыв O-Р-, S-P-, F-P- и С-Р-связи. Их применение в иммобилизованном виде позволяет обеспечить разрыв целевой связи, а также утилизировать из реакционной среды образующиеся при этом разрыве продукты реакции. Таким образом, при использовании подобных клеток из реакционной среды последовательно удаляются продукты реакции (при разложении эфира МФК образуется МФК, которая разлагается до фосфорной кислоты и усваивается клетками). При использовании консорциумов все эти последовательные превращения осуществляются разными клетками микроорганизмов, при этом продукты жизнедеятельности одних клеток являются субстратами для других. Диффузия метаболитов одних клеток к другим клеткам в качестве субстратов, биодоступность таких субстратов для пространственно разобщенных клеток существенно влияют на скорость процесса разложения основных веществ в целом. В случае высокоактивных монокультур все эти процессы осуществляются одними и теми же клетками, что в целом позволяет избавиться от массообменных проблем, присутствующих в консорциумах, и существенно увеличить скорость превращения веществ.

Для получения иммобилизованного биокатализатора монокультуры бактериальных клеток выращивают на богатых питательных средах, известных для данных штаммов, с целью накопления метаболически активной биомассы, которую концентрируют (сгущают) перед включением в матрицу полимерного носителя. Такое концентрирование проводят известными приемами, например центрифугированием.

Применение в качестве носителя клеток криогеля поливинилового спирта (ПВС), формируемого при замораживании-оттаивании раствора полимера, обусловлено высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками криогеля на основе ПВС [Лозинский В.И.Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии, 2002, т.71(6), с.559-585]. При этом в заявляемом техническом решении иммобилизация биомассы осуществляется путем ее суспендирования в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) в атмосфере воздуха, а не гидрофобной жидкости, как в прототипе, при определенных условиях, что приводит к формированию прочного полимерного криогеля, содержащего включенную в его матрицу клетки. При этом полностью устраняются все технологические и экологические проблемы, а также проблемы безопасной организации производства, существующие при реализации способа получения биокатализатора по прототипу с применением гексана. К тому же в ходе криогенной обработки получаемому иммобилизованному биокатализатору, в отличие от прототипа, может быть придана любая необходимая форма, в частности, форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается в соответствующей форме.

Предлагаемое изобретение предусматривает формирование криогеля ПВС с одновременной иммобилизацией клеток. Состав заявляемого биокатализатора и соотношение компонентов были выбраны на основе проведенных экспериментов и являются уникальными, обеспечивающими выдающиеся характеристики биокатализатора.

Собственно разложение МФК и ее эфиров с помощью биокатализатора на основе иммобилизованных клеток состоит в том, что биокатализатор вносится в реактор, где при рН среды 7,5-9,0 проводится процесс микробного разложения токсичных субстратов и утилизации их в качестве источника фосфора в присутствии источника углерода, в качестве которого могут быть использованы общеупотребимые в микробиологическом производстве глюкоза, глицерин, меласса и др.

Существенным отличием заявляемого изобретения является новый, ранее неизвестный состав биокатализатора и сочетание его компонентов, а именно тип бактериальных монокультур, используемых для создания биокатализатора, соотношение биомассы бактерий и криогеля ПВС, формируемого в среде воздуха, а не гидрофобного растворителя, в присутствии клеток при получении биокатализатора для разложения МФК и ее эфиров, которые ранее известны не были.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является способность биокатализатора осуществлять разложение МФК и ее эфиров с высокими скоростями при длительном сроке функционирования.

Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.

Пример 1. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp. 78Г, включенных в криогель поливинилового спирта, для разложения МФК.

8,4 г биомассы клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 20 г/л глюкозы, 4,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л (NH ₄)₂SO₄, 5 мг/л CoCl₂×6H ₂O, 5 мг/л ZnSO₄×4H₂O (рН 6,8-7,0), центрифугированием (20 мин, 8000 об/мин), смешивают с 167,6 г 8%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе физиологического раствора (0,9% NaCl), при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту суспензию далее распределяют с помощью дозирующего устройства (шприц, дозатор и др.) в лунки 96-луночных иммунологических планшетов по 0,1 мл, которые помещают в морозильную камеру при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 17 ч, оттаивание проводят при +8°С. Получают иммобилизованный биокатализатор в виде гранул цилиндрической формы, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса бактериальных клеток - 0,48 (по сух. массе); криогель ПВС - 7,6; водная фаза - до 100.

Полученный иммобилизованный биокатализатор без какой-либо адаптации к токсичному субстрату обеспечивает 100% разложение 485 мг/л МФК в аэробном реакторе объемом 1 л с периодическим режимом культивирования при 28°С при непрерывном перемешивании среды (180 об/мин) в течение 27 ч при внесении в минимальную среду культивирования, содержащую 0,1 г/л MgSO₄×7H₂O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 1 г/л NaHCO₃ (рН 8,0), 15 г/л глюкозы в качестве источника углерода. Таким образом, скорость разложения МФК составляет 18 мг/л/ч. Полученный биокатализатор способен функционировать в такой системе до 250 сут.

Пример 2. Биокатализатор на основе клеток E. coli DH5 /pTrcTE-OPH, включенных в криогель ПВС, для разложения МФК.

4,3 г биомассы клеток бактерий E. coli DH5 /pTrcTE-OPH, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 6,8), 47,7 мг/л изопропилтиогалактозида, центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин), перемешивают с 171,7 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 50 мМ Na-карбонатного буфера (рН 10), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную смесь выливают ровным слоем на противень с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,5 см, замораживают при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч, оттаивают при +10°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса бактериальных клеток - 0,24 (по сух. массе); криогель ПВС - 9,76; водная фаза - до 100.

Полученный иммобилизованный биокатализатор без какой-либо адаптации к токсичному субстрату обеспечивает 100% разложение 480 мг/л МФК в аэробном реакторе объемом 1 л с периодическим режимом культивирования при 28°С при непрерывном перемешивании среды (200 об/мин) в течение 45 ч при внесении в минимальную среду культивирования, содержащую 0,1 г/л MgSO ₄×7H₂O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄ CI, 1 г/л NaHCO₃ (рН 8,0), 5 г/л глюкозы в качестве источника углерода. Таким образом, скорость разложения МФК составляет 10,7 мг/л/ч. Полученный биокатализатор способен функционировать в такой системе до 280 сут.

Пример 3. Биокатализатор на основе клеток Pseudomonas sp. 78Г, включенных в криогель ПВС для разложения изобутилового эфира МФК и МФК.

8,4 г биомассы клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 20 r/л глюкозы, 4,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л (NH₄)₂ SO₄, 5 мг/л CoCl₂×6H₂O, 5 мг/л ZnSO₄×4H₂O (рН 6,8-7,0), центрифугированием (30 мин, 6000 об/мин), смешивают с 167,6 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе физиологического раствора (0,9% NaCl), при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту суспензию далее распределяют с помощью дозирующего устройства (шприц, дозатор и др.) в лунки 96-луночных иммунологических планшетов по 0,15 мл, которые помещают в морозильную камеру при -10°С, выдерживают в замороженном состоянии 24 ч, оттаивание проводят при +8°С. Получают иммобилизованный биокатализатор в виде гранул цилиндрической формы, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса бактериальных клеток - 0,45 (по сух. массе); криогель ПВС - 9,5; водная фаза - до 100.

Полученный иммобилизованный биокатализатор без какой-либо адаптации к токсичным субстратам обеспечивает 100% разложение 380 мг/л изобутилового эфира МФК (ИБЭМФК) в аэробном реакторе объемом 1 л с непрерывным режимом культивирования при 30°С при перемешивании среды барботажем в течение 31 ч при внесении в минимальную среду культивирования, содержащую 0,1 г/л MgSO₄×7H ₂O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 1 г/л NaHCO ₃ (рН 8,0), 20 г/л глицерина в качестве источника углерода. Таким образом, скорость разложения изобутилового эфира МФК составляет 12,3 мг/л/ч.

268 мг/л МФК, образующейся при разложении ИБЭМФК, также подвергается разложению под действием иммобилизованного биокатализатора и за то же время (31 ч) в той же реакционной среде в присутствии ИБЭМФК разлагается на 95%, то есть скорость разложения МФК составляет 8,2 мг/л/ч. Полученный биокатализатор способен функционировать в такой системе до 300 сут.

Пример 4. Биокатализатор на основе клеток E. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, включенных в криогель ПВС, для разложения изопропилового эфира МФК и МКФ.

11 г биомассы клеток бактерий E. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глицерина, 6,95 г/л КН₂РО₄ , 12,54 г/л КН₂РО₄×3Н₂О, 2,37 мг/л CoCl₂ (рН 6,8-7,0), 23,8 мг/л изопропилтиогалактозида, центрифугированием (15 мин, 8500 об/мин), смешивают с 869 г 13%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов со сферическим дном по 0,2 мл. Замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 28 ч, оттаивание - при +4°С. Получают биокатализатор с полусферической формой гранул, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,125 (по сух. массе); криогель ПВС - 12,8; водная фаза - до 100.

Полученный иммобилизованный биокатализатор без какой-либо адаптации к токсичным субстратам обеспечивает 95% разложение 300 мг/л изопропилового эфира МФК (ИПЭМФК) в аэробном реакторе объемом 1 л с периодическим режимом культивирования при 26°С при непрерывном перемешивании среды (180 об/мин) в течение 20 ч при внесении в минимальную среду культивирования, содержащую 0,1 г/л MgSO₄×7H ₂O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 2 г/л NaHCO ₃ (рН 9,2), 15 г/л мелассы в качестве источника углерода. Таким образом, скорость разложения ИПЭМФК составляет 14,25 мг/л/ч.

217 мг/л МФК, образующейся при разложении ИПЭМФК, также подвергается разложению под действием иммобилизованного биокатализатора и за то же время (20 ч) в той же реакционной среде в присутствии ИПЭМФК разлагается на 84%, то есть скорость разложения МФК составляет 9,1 мг/л/ч. Полученный биокатализатор способен функционировать в такой системе до 310 сут.

Пример 5. Биокатализатор на основе клеток E. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, включенных в криогель ПВС, для разложения изобутилового эфира МФК и МФК в составе реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения вещества Vx по рецептуре РД-4М.

23,2 г биомассы клеток бактерий E. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, полученной после отделения от среды, как это описано в Примере № 4, смешивают с 456,8 г 8%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 50 мМ Na-фосфатно-карбонатного буфера (рН 8,0) при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в прямоугольную металлическую форму с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,3 см. Замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 16 ч, оттаивание - при +4°С. Размороженный биокатализатор, имеющий форму гелевого пласта, разрезают и получают гранулы в форме параллелепипеда с размером 0,3×0,3×0,3 см. Полученный биокатализатор имеет следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,725 (по сух. массе); криогель ПВС - 7,6; водная фаза - до 100.

Полученный иммобилизованный биокатализатор без какой-либо адаптации к токсичным субстратам обеспечивает 65% разложение 2370 мг/л изобутилового эфира МФК (ИБЭМФК) в аэробном реакторе объемом 1 л при непрерывным режимом культивирования при 30°С при перемешивании среды барботажем в течение 72 ч и при использовании в качестве среды культивирования реакционной массы, полученной в результате химического уничтожения вещества Vx по рецептуре РД-4М, принятой в РФ для уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ [Шкодич П.Е., Желтобрюхов В.Ф., Клаучек В.В. Эколого-гигиенические аспекты проблемы уничтожения химического оружия.// Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2004, 236 с], разбавленной в 100 раз минимальной средой, которая описана в вышеизложенных Примерах, с дополнительным введением 25 г/л глюкозы в качестве источника углерода. Реакционная масса, полученная после химического уничтожения Vx, имеет следующий состав: 23,7% ИБЭМФК, 29% диизобутилметилфосфоната, 36,9% N-метилпирролидона, 1,2% капролактама и 8,9% бис-[2-(N,N-диизопропиламино)-этил] дисульфида, 0,3% воды. Таким образом, скорость разложения ИБЭМФК составляет 21,4 мг/л/ч.

1087 мг/л (или 11,3 мМ) МФК, образующейся при разложении ИБЭМФК, также подвергается разложению под действием иммобилизованного биокатализатора и за то же время (72 ч) в той же реакционной среде в присутствии ИБЭМФК и других компонентов реакционной массы разлагается на 70%, то есть скорость разложения МФК составляет 15,1 мг/л/ч. Полученный биокатализатор способен функционировать в такой системе до 250 сут.

Пример 6. Биокатализатор на основе клеток Pseudomonas sp. 78Г, включенных в криогель ПВС, для разложения изопропилового эфира МФК и МФК в составе реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения зарина химическим гидролизом.

Иммобилизованный биокатализатор, полученный как описано в Примере 3, при его введении в среду, содержащую реакционные массы, полученные после химического уничтожения зарина в результате обработке 10 М растрвором NaOH при 90°С и разбавленные в 1000 раз минимальной средой, содержащей 0,1 г/л MgSO₄×7H₂ O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 8 г/л NaHCO₃ (рН 9,5) и 25 г/л глюкозы в качестве источника углерода, обеспечивает без какой-либо адаптации к токсичным субстратам 100% разложение содержащегося в среде 250 мг/л изопропилового эфира МФК (ИПЭМФК) в аэробном реакторе объемом 1 л с непрерывным режимом культивирования при 28°С при перемешивании среды барботажем в течение 26 ч. Таким образом, скорость разложения изобутилового эфира МФК составляет 9,6 мг/л/ч.

190 мг/л МФК, образующейся при разложении ИПЭМФК, также подвергается разложению под действием иммобилизованного биокатализатора и за то же время (26 ч) в той же реакционной среде в присутствии ИПЭМФК разлагается на 100%, то есть скорость разложения МФК составляет 7,3 мг/л/ч. Полученный биокатализатор способен функционировать в такой системе до 245 сут.

Таким образом, такое ранее неизвестное сочетание компонентов биокатализатора, то есть биомассы клеток индивидуальных бактериальных культур, обладающих высокой биодеградационной активностью по отношению к МФК и ее эфирам, и криогеля ПВС, формируемого в среде воздуха, при заявляемом соотношении компонентов данного биокатализатора и приводит к получению биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом.

1. Заявляемый биокатализатор обладает существенно улучшенной скоростью разложения как МФК, так и ее эфиров, которые достигают, соответственно, 18 мг/л/ч (Пример 1) и 21,4 мг/л/ч (Пример 5), что превышает те же показатели у аналогов и прототипа в 2,8 раз по эфирам МФК и в 10 раз по МФК. При этом биокатализатор позволяет осуществлять разложение токсичных субстратов в широком диапазоне концентраций.

2. Заявляемый биокатализатор характеризуется увеличенным периодом функционирования, в частности до 310 сут (Пример 4), что превышает продолжительность использования аналогичных биокатализаторов, представленных в качестве аналогов и прототипа, более чем в 1,5-22 раза.

3. Разработанный иммобилизованный биокатализатор не нуждается в адаптации перед его использованием для разложения МФК или ее эфиров, взятых для этих целей в виде чистых веществ или в составе реакционных масс сложного химического состава.

4. Формирование биокатализатора в отсутствие гексана позволяет существенно технически упростить процесс получения биокатализатора на основе криогеля поливинилового спирта, разнообразить форму получаемого биокатализатора, а также значительно улучшить его экологическую, экономическую и социальную, с точки зрения элиминирования негативного воздействия токсичного растворителя на здоровье людей, стороны.