способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека

Формула изобретения

Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека, включающий обнаружение в сыворотке человека противотуляремийных антител в точечном твердофазном иммуноферментном анализе (дот-блоттинг) путем использования препарата липополисахарида Francisella tularensis, отличающийся тем, что дополнительно в качестве антигенного препарата в дот-блоттинге параллельно с ЛПС F.tularensis используют ЛПС F.novicida, для этого предварительно выделяют из соответствующих штаммов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, которые растворяют в дистиллированной воде и наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл, с последующей обработкой забуференным физиологическим раствором при рН 7,0-7,1 с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0,5% твина 20 в течение одного часа, после этого фильтры промывают и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем 1:100, в течение часа при температуре 37С°, затем образцы трехкратно отмывают и выявляют наличие комплексов антиген-антитело, путем выдерживания в течение 1 ч при комнатной температуре в рабочем растворе белка А, меченного пероксидазой хрена, с последующим отмыванием и размещением в окрашивающем растворе, при этом учет и оценку результатов проводят по наличию двух коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, наличие которых свидетельствует об инфекционном процессе у исследуемого больного, а при вакцинальном процессе наблюдают одно пятно на месте нанесения только ЛПС F.tularensis.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туляремии у человека.

Приоритетным направлением в диагностике туляремии у человека являются иммунологические методы, направленные на выявление противотуляремийных антител. Однако специфические иммуноглобулины могут обнаруживаться не только в сыворотках заболевших туляремией людей, но также и в сыворотках людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной. Поэтому на этапе исследований первичной сыворотки больного существует актуальная проблема в определении данной ситуации в экспрессном варианте.

Известен способ микроточечного иммуноферментного анализа с визуальной индикацией для определения туляремийных антител (Юров С.В., Пчелинцев С.Ю. и др. «Использование микроточечного иммуноферментного анализа с визуальной индикацией для определения туляремийных антител». ЖМЭИ, 1991, № 3, стр.61-64), заключающийся в том, что при постановке дот-ИФА антигенный препарат, представляющий собой ультразвуковой дезинтеграт клеток туляремийного микроба, наносят в виде точки на нитроцеллюлозные мембраны и далее последовательно инкубируют их с исследуемой сывороткой и антивидовыми антителами (против IgG человека), коньюгированными с пероксидазой хрена. Однако использование ультразвукового дезинтеграта клеток бактерий, представляющего собой ЛПС-белковый комплекс, может обусловливать наличие неспецифических реакций с антителами исследуемых сывороток. Кроме того, данный способ не позволяет провести дифференциацию инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека, так как выявляет наличие противотуляремийных антител как в сыворотках больных туляремией, так и в сыворотках вакцинированных людей.

Наиболее близким техническим решением является способ обнаружения противотуляремийных антител путем точечного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием препаратов липополисахарида (ЛПС) Francisella tularensis (H.B.Аронова, Н.В.Павлович «Использование препаратов липополисахарида Francisella tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе». ЖМЭИ, 2000, № 5, стр.75-78), заключающийся в обнаружении в сыворотке крови человека противотуляремийных антител с помощью дот-блоттинга с применением в качестве высокоспецифичного антигенного препарата очищенного ЛПС, выделенного из F.tularensis.

Однако и данный метод не позволяет осуществлять дифференциацию принадлежности противотуляремийных к вакцинальному или инфекционному процессу у человека, что затрудняет лечение больного, так как в течение 7-10 дней до исследования парной сыворотки человек остается без подтвержденного диагноза и адекватной антибиотикотерапии.

Задача предлагаемого изобретения состояла в сокращении времени установления диагноза и повышения его достоверности.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем обнаружение в сыворотке человека противотуляремийных антител в точечном твердофазном иммуноферментном анализе (дот-блоттинг) с использованием препарата липополисахарида Francisella tularensis, дополнительно в качестве антигенного препарата параллельно к ЛПС F.tularensis используют ЛПС F.tularensis subsp.novicida Utah 112 (F.novicida), для этого предварительно выделяют из соответствующих штаммов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, которые растворяют в дистиллированной воде и наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл, с последующей обработкой забуференным физиологическим раствором при рН 7.0-7.1 с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0.5% твина 20 в течение одного часа, после этого фильтры промывают и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем 1:100, в течение часа при температуре 37С°, затем образцы трехкратно отмывают и выявляют наличие комплексов антиген-антитело путем выдерживания в течение 1 часа при комнатной температуре в рабочем растворе белка А, меченного пероксидазой хрена, с последующим отмыванием и размещением в окрашивающем растворе, при этом учет и оценку результатов проводят по наличию двух коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, наличие которых свидетельствует об инфекционном процессе у исследуемого больного, а при вакцинальном процессе наблюдают одно пятно на месте нанесения только ЛПС F.tularensis.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно, перед проведением дот-иммуноанализа, выделяют липополисахариды (ЛПС) по методу R.P.Darveau и R.E.W.Hancock (1983) из ацетон-высушенной бактериальной массы штаммов F.tularensis и F.novicida. Каждый из препаратов ЛПС, растворенных в дистиллированной воде, наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл. Блокирование свободных сайтов связывания нитроцеллюлезы проводят забуференным физиологическим раствором (ЗФР) (рН 7,0-7,1) с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0,5% твин 20 в течение одного часа. Далее нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) промывают ЗФР и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем в 1:100, в течение часа при температуре 37°. В качестве разводящей жидкости для сыворотки используют 0,05% твин 20 на ЗФР. Затем образцы подвергают 3-кратной промывке по 2 минуты 0,01% раствором твина 20 на ЗФР. Для выявления комплексов антиген-антитело пробы инкубируют в рабочем растворе белка А, меченого пероксидазой хрена, 1 час при комнатной температуре.

Следующим этапом НЦМ трехкратно промывают по описанной выше процедуре. Затем блоты промывают в дистиллированной воде и переносят в окрашивающий раствор (20-30 мл ЗФР с добавлением 10-15 мг 3,3-диаминобензидина 4-гидрохлорида (DAB) и 10-20 мкл 30% H₂O₂). Реакцию проявляют в течение 1-2 минут с последующей остановкой в дистиллированной воде. За положительный результат принимают наличие четкого коричневого пятна на месте нанесения препарата при соответствующем отрицательном контроле с нормальной человеческой сывороткой.

Учет и оценка результатов

Наличие двух четких коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida в дот-иммуноанализе при исследовании сыворотки человека свидетельствует об инфекционном заболевании, вызванном возбудителем туляремии - F.tularensis.

Наличие только одного четкого коричневого пятна в дот-блоттинге на месте нанесения препарата ЛПС F.tularensis позволяет сделать вывод, что происхождение выявленных противотуляремийных антител обусловлено иммунизацией человека живой туляремийной вакциной.

Для проверки предложенного способа в качестве исследуемых образцов были использованы 6 сывороток от людей больных туляремией (с клинико-лабораторным подтверждением диагноза), 30 сывороток - от иммунизированных живой туляремийной вакциной и 6 нормальных (неиммунных) сывороток человека. Данные сыворотки были протестированы в дот-иммуноанализе с двумя антигенными препаратами: ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida.

Как показали испытания, во всех сыворотках от больных туляремией людей присутствовали иммуноглобулины, реагирующие как с ЛПС F.tularensis, так и с ЛПС F.novicida. В противоположность этому, в дот-блоттинге с сыворотками вакцинированных людей было зарегистрировано взаимодействия антител только с ЛПС F.tularensis, но не с ЛПС F.novicida. Нормальные (неиммунные) сыворотки людей не давали реакции ни с одним препаратом ЛПС.

Таким образом, обнаружение взаимодействия антител исследуемой сыворотки с обоими препаратами ЛПС (F. tularensis и F. novicida) может свидетельствовать в пользу инфекционного заболевания, а связывание иммуноглобулинов только с препаратом ЛПС F. tularensis - в пользу наличия антител, обусловленных поствакцинальным противотуляремийным иммунитетом. На основании данных результатов можно сделать заключение о том, что предложенный способ позволяет дифференцировать инфекционный и поствакцинальный антительный ответы при туляремии у человека.

Пример 1. Исследовали сыворотку человека (37 л) с подозрением на туляремию (лихорадка, лимфаденит).

С помощью дот-иммуноанализа с двумя антигенными препаратами ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida первичная сыворотка больного изучена по описанной выше технологии. На месте нанесения ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida зарегистрирована реакция антител первичной сыворотки с обоими антигенными препаратами в виде двух пятен коричневого цвета с выраженностью окраски на 3-4 креста, что свидетельствует в пользу заболевания туляремией у данного человека.

Через 10 дней после забора первичной сыворотки диагноз туляремии был подтвержден лабораторно при исследовании парной сыворотки по нарастанию титра специфических противотуляремийных антител (МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией». М., 2005).

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет уже на этапе исследования первичной сыворотки подтвердить наличие у человека инфекционного процесса, вызванного F.tularensis, что значительно сокращает время при постановке диагноза.

Пример 2. Сыворотку человека (53 г), иммунизированного живой туляремийной вакциной (3 месяца назад) исследовали в дот-иммуноанализе с двумя антигенными препаратами - ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida - по описанной выше технологии. В результате исследования сыворотки в дот-иммуноанализе зарегистрирована реакция антител сыворотки только с препаратом ЛПС F.tularensis. Реакция антител с антигенным препаратом ЛПС F.novicida отсутствует. Эти данные свидетельствуют о том, что в сыворотке человека присутствуют только противотуляремийные антитела, обусловленные последствиями иммунизации человека туляремийной вакциной. Таким образом, результаты дот-иммуноанализа в данном случае свидетельствуют в пользу принадлежности выявленных антител не к заболеванию туляремией, а к имевшей место иммунизации живой туляремийной вакциной.

Пример 3. Сыворотку здорового человека (42 г) исследовали в дот-иммуноанализе с двумя антигенными препаратами: ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, по описанной выше технологии. В результате не зарегистрировано реакции антител сыворотки ни с одним препаратом ЛПС. Данный факт свидетельствует об отсутствии в сыворотке этого человека специфических противотуляремийных антител.

Использование предлагаемого изобретения позволяет на этапе исследования первичной сыворотки человека в дот-иммуноферментном анализе с препаратами ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida экспрессно дифференцировать наличие антительного ответа, обусловленного инфекционным или поствакцинальным иммунитетом.

Кроме того, способ позволит повысить достоверность диагностики туляремийной инфекции у человека при исследовании первичной сыворотки со своевременным назначением эффективного лечения заболевания и развертыванием адекватных противоэпидемических мероприятий в очаге.