способ получения жидкой коджи и способ производства шочу

Формула изобретения

1. Способ производства жидкой коджи, используемой для производства ферментированного пищевого продукта или напитка, предусматривающий культивирование плесени коджи, представляющей собой белую плесень коджи или черную плесень коджи, в жидкой среде, содержащей в качестве сырья материал, выбранный из группы, состоящей из зерновых культур, поверхность которых покрыта оболочкой; зерновых, с поверхности которых удалена лишь шелуха; необработанных бобов или клубней, поверхность которых покрыта кожицей; амаранта и/или киноа, причем способ предусматривает одновременное производство и накопление, по меньшей мере, глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы в культуральном продукте, полученном при культивировании плесени коджи в жидкой среде, содержащей сырьевой материал.

2. Способ по п.1, в котором зерновую культуру, поверхность которой покрыта кожурой, не подвергают шлифованию либо используют зерновую культуру, подвергнутую шлифованию до степени шлифования 92% или более.

3. Способ по п.1, в котором зерновая культура представляет собой ячмень.

4. Способ по п.1, в котором зерновая культура представляет собой рис, пшеницу, гречиху, просо японское, просо итальянское, просо культурное, гаолян или кукурузу.

5. Способ по п.1, в котором зерновая культура, с поверхности которой удалена лишь шелуха, представляет собой нешлифованный рис.

6. Способ по п.1, в котором необработанные бобы или клубни, поверхность которых покрыта кожицей, включают сою, красную фасоль или сладкий картофель.

7. Способ по п.1, в котором амарант и/или киноа не подвергают предварительной обработке, такой как измельчение или дробление.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором при производстве жидкой коджи плесень коджи подвергают культивированию в жидкой среде, содержащей сырьевой материал, при этом ферментативную активность жидкой коджи благодаря присутствию оболочки на используемом в качестве сырья материале регулируют подавлением скорости выделения сахарида, происходящего из крахмала, содержащегося в сырьевом материале, в систему культивирования.

9. Способ производства шочу, включающий использование жидкой коджи, полученной способом по любому из пп.1-8.

10. Способ по п.9, в котором все стадии производства шочу проводят в жидкой фазе.

11. Способ по п.9 или 10, в котором производство шочу осуществляют в жидкой фазе, защищенной от внешних воздействий.

12. Способ по п.9 или 10, в котором при производстве шочу осуществляют добавлением еще одного вида сырья к жидкой коджи с получением первичной смеси.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения жидкой закваски "Коджи" (Koji), используемой для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков и, в частности, жидкой закваски, имеющей ферментативную активность, требуемую для варки "Шочу" (японского самогона).

В качестве разновидности коджи для производства спиртовых напитков используют твердую закваску, которую получают путем инокуляции спор плесени в сваренное сырье и затем культивирования этого сырья, или жидкую закваску, которую получают путем получения жидкой среды добавлением сырья и других питательных веществ в воду, после чего жидкую среду инокулируют спорами плесени, предварительно выращенным мицелием грибка или т.п., после чего проводят культивирование.

В традиционном производстве алкогольных напитков или ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких как саке, шочу, соевый соус, ферментированная соевая паста и сладкое саке, широко используют так называемую твердую коджи, полученную культивированием плесени на твердом сырье. При методе твердого культивирования плесень коджи, такую как Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae или Aspergillus sojae, наносят на твердое сырье, такое как сваренные паром зерновые для роста плесени на твердой поверхности.

Так, например, при производстве шочу широко используют Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori и т.п. Однако, поскольку в методе твердого культивирования культуральная система имеет неоднородное распределение сырья и плесени коджи, в этой системе трудно регулировать такие факторы, как температура, влажность и содержание различных питательных добавок. Таким образом, такая культура слишком сложна для надлежащего контроля. Кроме того, производство коджи предпочтительно проводить в открытой системе. В этом случае необходимо осуществлять контроль качества в том, что касается загрязнения другими бактериями. Таким образом, рассматриваемый способ не пригоден для широкомасштабного производства.

В отличие от этого, при использовании метода культивирования в жидкой среде можно легко осуществлять контроль процесса и контроль качества, вследствие чего такой способ подходит для обеспечения эффективной производительности. Однако имеются проблемы, в частности, связанные с тем, что трудно достичь достаточной ферментативной активности, требуемой для варки шочу. В результате имеется лишь несколько примеров, в которых культуральный продукт, полученный жидким культивированием плесени коджи, может реально использоваться в качестве шочу коджи. «Культуральный продукт», полученный методом жидкого культивирования, относится к самому продукту, полученному методами жидкого культивирования (на который далее также ссылаются, как на «жидкую коджи»), культуральной жидкости, плесеням, их концентратам, или сухим продуктам на их основе.

Основная причина, препятствующая использованию культурального продукта, полученного методом жидкого культивирования в производстве ферментированных продуктов и напитков, таких как шочу и т.п., состоит в том, что, как хорошо известно, поведение плесени коджи в производстве такого фермента как амилаза и целлюлаза в жидкой культуре значительно отличается от ее поведения при твердом культивировании, и, кроме этого, известно, что производительность фермента может значительно уменьшаться (см. документ 1).

При производстве алкогольных напитков, включающих шочу, спирт образуется в результате параллельных ферментаций двух типов. Поэтому сахаролитические ферменты из плесени коджи, влияющие на доставку глюкозы в плесень коджи, в особенности глюкоамилаза (которую иногда сокращено обозначают как GA) и кислотоустойчивая -амилаза (иногда сокращенно обозначаемая символом ASAA), являются ключевыми энзимами спиртовой ферментации. Однако известно, что глюкоамилаза в культуральном продукте, полученном методом жидкого культивирования, обладает значительно более низкой активностью, и ее свойства значительно отличаются от свойств, полученных методом твердого культивирования (см. документ 2).

Для улучшения глюкоамилазной активности плесени коджи предложено два способа, в одном из которых осуществляют культивирование плесени, делая акцент на росте мицелия (см. Патент 1), тогда как в другом обжаренные зерновые культуры добавляют в культуральную среду, содержащую плесень коджи (см. Патент 2). Способ, описанный в Патенте 1, предусматривает культивирование на пористой мембране или в среде инклюзивного фиксирующего агента с отверстиями, в результате чего образуется новый ген glaB, кодирующий глюкоамилазу с целью увеличения ферментативной активности. Таким образом, рассматриваемый способ требует строгого контроля или использования специального культурального устройства, что затрудняет его практическое использование. Кроме этого способ, описанный в Патенте 2, представляет собой культивирование плесени коджи в жидкой среде с использованием обжаренных зерновых, составляющих, по меньшей мере, часть сырья. Соответственно, рассматриваемый способ требует проведения дополнительно стадии получения обжаренных злаков.

В этой связи авторы изобретения предложили изобретение, которое относится к способу культивирования плесени коджи с использованием жидкого сусла, содержащего трудноразлагаемые сахариды, относящиеся к плесени коджи (Патент 3). Согласно изобретению продукт культивирования плесени коджи, обладающий высокой активностью гликолитических энзимов, таких как глюкоамилаза, используемый в производстве алкогольных напитков или ферментированных продуктов и напитков, может быть получен традиционным и экономичным способом.

С другой стороны, недавно был начат молекулярный биологический анализ кислотоустойчивой -амилазы (см. документ 3). По этому поводу сообщается следующее: белая плесень коджи содержит два различных амилазных гена, которые, соответственно, ответственны за два различных свойства, кислотонеустойчивую -амилазу и кислотоустойчивую -амилазу. Однако экспрессирующие характеристики соответствующих генов существенно отличаются друг от друга. В жидкой среде кислотонеустойчивая -амилаза может продуцироваться в значительных количествах, в то время как кислотоустойчивая -амилаза, ключевой фермент для варки шочу, образуется в незначительном количестве.

При производстве шочу его варят в среде с низким значением рН с целью предотвращения гниения смешанной шочу. Однако кислотонеустойчивая -амилаза не способствует гликолизу при варке шочу, поскольку этот фермент быстро теряет активность при низких значениях рН. Поэтому, для производства шочу важно продуцировать с высоким выходом кислотоустойчивую -амилазу, способствующую гликолизу при варке шочу, с помощью жидкой культуры плесени коджи.

Имеется сообщение, в котором приводятся результаты исследования поведения плесени коджи в жидкой культуре с целью получения кислотоустойчивой -амилазы. В таком способе используется синтетическая среда, содержащая пептон и раствор цитратного буфера, и для завершения процесса требуется время культивирования порядка 100 часов или более. Поэтому, едва ли можно считать такой способ производства жидкой коджи применимым для реальной варки шочу (см. документ 4).

Патентный документ 1: JP-A 11-225746

Патентный документ 2: JP-A 2001-321154

Патентный документ 3: JP-A 2003-265165

Непатентный документ 1: Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 1938-1946 (1998), Yuichi Yamane et al: published by Brewing Society of Japan, 99, 84-92 (2004).

Непатентный документ 2: Hata Y. et al: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997), Hata Y. et al: Gene, 207, 127-134 (1998), Ishida H. et al: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998), Ishida H. et al: Curr Genet., 37, 373-379 (2000).

Непатентный документ 3: Nagamine K. et. al: Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2194-2202 (2003).

Непатентный документ 4: Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), Shigetoshi Sudo et al: published by Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994).

Раскрытие сущности изобретения

Проблемы, решаемые с помощью Изобретения.

В соответствие с патентным документом 3 плесень коджи с высокой глюкоамилазной активностью получают культивированием плесени коджи в жидкой среде, полученной добавлением трудноразлагаемых сахаридов, а не в жидкой среде, приготовленной с использованием сырья, такого как зерновые.

Кроме этого, ранее уже была описана технология получения продукта культивирования плесени коджи, обладающего высокой глюкоамилазной активностью в результате культивирования плесени коджи в жидкой среде. Однако не разработана технология получения жидкой коджи с высокой активностью кислотоустойчивой -амилазы, другого ключевого энзима ферментации спирта, в результате культивирования плесени коджи в жидкой среде. Обычно кислотоустойчивая -амилаза считается ферментом, который не может вырабатываться в жидкой культуре, и вследствие этого не разработана жидкая коджи с высокой активностью кислотоустойчивой -амилазы.

Цель изобретения состоит в разработке способ производства жидкой коджи культивированием плесени коджи в жидкой среде, содержащей нешлифованные зерновые культуры в качестве сырья, например, зерновые, покрытые оболочкой, или зерновые, с поверхности которых удалена только кожура (чешуя и т.п.), необработанные бобы или клубни, или некоторые смешанные зерновые, но не в специальной жидкой среде, полученной добавлением жидкой коджи, используемой в производстве ферментированных продуктов и напитков, в особенности, жидкой коджи с высокими активностями глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы, которые могут служить ключевыми ферментами в процессе спиртового брожения для варки шочу, в присутствии специальных сахаридов и т.п. или с использованием обжаренного сырья.

Средства решения поставленных задач

В результате проведенных исследований, для решения указанных проблем авторы изобретения обнаружили, что при производстве жидкой коджи, используемой для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, жидкая коджи с усиленными активностями глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы может быть получена культивированием плесени коджи в жидкой среде, содержащей в качестве сырья зерновые, покрытые оболочкой, или зерновые культуры, с поверхности которых удалена лишь оболочка (чешуя и т.п.), необработанные бобы или клубни, или некоторые смешанные зерновые, амарант и/или киноа (еще одно название - "квиноя"). Кроме этого, изобретение было создано благодаря обнаружению того, что жидкая коджи с усиленной ферментной активностью может использоваться для варки шочу.

Другими словами сущность изобретения может быть отражена следующей последовательностью пунктов.

(1) Способ производства жидкой коджи, используемой для получения ферментированных продуктов или напитков, предусматривающий:

культивирование плесени коджи в жидкой среде, содержащей в качестве сырья материал, выбранный из группы, состоящей из зерновых, поверхность которых покрыта оболочкой; зерновых, с поверхности которых оболочка (шелуха и т.п.) удалена; необработанных бобов или клубней, поверхность которых покрыта кожурой; амаранта и/или киноа.

(2) Способ получения жидкой коджи по п.(1), в котором плесень коджи представляет собой белую плесень коджи и/или черную плесень коджи.

(3) Способ получения жидкой коджи по п.(1), в котором поверхность покрытых оболочкой зерновых не подвергают шлифовке, или используют зерновые со степенью шлифовки, равной или превосходящей степень наличия оболочки, остающейся на поверхности зерна.

(4) Способ получения жидкой коджи по п.(1) или п.(3), в котором зерновые представляют собой ячмень.

(5) Способ получения жидкой коджи по п.(4), в котором используют ячмень со степенью шлифовки 90% или более.

(6) Способ получения жидкой коджи по п.(1) или п.(3), в котором зерновые представляют собой рис, пшеницу, гречиху, просо японское, просо итальянское, просо культурное, сорго японское или кукурузу.

(7) Способ получения жидкой коджи по п.(1), в котором зерновые, с поверхности которых удалена лишь шелуха (например, мякина), представляют собой нешлифованный рис.

(8) Способ получения жидкой коджи по п.(1), в котором необработанные бобы или клубни, поверхность которых покрыта кожицей, представляют собой сою, красную фасоль, или батат.

(9) Способ получения жидкой коджи по п.(1), в котором амарант и/или киноа не подвергают предварительной обработке, такой как измельчение или дробление.

(10) Способ получения жидкой коджи по любому из пп.(1)-(9), предусматривающий:

одновременное производство и накопление, по меньшей мере, глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы в культивированном продукте плесени коджи, культивированной в жидкой среде, содержащей сырье.

(11) Способ производства ферментированного пищевого продукта или напитка, предусматривающий:

производство ферментированного пищевого продукта или напитка с использованием жидкой коджи, полученной способом по любому из пп.(1)-(10).

(12) Способ производства ферментированного пищевого продукта или напитка по п.(11), в котором все стадии получения ферментированного пищевого продукта или напитка проводят в жидкой фазе.

(13) Способ производства ферментированного пищевого продукта или напитка по пункту (11) или (12), в котором производство ферментированного пищевого продукта или напитка проводят в жидкой фазе в условиях защиты от внешних воздействий.

(14) Способ производства ферментированного пищевого продукта или напитка по пп.(11) или (13), в котором производство ферментированного пищевого продукта или напитка проводят с добавлением еще одного сырья в жидкую коджи с целью получения первичной кашицы.

(15) Способ производства ферментированного пищевого продукта или напитка по пп.(11) или (14), в котором ферментированный продукт или напиток представляет собой шочу.

(16) Набор на основе жидкой коджи для получения ферментированного продукта или напитка, причем жидкую коджи с глюкоамилазной активностью и кислотоустойчивой -амилазной активностью получают способом производства жидкой коджи по любому из пп.(1)-(10).

(17) Способ производства жидкой коджи по любому из пп.(1)-(9), в котором в ходе производства жидкой коджи, при котором плесень коджи культивируют в жидкой среде, содержащей сырье, ферментативную активность жидкой коджи регулируют подавлением скорости выделения сахарида, образующегося из крахмала в сырье, в культуральную среду.

Положительные эффекты изобретения

Согласно изобретению жидкая коджи, в которой ферменты, такие как глюкоамилаза и кислотоустойчивая -амилаза, требующиеся для варки шочу, одновременно вырабатываются с высокими выходами, может быть получена культивированием плесени коджи в жидкой среде, содержащей описанные выше различные виды сырья. В зависимости от типа жидкой культуры культивирование можно строго регулировать в отличие от использования твердой культуры, в результате чего может быть экономично и эффективно получена жидкая коджи стабильного качества.

Более того, при получении жидкой коджи согласно изобретению может быть обеспечена такая же степень ферментации, как для сусла шочу с использованием традиционной твердой коджи. Полученный таким способом шочу обладает практически таким же качеством, что и шочу, полученный с использованием твердой коджи без ухудшения органолептических характеристик.

Кроме этого, сырье, используемое в изобретении, представляет собой нешлифованный, необработанный материал или материал, шлифованный в такой степени, что на поверхности остается, по меньшей мере, кожица. В результате можно ожидать улучшений в плане доступности сырья или регенерации.

Следует отметить, что при получении шочу с использованием жидкой коджи, производимой согласно изобретению, все технологические стадии можно проводить в жидкой фазе, в отличие от традиционного способа получения шочу с использованием твердой коджи. Таким образом, может быть разработана эффективная система для производства шочу, устойчивая в сравнении с традиционным способом.

Перечень иллюстраций

Фиг.1 - диаграмма зависимости между количеством используемого сырого ячменя и количествами глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы, образующихся в культуре плесени коджи с использованием жидкой среды, содержащей нешлифованный ячмень.

Фиг.2 - диаграмма зависимости между количеством используемого шлифованного ячменя и количествами глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы, образующихся в культуре плесени коджи с использованием жидкой среды, содержащей шлифованный ячмень.

Фиг.3 - диаграмма процесса ферментации при производстве ячменного шочу в присутствии жидкой коджи с использованием сырого ячменя.

Фиг.4 - диаграмма процесса ферментации при производстве рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием гречихи (Fagopyrum).

Фиг.5 - диаграмма процесса ферментации при производстве рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием Setaria (просо итальянское).

Фиг.6 - диаграмма процесса ферментации при производстве рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием проса японского.

Фиг.7 - диаграмма процесса ферментации при производстве рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием проса культурного.

Фиг.8 - диаграмма процесса ферментации при производстве рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием гаоляна.

Фиг.9 - диаграмма процесса ферментации при производстве шочу с использованием различных видов коджи.

Фиг.10 - диаграмма процесса ферментации при производстве шочу с использованием жидкой коджи, полученной из культуры плесени коджи в жидкой среде с использованием сои.

Фиг.11 - диаграмма процесса ферментации при производстве шочу с использованием жидкой коджи, полученной из культуры плесени коджи в жидкой среде с использованием красной фасоли.

Далее приводится конкретное описание изобретения.

Способ производства жидкой коджи по изобретению включает стадии культивирования плесени коджи в жидкой среде, приготовленной путем добавления описанного выше сырья, такого как зерновые, бобы, клубни и некоторые особые зерновые, и получения жидкой коджи в условиях повышенной ферментативной активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы. Другими словами, плесень коджи подвергают культивированию с использованием различного сырья. Осахаривание крахмалов в сырье занимает много времени, несмотря на подавление скорости выделения сахаридов в культуральную систему, что приводит к повышению ферментативной активности жидкой коджи. Кроме этого, глюкоамилаза и кислотоустойчивая -амилаза одновременно вырабатываются и накапливаются сбалансированным образом.

Согласно изобретению зерновые культуры, используемые в качестве сырья, могут включать ячмень, рис, пшеницу, гречиху, просо японское, просо итальянское, просо культурное, гаолян и кукурузу. Указанное сырье может использоваться в виде нешлифованных материалов или материалов с некоторой степенью шлифовки, равной или превосходящей степень наличия кожуры, остающейся на поверхности зерен. Так, например, в том случае, когда зерновая культура представляет собой ячмень, используют нешлифованный зерновой продукт со степенью шлифовки порядка 100%, либо, с учетом того, что степень шлифовки неполированных зерновых культур обозначается как 100%, используют такие материалы, которые имеют степень шлифовки, определяемую вычитанием степени, соответствующей наличию кожуры ячменя (обычно 7-8%) из коэффициента шлифовки нешлифованных зерновых культур, т.е. те материалы, которые имеют степень шлифовки 92-93%.

Используемый термин «коэффициент шлифовки» относится к количеству зерновых, остающихся после их шлифовки. Так, термин «коэффициент шлифовки 90%» означает, что 10% шелухи и т.п. на части поверхности зерновых культур удаляется сбриванием. Кроме этого, термин «сырой ячмень» включает материалы со степенью шлифовки 90% или более, в интервале от нешлифованного ячменя до шлифованного ячменя, с оболочкой, оставшейся на поверхности зерен. Термин «оболочка/пленка» относится к внешней части, которая покрывает поверхность частиц зернового материала.

Термин «нешлифованный рис», представляющий собой зерновую культуру, используемую в качестве сырья, с которого удалена только поверхностная оболочка, относится к рисовому растению, с которого удалены только чешуйки.

Кроме этого, согласно изобретению бобы и клубни, используемые в качестве сырья, могут включать сою, красную фасоль, или батат. Такое сырье подвергают лишь стадии вымывания почвы с кожуры, но не подвергают каким-либо процессам, включающим разрезание, дробление и т.п.

Согласно изобретению амарант, используемый в качестве сырья, представляет собой общий термин, относящийся к растениям, принадлежащим к виду Amaranthus семейства Amaranthaceae. Среди зерновых культур амарант имеет повышенное содержание белка и лизина, представляющего собой одну из аминокислот, количество которой равно аналогичному количеству сои. Кроме этого, амарант представляет собой диетическую зерновую культуру, содержащую большие количества кальция, железа и волокон по сравнению со шлифованным рисом. Страны, в которых произрастает такое растение, охватывают Южно/Центральноамериканские страны, Индию, Гималаи и Непал. Киноа представляет собой однолетнее растение семейства Agatha, которое в основном культивируется в горных местностях, например, в Андах, находящихся в северной части Перу и в Западной части Боливии. Киноа богата минералами, витаминами, белками и диетическими волокнами.

Амарант и киноа могут использоваться независимо или совместно друг с другом. Такое сырье может непосредственно использоваться для приготовления жидкой среды без таких предварительных воздействий, как измельчение или дробление.

Указанное выше сырье смешивают с водой с получением жидкой среды. Соотношение компонентов сырья может выбираться таким образом, чтобы оно соответствовало селективной выработке глюкоамилазы и кислотоустойчивой -амилазы и их накоплению в ходе культивирования плесени коджи с целью получения жидкой среды.

В случае использования ячменя в качестве сырья жидкую среду получают добавлением 1-20% (вес./об.) сырого ячменя в воду. В том случае, когда более предпочтительно использование нешлифованного ячменя в качестве сырого ячменя, готовят жидкую среду добавлением 8-10% (вес./об.) сырого ячменя. В том случае, когда в качестве сырья используют отшлифованный на 95% сырой ячмень, более предпочтительно готовить жидкую среду добавлением 1-4% (вес./об.) сырья.

При использовании в качестве сырья нешлифованного риса, с которого удалена оболочка, жидкую среду получают добавлением 1-20% (вес./об.), предпочтительно, 5-13% (вес./об.), более предпочтительно, 8-10% (вес./об.) нешлифованного риса в объем воды.

При использовании в качестве сырья бобов, жидкую среду готовят добавлением 1-10% (вес./об.) бобов, предпочтительно с добавлением 8-10% (вес./об.) сои или 1-2% (вес./об.) красной фасоли в объем воды. В том случае, когда в качестве сырья используют клубни, жидкую среду получают добавлением 1-10% (вес./об.) клубней в объем воды.

При использовании в качестве сырья амаранта жидкую среду готовят добавлением в объем воды 1,5-15% (вес./об.), предпочтительно, 2-10 (вес./об.), более предпочтительно, 2-8% (вес./об.) амаранта. При использовании в качестве сырья киноа жидкую среду готовят добавлением 1,5-7% (вес./об.), предпочтительно, 2-6% (вес./об.), более предпочтительно, 2-4% (вес./об.) киноа в объем воды.

Таким образом, могут быть выбраны количества подлежащих смешиванию компонентов сырья, которые наиболее подходят для смешивания в зависимости от степени шлифовки используемого сырья, разновидности используемой плесени коджи, типа сырья и т.п.

Плесень коджи культивируют в жидкой среде, дополненной соответствующими количествами указанных выше компонентов сырья с целью выработки сбалансированных значительных количеств ферментов, глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы, с получением жидкой коджи, обладающей ферментативной активностью, достаточной для варки шочу. В том случае, когда количество сырья превышает верхний предел, вязкость культуральной среды увеличивается, и подача кислорода или воздуха, требующегося для аэробного культивирования плесени коджи, становится недостаточным. Этот вариант не является предпочтительным из-за затруднений, возникающих в ходе культивирования, связанных с уменьшением содержания кислорода в ферментированном продукте. С другой стороны, когда количество используемого сырья не соответствует нижнему пределу, целевые ферменты не могут быть получены с высокими выходами.

Крахмалы, входящие в состав сырья, могут желатинироваться до культивирования. Может использоваться метод желатинирования крахмалов, который конкретно не ограничивается традиционными способами, включающими обработку паром или обжаривание. На стадии стерилизации жидкой среды, описанной ниже, крахмалы нагревают до температуры желатинирования или выше при стерилизации при высоких температурах и давлениях, в результате такой обработки может одновременно происходить желатинирование крахмалов.

В жидкую среду помимо описанного выше сырья предпочтительно добавлять органическое вещество, неорганическую соль и т.п. в качестве питательного вещества. Природа таких добавок не ограничивается конкретным веществом в том случае, если такие материалы традиционно используют для культивирования плесени коджи. Примеры органических веществ включают рисовые отруби, пшеничные отруби, кукурузный экстракт, соевый жмых и обезжиренную сою. Примеры неорганической соли включают такие водорастворимые материалы, как соль аммония, нитрат, калиевые соли, кислый фосфат, соль кальция и соль магния. Одно или несколько органических производных и/или неорганических солей могут использоваться одновременно. Добавляемые количества конкретно не ограничиваются в том случае, если они облегчают рост плесени коджи. Количество добавляемого органического соединения предпочтительно составляет 0,1-5% (вес./об.), а предпочтительное количество неорганической соли составляет 0,1-1% (вес./об.). Полученная таким образом жидкая среда для плесени коджи при необходимости может подвергаться стерилизации, причем способ такой обработки не имеет конкретных ограничений. Такая обработка может представлять собой стерилизацию при высоких температурах и давлениях и может проводиться в течение 15 минут при 121°С.

Стерилизованную среду охлаждают до температуры культивирования и затем в жидкую среду инокулируют плесень коджи. Плесень коджи, используемая в изобретении, представляет собой материал, способный продуцировать гликолитический фермент, предпочтительно способный продуцировать глюкоамилазу и кислотостойкую -амилазу, и примерами такого материала могут служить плесени белой коджи типа Aspergillus kawachii; плесени черной коджи типа Aspergillus awamori и Aspergillus niger; а также плесени желтой коджи типа Aspergillus oryzae и Aspergillus sojae. Плесень коджи, инокулированная в среду, имеет произвольную конформацию. Могут использоваться ее споры или мицелий.

Такие плесени коджи могут использоваться в виде отдельных штаммов или смешанной культуры с двумя или несколькими гомологическими или гетерогенными штаммами. Можно использовать споры или мицелий, полученный в предкультуре. Однако предпочтительно использовать мицелий из-за меньшего времени, требующегося для его логарифмического роста. Количество плесени коджи, инокулированное в жидкую среду, конкретно не ограничивается, однако, количество спор может составлять 1х10 ⁴-1х10⁶ на мл жидкой среды. Мицелий предпочтительно инокулировать в количестве 0,1-10% в расчете на мл жидкой среды.

Предпочтительная температура культивирования плесени коджи составляет 25-45°С, более предпочтительно, 30-40°С, однако ее значение не имеет конкретных ограничений, если температура не оказывает отрицательного влияния на рост. При слишком низкой температуре культуральная среда проявляет тенденцию к загрязнению инфекционными микробами, что связано с медленным ростом плесени коджи. Предпочтительное время культивирования составляет 24-72 часа. Могут использоваться устройства для культивирования, в которых можно проводить культивирование в жидкой фазе. Однако в случае плесени коджи необходимо проводить аэробное культивирование. Так, культивирование следует проводить в аэробных условиях, при подаче кислорода или воздуха в среду. Кроме этого, предпочтительно перемешивать среду с целью однородного распределения кислорода и плесени коджи. Условия перемешивания и степень аэрации могут быть любыми, при условии обеспечения аэробной культуральной среды, и могут выбираться в соответствии с типом культивационного устройства, вязкостью среды и т.п.

Проведение культивирования вышеописанным способом обеспечивает одновременную сбалансированную генерацию ферментов, глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы, в результате чего получают жидкую коджи, обладающую ферментативной активностью, которая может использоваться для варки шочу. Кроме этого, жидкая коджи, полученная описанным способом культивирования, может представлять собой культуральную среду, полученную в результате центрифугического разделения продукта культивирования, его концентрата, высушенного продукта и т.п., а также сам продукт культивирования.

Жидкая коджи и т.п., полученная способом согласно изобретению, может использоваться для производства алкогольных напитков, ферментированных пищевых продуктов и напитков. Так, например, при производстве саке жидкая коджи и т.п. может использоваться вместо твердой коджи на стадии получения дрожжевого сусла или любого другого сусла. В случае получения шочу жидкая коджи и т.п. может использоваться вместо твердой коджи на стадии получения сусла. При получении соевого соуса жидкая коджи и т.п. может использоваться вместо твердой коджи на стадии пиллинга. При производстве miso жидкая коджи и т.п. может использоваться вместо твердой коджи на стадии смешивания. В случае получения сладкого саке жидкая коджи и т.п. может использоваться вместо твердой коджи на стадии приготовления дрожжевого сусла или любого другого сусла.

Кроме этого, в том случае, когда культуральную среду или ее концентрат, полученный из жидкой коджи или продукта культивирования, используют для получения алкогольных напитков или ферментированных пищевых продуктов или напитков, все стадии процесса могут проводиться в жидкой фазе. В качестве способа получения алкогольных напитков, в котором все стадии проводятся в жидкой фазе, например, при производстве шочу, кукуруза, пшеница, рис, картофель, сахарный тростник и т.п. используются в качестве сырья и затем нагреваются до 80°С с целью ожижения в результате растворения в присутствии термостойкого ферментного препарата. Далее, в результате добавления упомянутой жидкой коджи и дрожжей сусло может подвергаться процессу сбраживания спирта и последующей дистилляции в соответствии со способом дистилляции при атмосферном или пониженном давлении и т.п.

Хотя далее настоящее изобретение подробно описывается со ссылкой на примеры и т.д., изобретение не ограничивается представленными примерами.

<Экспериментальный пример 1> [Исследование, касающееся количества сырого ячменя, используемого при производстве жидкой коджи]

Количества сырого ячменя, используемого в качестве сырья, изменяли, как показано в Таблице 1, и получали 5 жидких сред. В каждой из полученных жидких сред проводили культивирование плесени коджи с получением жидкой коджи.

Вначале получали 5 жидких сред путем добавления сырого ячменя в воду, содержащую 0,2% (вес./об.) нитрата калия и 0,3% (вес./об.) первичного кислого фосфата калия, в результате чего количества сырого ячменя составляли 1, 2, 4, 8 и 10% (вес./об.). Поле получения каждой из жидких сред 100 мл полученного материала помещали в колбу с дефлектором емкостью 500 мл и подвергали автоклавной обработке, после чего инокулировали заблаговременно культивированную в жидкой среде белую плесень коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308), причем ее количество составляло 1% (об./об.) в расчете на жидкую среду. В некоторых случаях, в качестве сырого ячменя использовали полученный в домашних условиях и нешлифованный ячмень двухрядный.

Далее проводили 48-часовое культивирование при температуре 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин. После завершения культивирования, в каждом из продуктов культивирования измеряли количества продуцированной глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы. Количества глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы, продуцированные из продуктов культивирования, полученных при культивировании жидкой среды, в зависимости от количества сырого ячменя, представлены в Таблице 1 и на фигуре 1. В некоторых случаях для измерения ферментативной активности глюкоамилазы использовали набор для количественного определения способности к осахариванию (Kikkoman, Japan). При измерении ферментативной активности кислотостойкой -амилазы использовали несколько модифицированный метод, описанный в документе 3, согласно которому кислотонеустойчивую -амилазу инактивировали кислотной обработкой продукта культивирования, после чего набор для определения -амилазы (выпускаемый Kikkoman, Japan) использовали для измерения кислотостойкой -амилазы. При этом 1 мл культурального раствора дополняли 9 мл 100 мМ уксуснокислого буфера (рН 3) и подвергали кислотной обработке в течение 1 часа при 37°С, после чего проводили измерение с использованием набора для измерения количества -амилазы (выпускаемого Kikkoman, Japan).

В контрольной группе в качестве сырья использовали ячмень, в котором полученный в домашних условиях двухрядный ячмень шлифовали таким образом, что степень шлифовки составляла до 70% (далее, на такой материал ссылаются, как на шлифованный ячмень). Жидкую среду получали тем же способом, что и в экспериментальной группе, и культивирование проводили при аналогичных условиях. После завершения культивирования в каждом из полученных продуктов аналогичным образом измеряли количества продуцированной глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы. Зависимость количеств глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы, продуцированных из продуктов культивирования в жидкой среде от количеств шлифованного ячменя, представлена в Таблице 1 и на фигуре 2.

Таблица 1

Количество используемого сырья и полученного фермента

Экспериментальная группа	Контрольная группа
Количество используемого сырого ячменя	GA (ед/мл)	ASAA (ед/мл)	Количество используемого шлифованного ячменя	GA (ед/мл	ASAA (ед/мл)
1%	72,4	3,1	1%	58,8	1,2
2%	101,8	4,5	2%	102,6	3,4
4%	127,1	7,3	4%	66,2	4,2
8%	187,6	12,0	8%	17,5	11,2
10%	217,3	14,0	10%	10,3	10,7
16%	201,5	12,3	16%	10,0	9,7
20%	185,3	10,5	20%	8,8	8,9

*GA: глюкоамилаза

ASAA: кислотостойкая -амилаза

Данные, представленные в Таблице 1 и на фигуре 1, показывают, что при культивировании сырого ячменя наблюдается одновременное увеличение количеств продуцированных ферментов глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы при увеличении количества используемого сырого ячменя, причем количества полученных ферментов резко повышаются по сравнению с соответствующими количествами в контрольной группе, полученными с использованием шлифованного ячменя. В жидкой среде, дополненной 10% (вес./об.) сырого ячменя, продуцируется 217,3 ед/мл глюкоамилазы и 14,0 ед/мл кислотостойкой -амилазы, и одновременно обеспечиваются достаточные ферментативные активности для использования при варке шочу (для справки следует отметить, что значения ферментативной активности глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы, требующиеся для производства шочу, составляют 100 ед/мл или выше для глюкоамилазы и 10 ед/мл или выше для кислотостойкой -амилазы).

Хотя в случае контрольной группы, в которой использовали шлифованный ячмень, активность глюкоамилазы имеет максимальное значение в жидкой среде, дополненной 2% (вес./об.) шлифованного ячменя, а активность кислотостойкой -амилазы имеет максимальное значение в жидкой среде, дополненной 8% (вес./об.) шлифованного ячменя, не происходит одновременного образования обоих ферментов с высокими выходами, как это следует из Таблицы 1 и фигуры 2.

Как отмечалось выше, плесень коджи культивируют в жидкой среде, дополненной 1-20% (вес./об.) сырого ячменя, с целью одновременного сбалансированного получения глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы с высокими выходами. Добавление 8-10% (вес./об.) сырого ячменя (нешлифованного) приводит к получению жидкой коджи, обладающей достаточной ферментативной активностью для использования при варке шочу.

В результате культивирования плесени коджи в жидкой среде с использованием сырого ячменя одновременно обеспечиваются высокие выходы глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы. Вероятно это происходит в результате использования в качестве сырья сырого ячменя, поверхность которого покрыта оболочкой, вследствие чего снижается степень выделения сахарида, такого как глюкоза, образующегося из крахмала в сырье за счет наличия оболочки, что обеспечивает проведение культивирования при относительно низкой концентрации сахарида в культуре, вследствие чего возрастает вероятность образования ферментов, таких как глюкоамилаза и кислотостойкая -амилаза.

<Пример 1> [Получение жидкой коджи с использованием сырого ячменя]

Вначале получали жидкую среду добавлением сырого ячменя в воду, дополненную 0,2% (вес./об.) нитрата калия и 0,3% (вес./об.) первичного кислого фосфата калия, при этом количество сырого ячменя составляло 10% (вес./об.). После получения каждой из жидких сред 100 мл материала помещали в колбу с дефлектором емкостью 500 мл и проводили автоклавную обработку, после чего инокулировали заблаговременно культивированную в жидкой среде белую плесень коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308), причем ее количество составляло 1% (об./об.) в расчете на жидкую среду. В некоторых случаях в качестве сырого ячменя использовали полученный в домашних условиях и нешлифованный двухрядный ячмень.

Далее проводили 48-часовое культивирование при температуре 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин. После завершения культивирования в каждом из продуктов культивирования измеряли количества продуцированной глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы, составляющие 217,3 ед/мл глюкоамилазы и 14,0 ед/мл кислотостойкой -амилазы, при этом одновременно обеспечивались достаточные ферментативные активности для использования в варке шочу.

<Пример 2> [Получение ячменного шочу в присутствии жидкой коджи с использованием сырого ячменя]

Жидкую коджи (продукт культивирования с усиленной глюкоамилазной и кислотостойкой -амилазной активностями), полученную в результате культивирования жидкой среды, приготовленной добавлением 10% (вес./об.) сырого ячменя в Примере 1, использовали для получения шочу.

Так, например, использовали 500 мл жидкой коджи, полученной культивированием в жидкой среде, приготовленной добавлением 10% (вес./об.) сырого ячменя согласно Примеру 1 и 1328,6 г целого ячменя, смешанного в соответствие с комбинациями, представленными в Таблице 2. Температуру ферментации поддерживали равной 25°С и проводили трехстадийное смешивание, причем первичное, вторичное и третичное смешивание проводили на 5, 2 и 13 день, соответственно. В некоторых случаях в качестве дополнительного ячменя использовали выращенный в домашних условиях двухрядный ячмень, отшлифованный на 70%, который промывали водой с последующим 60-минутным погружением, 30-минутным дренажем и 35-минутной обработкой паром. Поскольку количество ячменя (50,0 г), полученное из жидкой коджи, недостаточно для ферментации на стадии первичного смешивания, дополнительно добавляли 262,9 г ячменя для обеспечения того же количества ячменя, которое присутствует при смешивании с использованием твердой коджи. В качестве дрожжей использовали дрожжи шочу (Kagoshima yeast), причем в систему добавляли 50 мкл шочу дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

Таблица 2
	Экспериментальная группа (ячменная жидкая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из ячменя (г)	50,0	-	-	50,0
Дополнительный ячмень (г)	262,9	507,9	507,9	1278,6
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
Вода для сусла (мл)	321,4	765,7	272,9	1360,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4

С целью контролирования смешивания (смешивание в присутствии твердой коджи) ячменную твердую коджи использовали для получения шочу в соответствии с комбинациями смешивания, представленными в Таблице 3. В способе получения твердой коджи использовали ячмень, отшлифованный на 70%, который промывали, вымачивали 40 минут, подвергали дренажу в течение 30 минут и воздействию пара в течение 40 минут. Затем полученный ячмень охлаждали до 40°С, и 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного ячменя инокулировали и культивировали при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов. Условия ферментации и т.п. были аналогичными используемым в описанном выше процессе смешивания согласно изобретению (смешивание в присутствии жидкой коджи).

Таблица 3
	Экспериментальная группа (ячменная твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из ячменя (г)	312,9	-	-	312,9
Дополнительный ячмень (г)	-	507,9	507,9	1015,7
Вода для сусла (мл)	500,0	765,7	594,3	1860,0

Ход ферментации изображен на фигуре 3 в сравнении с ферментацией сусла в присутствии твердой коджи в качестве контроля. Как следует из данных, представленных на фигуре 3, смешивание с использованием жидкой коджи демонстрирует ход ферментации, который аналогичен процессу контрольного смешивания (mashing) с использованием твердой коджи. Концентрация спирта в окончательном сусле имела аналогичное значение, т.е. 17,8%, в случае смешивания в присутствии как жидкой, так и твердой коджи.

После этого 8 экспертов проводили органолептическую оценку (оценка в масштабе от 1 до 5; 1: хорошая, 5: плохая) шочу, полученного дистилляцией сусла, полученного при пониженном давлении, который разбавляли водой до концентрации спирта 25%. Средние оценки представлены в Таблице 4.

Таблица 4

Органолептическая оценка шочу (содержание спирта: 25%)

	Оценка
Смешивание согласно изобретению (смешивание с жидкой коджи)	3,0
Контрольное смешивание (смешивание с твердой коджи)	3,0

Качество двух указанных образцов шочу почти не отличалось друг от друга, и было подтверждено, что использование жидкой коджи также обеспечивает получение шочу того же качества, что и с использованием твердой коджи.

Как следует из представленных результатов, согласно изобретению плесень коджи культивируют в жидкой среде, дополненной 1-20% (вес./об.) сырого ячменя с одновременным сбалансированным продуцированием глюкоамилазы и кислотостойкой -амилазы. Добавление 8-10% (вес./об.) сырого ячменя (нешлифованного) приводило к получению жидкой коджи при одновременном обеспечении достаточных ферментативных активностей для использования в варке шочу. Использование жидкой коджи приводит к получению шочу того же качества, что и качество шочу, полученного с использованием твердой коджи. Кроме этого, жидкая коджи с высокой глюкоамилазной и кислотостойкой -амилазной активностями может быть получена в простой жидкой среде без использования специальной аппаратуры для культивирования и строго контроля культивирования с помощью специальных культивационно-инженерных подходов. Более того, в результате облегчения проведения строгого контроля продуцирования коджи в жидкой среде по сравнению с твердой культурой становится возможным стабильное получение высококачественной коджи. Кроме этого, ожижение коджи позволяет не только упростить контроль ферментации разжижением сусла, но также уменьшить трудовые затраты и повысить эффективность процесса получения коджи и, в результате, сократить трудоемкость и повысить эффективность процесса получения шочу.

<Пример 3> [Получение рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием гречихи]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ производства жидкой коджи

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

(2) Способ основного культивирования: 40 г гречихи, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С с получением жидкой коджи гречихи. Ферментативная активность жидкой коджи к этому моменту составляла 112,4 ед/мл для GA и 10,4 ед/мл для ASAA.

3. Способ получения рисовой шочу

(1) Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 5 и 6. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. Использовали две экспериментальные группы: 1) сусло с твердой коджи и 2) сусло с жидкой коджи гречихи. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 5
	Экспериментальная группа (жидкая коджи гречихи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из гречихи (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	0,0	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4

Таблица 6
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительный рис (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

Ход ферментации отображен на фигуре 4 в сравнении с процессом смешивания с твердой коджи в качестве контроля. Как следует из данных, представленных на фигуре 4, смешивание с использованием жидкой коджи гречихи обеспечивает ход ферментации, аналогичный процессу контрольного смешивания с использованием твердой коджи. Кроме того, концентрация спирта в полученных суслах (mash) имела практически одинаковое значение, 19,1% и 18,9%, для группы сусел с твердой коджи и группы сусел с жидкой коджи гречихи, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией при низком давлении образцов сусла шочу, полученных из группы сусел с твердой коджи и группы с жидкой коджи гречихи, не было установлено значительного отличия между группой, в которой использовали твердую коджи, и группой, в которой использовали жидкую коджи гречихи. Полученный результат показывает, что при использовании жидкой коджи гречихи также может быть получено шочу достаточно хорошего качества. Кроме этого, как следует из данных Таблицы 7, группа жидкой коджи гречихи отмечена, как имеющая «вкус гречихи», и, таким образом, использование жидкой коджи гречихи может привнести аромат «гречихи» в рисовый шочу.

Таблица 7
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Прекрасные характеристики
Жидкая коджи из гречихи	2,8	Прозрачная, вкус гречихи

<Пример 4> [Получение рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием проса итальянского]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (плесень белая коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶ /мл в предкультивированную среду и культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

(2) Способ основного культивирования: 40 г проса итальянского, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С с получением жидкой коджи из итальянского проса. Ферментативная активность жидкой коджи к этому моменту составляла 101,3 ед/мл для GA и 11,0 ед/мл для ASAA.

3. Способ получения рисового шочу

(1) Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 8 и 9. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. Использовали две экспериментальные группы: 1) смешанную с твердой коджи и 2) смешанную с жидкой коджи проса итальянского. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 8
	Экспериментальная группа (жидкая коджи проса итальянского)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из итальянского проса (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4
Таблица 9
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительный рис (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

Ход ферментации отображен на фигуре 5 в сравнении с процессом смешивания с твердой коджи в качестве контроля. Как следует из данных, представленных на фигуре 5, смешивание с использованием жидкой коджи проса итальянского обеспечивает ход ферментации, аналогичный процессу контрольного смешивания с использованием твердой коджи. Кроме того, концентрация спирта в полученных суслах (mash) имела практически одинаковое значение, 19,1%, для группы сусел с твердой коджи и группы сусел с жидкой коджи проса итальянского, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией при низком давлении образцов сусла шочу, полученных из группы сусел с твердой коджи и группы с жидкой коджи проса итальянского, не было установлено значительного отличия между группой, в которой использовали твердую коджи, и группой, в которой использовали жидкую коджи проса итальянского. Полученный результат показывает, что при использовании жидкой коджи проса итальянского также может быть получен шочу достаточно хорошего качества. Кроме этого, как следует из данных Таблицы 10, группа жидкой коджи проса итальянского отмечена, как имеющая «отчетливый вкус», и на основании этого предполагается возможность получения рисового шочу, качество которого отличается от качества продукта, полученного при использовании традиционного способа получения твердой коджи.

Таблица 10
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Высокое качество
Жидкая коджи из проса итальянского	3,0	Отчетливый вкус

<Пример 5> [Получение рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием проса японского]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶ /мл в предкультивированную среду и культивировали в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 40 г проса японского, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин с получением жидкой коджи из японского проса. Ферментативная активность жидкой коджи к этому моменту составляла 113,0 ед/мл для GA и 10,2 ед/мл для ASAA.

3. Способ получения рисового шочу

(1) Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 11 и 12. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. Использовали две экспериментальные группы: 1) сусло твердой коджи и 2) сусло жидкой коджи с просом японским. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества целого риса. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статично культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, непрерывный процесс

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 11
	Экспериментальная группа (жидкая коджи проса японского)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из японского проса (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4
Таблица 12
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительный рис (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

Ход ферментации изображен на фигуре 6 в сравнении с процессом смешивания с твердой коджи в качестве контроля. Как следует из данных, представленных на фигуре 6, смешивание с использованием жидкой коджи японского проса обеспечивает ход ферментации, аналогичный процессу контрольного смешивания с использованием твердой коджи. Кроме того, концентрация спирта в полученных суслах (mash) имела практически одинаковое значение, 19,1% и 18,8%, для группы сусел с твердой коджи и группы сусел с жидкой коджи японского проса, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией сусла шочу, полученного из группы сусел с твердой коджи и группы с жидкой коджи японского проса, не было установлено значительного отличия между группой, в которой использовали твердую коджи, и группой сусел, в которой использовали жидкую коджи японского проса. Полученный результат показывает, что при использовании жидкой коджи японского проса также может быть получен шочу достаточно хорошего качества. Кроме этого, как следует из данных Таблицы 13, группа жидкой коджи японского проса отмечена, как имеющая «прозрачный вкус» (clear tastes), что предполагает возможность производства рисового шочу, качество которого отличается от качества продукта при традиционном получении твердой коджи.

Таблица 13
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Высокое качество
Жидкая коджи из проса японского	3,0	Отчетливый вкус

<Пример 6> [Продукция рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием традиционного проса]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶ /мл в предкультивированную среду и культивировали в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 40 г стандартного проса, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин с получением жидкой коджи из проса. Ферментативная активность жидкой коджи к этому моменту составляла 90,3 ед/мл для GA и 8,5 ед/мл для ASAA.

3. Способ получения рисового шочу

(1) Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 14 и 15. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. Использовали две экспериментальные группы: 1) сусло твердой коджи и 2) сусло жидкой коджи и проса. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 14
	Экспериментальная группа (жидкая коджи проса)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из проса культурного (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4
Таблица 15
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительный рис (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

Ход ферментации изображен на фигуре 7 в сравнении с процессом смешивания с твердой коджи в качестве контроля. Как следует из данных, представленных на фигуре 7, смешивание с использованием жидкой коджи проса обеспечивает ход ферментации, аналогичный процессу контрольного смешивания с использованием твердой коджи. Кроме того, концентрация спирта в полученных суслах (mash) имела практически одинаковое значение, 19,1% и 18,8%, для группы сусел с твердой коджи и группы сусел с жидкой коджи проса культурного, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией сусла шочу, полученного из группы сусел с твердой коджи, и группы с жидкой коджи проса при дистилляции при пониженном давлении, не было обнаружено значительного отличия между группой, в которой использовали твердую коджи, и группой сусел, в которой использовали жидкую коджи проса. Полученный результат показывает, что при использовании жидкой коджи проса также может быть получен шочу достаточно хорошего качества. Кроме этого, как следует из данных Таблицы 16, группа жидкой коджи проса отмечена, как имеющая «мягкий и сладковатый вкус», что предполагает возможность производства рисового шочу, качество которого отличается от качества традиционного продукта из твердой коджи.

Таблица 16
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Высокое качество
Жидкая коджи из проса японского	2,9	Сладкий, мягкий вкус

<Пример 7> [Получение рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием гаоляна]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белую плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 40 г гаоляна, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин с получением жидкой коджи гаоляна. Ферментативная активность жидкой коджи к этому моменту составляла 111,2 ед/мл для GA и 10,5 ед/мл для ASAA.

3. Способ получения рисового шочу

(1) Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 17 и 18. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. Использовали две экспериментальные группы: 1) сусло твердой коджи и 2) сусло жидкой коджи и гаоляна. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 17
	Экспериментальная группа (жидкая коджи гаоляна)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из гаоляна (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4

Таблица 18
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительный рис (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

Ход ферментации изображен на фигуре 8 в сравнении с процессом смешивания с твердой коджи в качестве контроля. Как следует из данных, представленных на фигуре 8, смешивание с использованием жидкой коджи гаоляна обеспечивает ход ферментации, практически аналогичный процессу контрольного смешивания с использованием твердой коджи. Кроме того, концентрация спирта в полученных суслах (mash) имела практически одинаковое значение, 19,1%, для группы сусел с твердой коджи и группы сусел с жидкой коджи гаоляна, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного из группы сусел с твердой коджи и группы с жидкой коджи гаоляна, в условиях дистилляции при пониженном давлении, не было установлено значительного отличия между группой, в которой использовали твердую коджи, и группой сусел, в которой использовали жидкую коджи гаоляна. Полученный результат показывает, что при использовании жидкой коджи гаоляна также может быть получен шочу достаточно хорошего качества. Кроме этого, как следует из данных Таблицы 19, группа жидкой коджи гаоляна отмечена, как имеющая «хлебный, сладковатый вкус», что предполагает возможность производства рисового шочу, отличающегося от традиционных способов получения твердой коджи.

Таблица 19
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Высокое качество
Жидкая коджи из гаоляна	3,0	Хлебный, сладковатый вкус

<Пример 8> [Получение жидкой коджи с использованием кукурузы]

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶ /мл в предкультивированную среду и культивировали в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 1-8 г кукурузы, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин. Количество ферментов, генерированное в супернатанте культуры после культивирования, т.е. активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA), измеряли способом, описанным в Примере 1. Полученные результаты представлены в Таблице 20.

Как следует из данных, представленных в Таблице 20, в экспериментальной группе, в которой использовали 4% или более кукурузы, наблюдалось образование 100 ед/мл глюкоамилазы, целевое значение ферментативной активности, требующейся для варки шочу. С другой стороны, целевое значение количества кислотостойкой -амилазы составляет 10 ед/мл. Установлено, что количество продуцированного фермента повышается с увеличением количества используемой кукурузы, даже в том случае, если оно не достигает заданного значения.

Как отмечалось выше в настоящем исследовании, активность ASAA не достигает значения ее целевой активности. Однако показана возможность одновременного производства фермента GA и фермента ASAA. Поэтому имеется возможность повышения производства фермента до уровня целевого значения в результате оптимизации условий культивирования. Кроме этого, при смешивании шочу с использованием 8% жидкой коджи кукурузы можно полагать, что получение шочу достаточно вероятно, если использовать количество коджи, большее, чем в обычной рецептуре.

Таблица 20
Количество используемой кукурузы	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	61,9	1,4
2%	66,4	1,7
4%	135,7	3,8
8%	114,2	4,2

<Пример 9> [Получение жидкой коджи из сырого ячменя]

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 65% ячменя и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени черной коджи (Aspergillus awamori IFO 4388) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и проводили культивирование в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 1-8 г сырого ячменя (отшлифованный на 95% ячмень), 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин. Количество ферментов, генерированное в супернатанте культуры после культивирования, т.е. активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA), измеряли способом, описанным в Примере 1. Полученные результаты представлены в Таблице 21.

Как следует из данных, приведенных в Таблице 21, в экспериментальной группе, в которой использовали 4% сырого ячменя, наблюдалось образование 100 ед/мл глюкоамилазы и 10 ед/мл кислотостойкой -амилазы, т.е. целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу. Поэтому, даже при использовании плесени черной коджи, проявлялись те же эффекты производства энзимов с высоким выходом, что и в случае использования плесени белой коджи.

Таблица 21
Количество используемого сырого ячменя	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	27,9	2,6
2%	41,5	2,0
4%	136,5	10,0
8%	7,1	0,1

<Пример 10> [Получение жидкой коджи с использованием нешлифованного риса (рис с чешуей)]

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса (пищевой рис) и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 1-8 г сырого нешлифованного риса (рис с оболочкой), 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. Используемый нешлифованный рис представляет собой зерновую культуру с шелухой (оболочкой) без обмолота. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С. Количество ферментов, генерированное в супернатанте культуры после культивирования, т.е. активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA), измеряли способом, описанным в Примере 1. Полученные результаты представлены в Таблице 22.

Как следует из данных, приведенных в Таблице 22, в экспериментальной группе, в которой использовали 4% нешлифованного риса, наблюдалось образование 100 ед/мл глюкоамилазы и 10 ед/мл кислотостойкой -амилазы, т.е. целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу. Поэтому, даже при использовании риса с шелухой (оболочками), проявлялись те же эффекты производства ферментов с высоким выходом, что и в случае использования сырого ячменя.

Таблица 22
Количество используемого нешлифованного риса (рис с шелухой)	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	29,2	0,8
2%	39,3	1,8
4%	140,4	11,5
8%	89,0	5,2

<Пример 11> [Получение жидкой коджи с использованием нешлифованного риса (рис с чешуей)]

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса (пищевой рис) и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени черной коджи (Aspergillus awamori IFO 4388) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали в течение 24 часов при 37°С со скоростью перемешивания 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования: 1-8 г сырого нешлифованного риса (рис с оболочкой), 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. Используемый нешлифованный рис представляет собой зерновую культуру с шелухой (оболочкой) без обмолота. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С. Количество ферментов, генерированное в супернатанте культуры после культивирования, т.е. активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA), измеряли способом, описанным в Примере 1. Полученные результаты представлены в Таблице 23.

Как следует из данных, приведенных в Таблице 23, в экспериментальной группе, в которой использовали 8% нешлифованного риса, наблюдалось образование 100 ед/мл глюкоамилазы и 10 ед/мл кислотостойкой -амилазы, т.е. целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу. Поэтому, даже при использовании риса с шелухой (оболочками) и плесени черной коджи, проявлялись те же эффекты высокопроизводительного производства ферментов.

Таблица 23
Количество используемого нешлифованного риса (рис с шелухой)	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	14,3	1,4
2%	19,3	1,4
4%	40,3	3,9
8%	100,0	10,5

<Пример 12> [Получение жидкой коджи с использованием нешлифованного риса без оболочки]

(1) Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

(2) Способ основного культивирования: 1-10 г сырого нешлифованного риса без оболочки, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С.

В качестве контрольной группы 1-10 г шлифованного на 90% риса, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С.

После завершения культивирования измеряли активность глюкоамилазы (GA) и кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте каждой культуры. В некоторых случаях для измерения ферментативной активности глюкоамилазы (GA) использовали набор для фракционной квантификации способности к осахариванию (производимый Kikkoman, Japan). Для измерения ферментативной активности кислотостойкой -амилазы (ASAA) использовали несколько модифицированный способ, описанный в документе 3, согласно которому кислотонеустойчивую -амилазу дезактивировали обработкой продукта культивирования кислотой и затем для определения кислотостойкой -амилазы использовали набор для определения -амилазы (производимый Kikkoman, Japan). В этом случае 1 мл культурального раствора дополняли 9 мл 100 мМ уксусно-кислого буфера (рН 3) и подвергали кислотной обработке при 37°С в течение 1, часа после чего проводили измерение с помощью набора для измерения -амилазы (производимого Kikkoman, Japan).

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 24. В описанном выше исследовании 100 ед/мл глюкоамилазы и 10 ед/мл кислотостойкой -амилазы являются достаточными количествами для проявления ферментативной активности, требующейся для варки шочу. В то же время, при использовании шлифованного риса в контрольной группе, количества GA и ASAA не превышали целевых значений. Однако при использовании нешлифованного риса в экспериментальной группе, наблюдалось сбалансированное образование GA и ASAA. В частности, использование 8% или более нешлифованного риса обеспечивало целевой уровень ферментативной активности. В результате показано, что нешлифованный рис более подходит в качестве сырья для жидкой коджи, чем шлифованный рис.

Таблица 24
Экспериментальная группа	Контрольная группа
Количество нешлифованного риса	Ферментативная активность (ед/мл)	Количество нешлифованного риса	Ферментативная активность (ед/мл)
	GA	ASAA		GA	ASAA
1%	52,9	2,6	1%	19,8	1,1
2%	64,0	4,0	2%	31,9	2,0
4%	101,8	9,3	4%	51,3	4,3
8%	112,7	15,6	8%	56,5	10,3
10%	136,2	18,7	10%	52,1	11,2

<Пример 13> [Получение шочу в присутствии жидкой коджи с использованием нешлифованного риса без оболочки]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

(1) Способ предварительного культивирования:

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

(2) Способ основного культивирования: 40 г нешлифованного риса без оболочки, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С.

В качестве контрольной группы 40 г шлифованного на 90% риса, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С с целью получения рисовой жидкой коджи.

3. Способ получения рисового шочу

(1) Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 25 и 27. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. В состав экспериментальных групп (экспериментальная и контрольная группы) входили три экспериментальные группы, включающие 1) сусло с твердой коджи, 2) сусло с жидкой коджи нешлифованного риса и 3) сусло с жидкой рисовой коджи. Во всех экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 25
	Экспериментальная группа (жидкая коджи нешлифованного риса)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	271,3	507,6	507,6	1286,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4

Таблица 26
	Контрольная группа (1) (жидкая коджи шлифованного риса)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	271,3	507,6	507,6	1286,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4
Таблица 27
	Контрольная группа (2) (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительное количество риса (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

4. Результаты и обсуждение

Ход процесса ферментации изображен на фигуре 9. Как следует из представленных данных, группа сусел, в которой присутствует твердая коджи, и группа сусел с жидкой коджи нешлифованного риса демонстрируют практически одинаковый ход ферментации. Однако процесс ферментации группы сусел с участием шлифованного риса развивается хуже. Кроме того, концентрация спирта в полученных суслах (mash) имела практически одинаковое значение, 19,1% для группы сусел с твердой коджи и 18,9% для группы сусел с жидкой коджи нешлифованного риса, соответственно. В отличие от этого концентрация спирта в конечных суслах группы с жидкой коджи риса составила 12,5%, что значительно ниже указанных выше значений.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией сусла шочу из группы сусел с твердой коджи и группы с жидкой коджи нешлифованного риса, в условиях дистилляции при пониженном давлении, как следует из данных таблицы 28, не было установлено значительного отличия между группой, в которой использовали твердую коджи, и группой сусел, в которой использовали жидкую коджи нешлифованного риса. Однако группа, в которой использовали жидкую коджи, была отмечена, как имеющая «вкус свежести и прозрачности». Следует иметь в виду, что в этом случае может быть получен рисовый шочу со свежим ароматом, следовательно, полученный результат показывает, что при использовании жидкой коджи нешлифованного риса также может быть получен рисовый шочу того же качества, что при использовании твердой коджи.

Таблица 28
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Прекрасный вкус
Жидкая коджи из нешлифованного риса	2,8	Прекрасный, освежающий, чистый вкус

<Пример 14> [Получение жидкой коджи с использованием нешлифованного риса без оболочки]

1. Способ предварительного культивирования:

8 г шлифованного на 90% риса (пищевой рис) и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени черной коджи (Aspergillus awamori IFO 4388) инокулировали в количестве 1х10⁶ /мл в предкультивированную среду и культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

2. Способ основного культивирования: 1-8 г нешлифованного риса без оболочки, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения в полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С.

После завершения культивирования активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте культуры измеряли способом, описанным в Примере 12.

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 29. Около 100 ед/мл глюкоамилазы и примерно 10 ед/мл кислотостойкой -амилазы являются достаточными количествами ферментативной активности, требующейся для варки шочу в описанном выше исследовании. Как следует из данных, представленных в Таблице 29, если в экспериментальной группе используется 8% нешлифованного риса, то обеспечиваются целевые значения активности GA и ASAA. Даже при использовании плесени черной коджи установлено, что обеспечивается тот же высокопроизводительный эффект производства ферментов, что и при использовании плесени белой коджи. Можно ожидать, что при дальнейшем увеличении количества используемого нешлифованного риса будет обеспечиваться такая же высокопроизводительная продукция ферментов, что и в случае применения плесени белой коджи.

Таблица 29
Количество используемого нешлифованного риса	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	23,0	0,1
2%	33,0	0,2
4%	89,0	8,2
8%	132,7	10,6

<Пример 15> [Получение жидкой коджи с использованием сои]

1. Способ предварительного культивирования

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

2. Способ основного культивирования

1-10 г сои, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин. После завершения культивирования измеряли активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте культуры. В некоторых случаях для измерения ферментативной активности глюкоамилазы (GA) использовали набор для фракционной квантификации способности к осахариванию (производимый Kikkoman). Для измерения ферментативной активности кислотостойкой -амилазы (ASAA) использовали несколько модифицированный способ, описанный в документе 3, согласно которому кислотонеустойчивую -амилазу дезактивировали обработкой продукта культивирования кислотой и затем для определения кислотостойкой -амилазы использовали набор для определения -амилазы (производимый Kikkoman, Japan). В этом случае 1 мл культурального раствора дополняли 9 мл 100 мМ уксусно-кислого буфера (рН 3) и подвергали кислотной обработке при 37°С в течение 1 часа, после чего проводили измерение с помощью набора для измерения -амилазы (производимого Kikkoman, Japan).

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 30. Целевые значения ферментативных активностей, требующихся для варки шочу в описанном выше исследовании, составляли 100 ед/мл глюкоамилазы и около 10 ед/мл кислотостойкой -амилазы. Как следует из данных, представленных в Таблице, активность GA и активность ASAA повышаются с увеличением количества используемой сои. Использование 8% или более сои обеспечивает целевые значения ферментативных активностей. Полученные результаты показывают, что соя может использоваться в качестве сырья.

Таблица 30
Количество используемой сои	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	43,6	2,3
2%	48,0	2,7
4%	84,5	9,3
8%	110,8	11,3
10%	103,7	10,8

<Пример 16> [Получение рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием сои]

Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

Способ предварительного культивирования:

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и систему культивировали при 37°С в течение 24 часов при перемешивании со скоростью 100 об/мин.

(2) Способ основного культивирования:

40 г сои, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С с целью получения соевой жидкой коджи.

3. Способ получения рисового шочу

Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 31 и 32. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. В состав экспериментальных групп входили две экспериментальные группы, включающие 1) сусло с твердой коджи и 2) сусло с жидкой коджи сои. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 31
	Экспериментальная группа (жидкая коджи из сои)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из сои (г)	40,0	-	-	40,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4
Таблица 32
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительное количество риса (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

4. Результаты и обсуждение

Ход процесса ферментации изображен на фигуре 10. Как следует из представленных данных, группа сусел с рисовой твердой коджи из контрольной группы и группа сусел с жидкой коджи сои из экспериментальной группы демонстрируют почти одинаковый ход ферментации. Кроме этого, полученные сусла имели практически одинаковую концентрацию спирта, 19,1% для группы сусел с рисовой твердой коджи и 18,7% для группы сусел с жидкой коджи сои, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией сусла шочу из группы сусел с рисовой твердой коджи и группы с жидкой коджи сои, в условиях дистилляции при пониженном давлении, как следует из данных таблицы 33, не было установлено значительного отличия между группой сусел, в которой использовали рисовую твердую коджи, и группой сусел, в которой использовали жидкую коджи сои. Полученный результат показывает, что использование жидкой коджи сои также обеспечивает получение шочу достаточно высокого качества. Кроме этого группа, в которой использовали жидкую коджи сои, была отмечена, как обладающая «прекрасным ароматом», и была подтверждена возможность получения шочу с использованием способа, который явно отличается от традиционных методов производства твердой коджи.

Таблица 33
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Чистый вкус
Жидкая коджи из сои	2,6	Прекрасный, освежающий вкус

<Пример 17> [Получение жидкой коджи с использованием красной фасоли]

Способ предварительного культивирования

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и проводили культивирование при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

2. Способ основного культивирования

1-10 г красной фасоли, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С. После культивирования активность глюкамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте культуры измеряли согласно способу, описанному в Примере 15.

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 34. Как отмечалось выше, целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу, составляют 100 ед/мл для глюкоамилазы и около 10 ед/мл для кислотостойкой -амилазы. Как следует из представленных данных, активности GA и ASAA достигали максимального значения при использовании 2% красной фасоли. Целевые значения соответствующих ферментативных активностей также достигаются при использовании 1-2% красной фасоли. Таким образом, показано, что красная фасоль может использоваться в качестве сырья для получения жидкой коджи.

	Таблица 34
Количество используемой красной фасоли	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	126,7	11,3
2%	138,2	12,9
4%	85,4	10,8
8%	67,7	9,4
10%	59,0	8,9

<Пример 18> [Получение рисового шочу в присутствии жидкой коджи с использованием красной фасоли]

1. Способ получения твердой коджи

Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, проводили 10-минутный дренаж и 30-минутную обработку паром. Затем полученный в результате рис охлаждали до 40°С и инокулировали 1 г плесневой закваски (белая плесень коджи; Aspergillus kawachii IFO 4308) в расчете на 1 кг шлифованного риса, после чего проводили культивирование при 40°С и относительной влажности 95% в течение 24 часов, при 35°С и относительной влажности 95% в течение 6 часов и при 30°С и относительной влажности 90% в течение 18 часов.

2. Способ получения жидкой коджи

Способ предварительного культивирования: 8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и проводили культивирование при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

(2) Способ основного культивирования: 10 г красной фасоли, 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного кислого фосфата калия и 500 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 2000 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 5 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С с целью получения жидкой коджи красной фасоли.

3. Способ получения рисового шочу

Используемые дрожжи: дрожжи шочу (Kagoshima yeast)

(2) Состав сусла: составы указаны в Таблицах 35 и 36. Использовали шлифованный на 90% рис, который промывали, вымачивали 15 минут, подвергали дренажу в течение 10 минут и в течение 30 минут обрабатывали паром. В состав экспериментальных групп входили две экспериментальные группы, включающие 1) сусло с твердой коджи и 2) сусло с жидкой коджи красной фасоли. В обеих экспериментальных группах использовали одинаковые количества риса и добавляемой в сусло воды. В систему инокулировали 50 мкл дрожжей, статически культивированных в среде YPD при 30°С в течение 48 часов.

(3) Условия ферментации: 25°С, постоянно

(4) Условия дистилляции: дистилляция при пониженном давлении

Таблица 35
	Экспериментальная группа (жидкая коджи из красной фасоли)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из красной фасоли (г)	10,0	-	-	10,0
Дополнительное количество риса (г)	311,3	507,6	507,6	1326,5
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	265,6	1625,0
Жидкая коджи (мл)	500,0	-	-	500,0
90% молочная кислота (мл)	1,4	-	-	1,4

Таблица 36
	Контрольная группа (твердая коджи)
	Первичная	Вторичная	Третичная	Всего
Коджи из риса (г)	311,3	-	-	311,3
Дополнительное количество риса (г)	-	507,6	507,6	1015,2
Вода для сусла (мл)	594,0	765,4	765,6	2125,0

4. Результаты и обсуждение

Ход процесса ферментации изображен на фигуре 11. Как следует из представленных данных, группа сусел с рисовой твердой коджи контрольной группы и группа сусел с жидкой коджи красной фасоли демонстрируют почти одинаковый ход ферментации. Кроме этого, полученные сусла имели практически одинаковую концентрацию спирта, 19,1% для группы сусел с рисовой твердой коджи и 19,2% для группы сусел с жидкой коджи красной фасоли, соответственно.

При проведении органолептической оценки 6 экспертами в интервале оценок от 1 до 5 (1: хорошо; 3-5: плохо) шочу, полученного дистилляцией сусла шочу из группы сусел с твердой коджи и группы с жидкой коджи красной фасоли, в условиях дистилляции при пониженном давлении, как следует из данных таблицы 37, не было установлено значительного отличия между группой сусел, в которой использовали твердую коджи, и группой сусел, в которой использовали жидкую коджи красной фасоли. Полученный результат показывает, что использование жидкой коджи красной фасоли также обеспечивает получение шочу достаточно высокого качества. Кроме этого, группа, в которой использовали жидкую коджи красной фасоли, была отмечена, как обладающая «богатым вкусом и сладким ароматом», и была подтверждена возможность получения шочу с использованием способа, который явно отличается от традиционных методов производства твердой коджи.

Таблица 37
	Результат органолептической оценки
	Оценка (средняя оценка)	Замечания
Твердая коджи	3,0	Чистый вкус
Жидкая коджи из красной фасоли	2,8	Богатый вкус, сладкий аромат красной фасоли

<Пример 19> [Получение жидкой коджи с использованием сладкого картофеля]

1. Способ предварительного культивирования

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶ /мл в предкультивированную среду и проводили культивирование при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

2. Способ основного культивирования

Поверхность свежего сладкого картофеля (около 20 г) слегка промывали, после чего, без каких-либо обработок типа вырезания глазков и снятия кожуры, картофель помещали в дефлекторную колбу емкостью 2000 мл, куда также добавляли 1,0 г нитрата калия, 1,5 г первичного фосфата калия и 500 мл воды, после чего систему обрабатывали в автоклаве в течение 15 минут при 121°С. Далее, в основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и полученное сусло подвергали культивированию в течение 48 часов при 37°С при осторожном перемешивании со скоростью 80 об/мин с целью предотвращения разрушения сладкого картофеля.

Активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте культуры после культивирования измеряли тем же способом, что описан в Примере 15.

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 38. Как отмечалось выше, целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу, составляют 100 ед/мл для глюкоамилазы и около 10 ед/мл для кислотостойкой -амилазы.

Как следует из представленных данных, оба фермента GA и ASAA образуются одновременно. Несмотря на то, что ASAA не демонстрирует целевого значения ферментативной активности, можно ожидать, что ферментативная активность может быть увеличена в результате оптимизации условий культивирования жидкой коджи, например, в результате аэрации. С другой стороны, даже при использовании жидкой коджи сладкого картофеля вполне возможно получение шочу в результате увеличения содержания коджи при приготовлении шочу.

Таблица 38
Сладкий картофель	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
108,6	5,5

<Пример 20> [Получение жидкой коджи с использованием амаранта]

1. Способ предварительного культивирования

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и проводили культивирование при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

2. Способ основного культивирования

1-8 г амаранта, 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали в течение 48 часов при 37°С и скорости перемешивания 100 об/мин. После завершения культивирования измеряли активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте культуры. В некоторых случаях для измерения ферментативной активности глюкоамилазы (GA) использовали набор для фракционной квантификации способности к осахариванию (производимый Kikkoman, Japan). Для измерения ферментативной активности кислотостойкой -амилазы (ASAA) использовали несколько модифицированный способ, описанный в документе 3, согласно которому кислотонеустойчивую -амилазу дезактивировали обработкой продукта культивирования кислотой и затем для определения кислотостойкой -амилазы использовали набор для определения -амилазы (производимый Kikkoman, Japan). В этом случае 1 мл культурального раствора дополняли 9 мл 100 мМ уксусно-кислого буфера (рН 3) и подвергали кислотной обработке при 37°С в течение 1 часа, после чего проводили измерение с помощью набора для определения -амилазы (производимого Kikkoman, Japan).

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 39. Как отмечалось выше, целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу, составляют 100 ед/мл для глюкоамилазы и около 10 ед/мл для кислотостойкой -амилазы. Как следует из представленных данных, целевые значения ферментативной активности обоих ферментов, GA и ASAA, достигаются при использовании амаранта в количестве 2% или более. Таким образом, показано, что амарант может использоваться в качестве сырья для получения жидкой коджи.

Таблица 39
Количество используемого амаранта	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	108,6	5,5
2%	125,7	11,0
4%	112,4	13,5
8%	125,0	13,4

<Пример 21> [Получение жидкой коджи с использованием киноа (quinoa)]

1. Способ предварительного культивирования

8 г шлифованного на 90% риса и 100 мл воды загружали в дефлекторную колбу емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения споры закваски плесени белой коджи (Aspergillus kawachii IFO 4308) инокулировали в количестве 1х10⁶/мл в предкультивированную среду и проводили культивирование при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 24 часов при 37°С.

2. Способ основного культивирования

1-8 г киноа (quinoa), 0,2 г нитрата калия, 0,3 г первичного кислого фосфата калия и 100 мл воды загружали в колбу с дефлекторами емкостью 500 мл и обрабатывали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. В полученную основную культуральную среду инокулировали 1 мл раствора предкультуры и сусло культивировали при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 48 часов при 37°С. После завершения культивирования активность глюкоамилазы (GA) и активность кислотостойкой -амилазы (ASAA) в супернатанте культуры измеряли согласно способу, описанному в Примера 20.

3. Результаты

Полученные результаты представлены в Таблице 40. Как показано в предшествующих исследованиях, целевые значения ферментативной активности, требующейся для варки шочу, составляют 100 ед/мл для глюкоамилазы и около 10 ед/мл для кислотостойкой -амилазы, соответственно. Как следует из данных, представленных в Таблице, оба фермента могут сбалансировано продуцироваться при использовании киноа в количестве 2-4%. Таким образом, показано, что киноа может эффективно использоваться в качестве сырьевого материала для жидкой коджи.

Таблица 40
Количество используемой киноа	Ферментативная активность (ед/мл)
GA	ASAA
1%	132,7	7,3
2%	126,8	10,6
4%	123,5	11,1
8%	88,2	18,1

Промышленная применимость

Изобретение предусматривает дешевый и эффективный способ получения жидкой коджи стабильного качества с использованием зерновых культур, с поверхности которых удаляют оболочку (чешую и т.п.), бобовых культур или клубней, поверхность которых покрыта оболочкой, или амаранта и/или киноа разнообразного происхождения. Кроме этого, жидкая коджи предпочтительна для получения ферментированных продуктов и напитков. Оба фермента, глюкоамилаза и кислотостойкая -амилаза могут сбалансировано продуцироваться с высоким выходом. Таким образом, эти материалы могут использоваться для получения алкогольных напитков, таких как шочу.7