способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при микроплазмозе свиней

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней, состоящий из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их микоплазмозным антигеном при 70°С в течение 30 мин, причем для сенсибилизации используют эритроциты, которые нагружают сенситином, полученным из смеси в равных пропорциях культур микоплазм (M.hyosynoviae, M.hyorhinis и Ureaplasma sp.), прогретых на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, с последующим трехкратным отмыванием диагностикума фосфатно-буферным солевым раствором с pH 7,2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использовано в ветеринарной медицине.

Наиболее близким к заявляемому способу является эритроцитарный диагностикум для реакции гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней (Андросик Н.Н. Повышение активности эритроцитарных микоплазменных диагностикумов // Ветеринария - 2000, - № 3, с.25-29), который готовится по следующей схеме.

1. В качестве сорбента антигенов используют нативные и фиксированные эритроциты барана. Фиксацию проводят 4%-ным раствором формальдегида в присутствии 5% сахарозы по методу J.S. Jngracham (1959) в модификации П.С.Барман и А.В. Месенжиковой (1974) и 0,4%-ным раствором акролеина по методу Ф.С.Носкова и Б.К. Гаврилюк (1970).

2. В качестве гемсенситинов используют корпускулярные антигены микоплазм (М.hyorhinis, A.granularum, A.laidlawii), а также выделенные из них и культуральной жидкости полисахаридные антигены.

Последние выделяют по методике, описанной Н.Н. Костюковой и соавт. Выращенную на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота, обогащенном лошадиной сывороткой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и глюкозой, культуру микоплазм освобождают от питательной среды путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 1 ч. К культуральной жидкости прибавляют 5 объемов этанола, охлажденного до минус 10-15°С. Преципитат отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе, объем которого составляет 0,1 объема использованной культуральной жидкости. Полученный антиген прогревают 20 мин в водяной бане при 100°С для денатурации неспецифических термолабильных антигенов.

Для выделения полисахаридных антигенов из микоплазм готовят 20-миллиардную взвесь на фосфатно-солевом растворе (рН 7,2), добавляют кристаллический панкреатин из расчета 20 мг/мл, тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч в водяной бане при 37°С, периодически встряхивая. Затем смесь обрабатывают 5 объемами охлажденного до минус 10-15°С этанола, выдерживают сутки и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.

Надосадочную жидкость удаляют, а осадок растворяют в солевом фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) до 0,1 объема первоначально взятой для культивирования питательной среды.

Полученный антигенный препарат прогревают на водяной бане при 100°С в течение 20 мин и используют для сенсибилизации эритроцитов.

3. Для танизации используют 2,5%-ную взвесь нативных или фиксированных эритроцитов, добавляют равный объем танина в концентрации 1:20000 и выдерживают 15-20 мин в водяной бане (37°С). Трижды эритроциты отмывают физиологическим раствором и сенсибилизируют по общепринятой методике.

4. Сенсибилизирующую дозу микоплазменного антигена и температурный режим сенсибилизации подбирают экспериментально. Эритроциты, нагруженные антигеном, отмывают, ресуспендируют фосфатно-солевым раствором (рН 7,2) до 1%-ной концентрации и используют для постановки РНГА в микроварианте на титраторе Такачи.

Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов и инактивации в течение 20 мин при 56°С разводят в двукратной последовательности 1%-ным раствором нормальной сыворотки крови лошади в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2). К каждому разведению добавляют по одной капле диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 2-5 ч. Реакцию оценивают на четыре креста. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее агглютинацию на три креста.

Однако данный способ обладает некоторыми недостатками:

1) метод фиксации эритроцитов барана 4% раствором формальдегида более длительный по времени, требует дополнительных затрат, связанных с внесением 5% сахарозы;

2) изготовление антигенов из микоплазм довольно сложный метод, включающий в себя дополнительную обработку культур микоплазм этанолом и панкреатином;

3) дополнительная обработка фиксированных эритроцитов танином, многие серии которого вызывают спонтанную самоагглютинацию эритроцитов, требует проверки каждой серии танина для исключения данных отрицательных свойств препарата, что также усложняет технологический процесс;

4) не указаны оптимальные сенсибилизирующая доза микоплазмозного антигена и температурный режим сенсибилизации, что затрудняет возможность широкого использования данного метода нагрузки эритроцитов.

Целью данного изобретения является получение микоплазмозного эритроцитарного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови свиней в РНГА с использованием наиболее простых и экономичных методов изготовления антигенов, а также фиксации и сенсибилизации эритроцитов барана, без проведения их танизации (табл.1).

Поставленная цель достигается дробной формалинизацией эритроцитов барана, а также получением антигена из трех культур микоплазм (М. hyosynoviae, M. hyorhinis и Ureaplasma sp.) путем прогревания их на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, механического смешивания в равных пропорциях и концентрации центрифугированием; сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов барана без предварительной танизации смесью трех микоплазмозных антигенов при 70°С в течение 30 мин с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН 7,2.

Таблица 1.
Сравнительная характеристика методов получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации при микоплазмозе свиней
Метод, предложенный Н.Н. Андросиком	Заявляемый метод
1. Фиксацию эритроцитов проводят 4%-ным раствором формальдегида в присутствии 5% сахарозы и 0,4%-ным р-ром акролеина	1. Фиксацию эритроцитов проводят 20%-ным р-ром формальдегида, дробно. 4-кратно отмывают буферным раствором путем центрифугирования.
2. Антигены получают из культур микоплазм, которые освобождают от питательной среды путем центрифугирования. К культуральной жидкости прибавляют 5 объемов охлажденного этанола, преципитат отделяют центрифугированием. Осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере, прогревают на водяной бане. Для выделения полисахаридных антигенов к взвеси микоплазм добавляют кристаллический панкреатин, выдерживают на водяной бане и обрабатывают 5 объемами охлажденного этанола, выдерживают сутки и центрифугируют. Осадок разводят в буферном растворе, прогревают на водяной бане.	2. Антигены получают из культур микоплазм, которые освобождают от питательной среды путем центрифугирования. Осадки разводят 1:10 физиологическим р-ром. Прогревают на водяной бане.

Продолжение таблицы 1.
3. Для танизации эритроцитов добавляют танин в концентрации 1:20000 и выдерживают на водяной бане, трижды отмывают физиологическим раствором.	3. Танизацию эритроцитов не проводят.
4. Сенсибилизирующую дозу антигена и температурный режим подбирают экспериментально. Нагруженные антигеном эритроциты отмывают, ресуспендируют фосфатно-солевым буфером до 1%-ной концентрации.	4. Сенсибилизацию формалинизированных 3% эритроцитов проводят на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, помешивая. За 10 мин до конца добавляют 1% 40%-ного р-ра формальдегида. Отмывают трехкратно буферным р-ром путем центрифугирования и ресуспендируют до 3%-ной концентрации.

Описание метода

При формалинизации эритроцитов используют свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН 7,2 (0,137М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорно-кислый калий на 1 л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П.

К 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов четырехкратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% двадцатипроцентного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

В качестве сенситинов используют корпускулярные антигены микоплазм (М.hyosynoviae, М.hyorhinis и Ureaplasma sp.). Микоплазмы выращивают на трех жидких питательных средах: среда для индикации глюкозоферментирующих микоплазм, аргининзависимых микоплазм и уреаплазм, разработанных Омским НИИ природно-очаговых инфекций совместно с ИВМ ОмГАУ, описанных Н.Н. Новиковой (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного микоплазмоза плотоядных: дис. канд. ветеринар. наук: 16.00.03 / Новосибирск, 2002. С.37-55).

Культуры микоплазм освобождают от питательных сред путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение одного часа. Осадки трех культур после трехкратного ресуспендирования и последующего центрифугирования смешивают в равных количествах и разводят 1:10 физиологическим раствором. Полученный антигенный препарат прогревают на водяной бане при 70°С в течение 30 мин и используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов.

Для нагрузки формалинизированных 3% эритроцитов их сенсибилизируют в соотношении 2:1 (2V антигена: 1V эритроцитов). Сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% сорокапроцентного раствора формальдегида.

Эритроциты, нагруженные антигеном, трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин, ресуспендируют в этом же растворе, доводя до первоначальной 3% концентрации, и используют для постановки РНГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.

Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 мин при 56°С, разводят в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН 6,4), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.

Определены специфичность и активность четырех серий (С-1 - С-4) микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) в РНГА (табл.2, 3).

Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней.

Контроль на специфичность МЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий микоплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. МЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, пастереллезной, лептоспирозной, листериозной, сальмонеллезной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными микоплазмозными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:10 и выше (табл.2).

Таблица. 2. Специфичность МЭД в РНГА
МЭД	Стандартные диагностические сыворотки	Микоплазмозные сыворотки
Г	А	У
бруц.	паст.	лепт.	лист.	сальм.	хлам.	1/10	1/10	1/10
С-1	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
С-2	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
C-3	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
С-4	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
Примечание: бруц. - бруцеллезная; паст. - пастереллезная, лепт. - лептоспирозная; лист. - листериозная; сальм. - сальмонеллезная; хлам. - хламидиозная; Г - глюкозоферментирующая - M.hyorhinis, А - аргининферментирующая - M.hyosynoviae, У - Ureaplasma sp.

Контроль на активность МЭД в РНГА

Для контроля активности полученного эритроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом, в объеме 0,5 мл в полистироловых пластинках, с микоплазмозными (Г, А, У-сыворотками) и смешанной (Г+А+У) микоплазмозными сыворотками в разведениях с 1:10 до 1:640. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с рН 6,4, так как при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля используют фосфатный буферный раствор (ФБР) рН 6,4 и заведомо отрицательные и положительные на микоплазмоз сыворотки: свиней в разведениях 1:25-1:1600 и кроликов в разведениях 1:10-1:640.

С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешанной сывороткой против трех видов микоплазм полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:160, на два креста 1:320. С отрицательной сывороткой отмечается четко выраженная отрицательная реакция во всех разведениях. В контроле с буферным раствором отрицательная реакция наблюдается во всех разведениях (табл.3).

Таблица 3.
Активность (МЭД) в РИГА
Титр сыворотки	Микоплазмозные кроличьи сыворотки	Г+А+У сыворотка	Свиные микоплазмозные сыворотки	ФБР
Титр сыв-ки	Позитивная	Негативная
Г	А	У
1:10	++++	++++	++++	++++	1:25	++++	-	-
1:20	++++	++++	++++	++++	1:50	++++	-	-
1:40	++++	++++	++++	++++	1:100	++++	-	-
1:80	+++	+++	+++	+++	1:200	+++	-	-
1:160	+++	+++	+++	+++	1:400	+++	-	-
1:320	++	++	++	++	1:800	++	-	-
1:640	-	-	-	-	1:1600	-	-	-
Примечание: Г - глюкозоферментирующая - M.hyorhinis, A - аргининферментирующая - M.hyosynoviae, У - Ureaplasma sp.; ФБР - фосфатный буферный раствор рН 6,4.