применение двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции в области клинической химии для анализов компонентов, содержащихся в клиническом образце

Формула изобретения

1. Диагностический способ in vitro количественного определения компонента, содержащегося в клиническом образце, применяемый в области клинической химии, где анализируемый компонент

a) подвергается химической реакции или реакциям с реагентом или реагентами в одну или несколько стадий, или в последовательности реакций, или

b) катализирует химическую реакцию или реакции, или реакцию в последовательности реакций реагента или реагентов в одну или несколько стадий

в реакционной системе, причем указанная реакция или реакции, или последовательность реакций приводит к изменению подвергаемого измерению свойства соединения или соединений указанной реакции или реакций или последовательности реакций, отличающийся тем, что

i) указанная химическая реакция или реакции, или последовательность реакций приводит к

образованию соединения с двухфотонно-возбуждаемой флуоресценцией, или

изменению свойств двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции реакционной системы, содержащей по крайней мере одно соединение с двухфотонной флуоресценцией; и

ii) указанный анализируемый компонент количественно оценивают посредством возбуждения указанного соединения или соединений с двухфотонной флуоресценцией и измерения двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции и соотнесения данных измерения флуоресценции с методом стандартизации данных, основанным на измерениях, полученных от эталонного материала указанного анализируемого компонента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что он включает в себя стадии

a) осуществления контакта клинического образца, содержащего анализируемый компонент, со специфическим реагентом или реагентами для анализа;

b) осуществления в реакционной системе химической реакции анализируемого компонента с указанным реагентом или реагентами, или осуществления химической реакции или реакций указанного реагента или реагентов, катализируемой анализируемым компонентом;

c) возможно, повторения стадий а) и b) один или несколько раз;

d) указанная реакция или реакции стадии или стадий b) приводит к образованию соединения, проявляющего двухфотонную флуоресценцию, или приводит к изменению характеристик двухфотонной флуоресценции указанной реакционной системы, включающей в себя по крайней мере одно соединение, проявляющее двухфотонную флуоресценцию; и

e) количественной оценки указанного анализируемого компонента путем возбуждения указанного соединения или соединений, проявляющего двухфотонную флуоресценцию, измерения двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции и соотнесения величин указанной измеренной флуоресценции с методом стандартизации данных, основанным на измерениях, полученных от эталонного материала указанного анализируемого компонента.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что флуоресценцию, являющуюся результатом двухфотонного возбуждения, измеряют кинетически.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что флуоресценцию, являющуюся результатом двухфотонного возбуждения, измеряют как сигнал в конечной точке.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что количественное определение анализируемого компонента, содержащегося в клиническом образце, осуществляют для нескольких образцов путем повторения стадий от а) до е) по п.2 для каждого образца.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что несколько анализируемых компонентов, содержащихся в клиническом образце, определяют количественно путем повторения стадий от а) до е) по п.2 для каждого анализируемого компонента.

7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что компонент или компоненты, содержащиеся в клиническом образце, выбирают из группы, состоящей из альбумина, общего белка, гемоглобина, аммиака, карбоната, билирубина прямого, билирубина общего, кальция, хлорида, железа, магния, фосфата, холестерина ЛВП, холестерина ЛНП, общего холестерина, креатинина, фруктозамина, глюкозы, лактата, триглицеридов, мочевины, мочевой кислоты, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, панкреатической амилазы, общей амилазы, холинэстеразы, креатинкиназы, глутамилтрансферазы, глутаматдегидрогеназы, гидроксибутиратдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и липазы.

8. Применение флуорометрического устройства, работающего на принципе флуоресценции при двухфотонном возбуждении для in vitro диагностического количественного определения анализируемого компонента или компонентов, содержащихся в клиническом образце или образцах, где указанное количественное определение одного или более указанных анализируемых компонентов включает в себя одну или более химических реакций, приводящих к образованию по крайней мере одного соединения с двухфотонной флуоресценцией, или к изменению свойств двухфотонной флуоресценции реакционной системы, содержащей по крайней мере одно соединение с двухфотонной флуоресценцией.

9. Применение по п.8, отличающееся тем, что устройство представляет собой импульсный лазер для двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции

a) с длительностью импульсов лазерного излучения короче 10 нс,

b) с частотой повторения импульсов выше 10 кГц,

c) с ТЕМ 00 типом выхода поляризованного пучка, и

d) со средней мощностью пучка в образце от 20 до 200 мВт, предпочтительно от 85 до 120 мВт и наиболее предпочтительно приблизительно 100 мВт.

10. Применение по п.8 или 9, отличающееся тем, что анализируемый компонент или компоненты, содержащиеся в клиническом образце, выбирают из группы, состоящей из альбумина, общего белка, гемоглобина, аммиака, карбоната, билирубина прямого, билирубина общего, кальция, хлорида, железа, магния, фосфата, холестерина ЛВП, холестерина ЛНП, общего холестерина, креатинина, фруктозамина, глюкозы, лактата, триглицеридов, мочевины, мочевой кислоты, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, панкреатической амилазы, общей амилазы, холинэстеразы, креатинкиназы, глутамилтрансферазы, глутаматдегидрогеназы, гидроксибутиратдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и липазы.

11. Применение по п.10, отличающееся тем, что одно и то же флуорометрическое устройство последовательно используют для количественного определения по крайней мере 2, предпочтительно 5, более предпочтительно 10, еще более предпочтительно 20 и наиболее предпочтительно всех анализируемых в клиническом образце компонентов из группы.

12. Применение по п.8 или 9, отличающееся тем, что одно и то же флуорометрическое устройство также используют для количественного определения анализируемых биоаффинным методом компонентов.

13. Система для in vitro диагностического количественного определения по крайней мере одного анализируемого компонента, содержащегося в клиническом образце или образцах, отличающаяся тем, что система включает в себя

a) флуорометрическое устройство, работающее на принципе флуоресценции при двухфотонном возбуждении, для количественной оценки одного или нескольких анализируемых в клиническом образце компонентов, блок управления, включающий блок памяти и измерительное устройство, и

b) блок обработки данных с программой для специализированной обработки данных для указанного количественного определения указанного анализируемого компонента или компонентов с помощью указанного флуорометрического устройства, где указанное количественное определение одного или более указанных анализируемых компонентов включает в себя одну или более химических реакций, приводящих к образованию по крайней мере одного соединения с двухфотонной флуоресценцией, или к изменению свойств двухфотонной флуоресценции реакционной системы, содержащей по крайней мере одно соединение с двухфотонной флуоресценцией.

14. Система по п.13, отличающаяся тем, что она включает в себя магазины для кювет, предназначенных для анализа, вмещающие пробирки для образцов и кюветы.

15. Система по п.13 или 14, отличающаяся тем, что она включает в себя раздаточное устройство для разбавления образца и для распределения его в кюветы для анализа.

16. Система по п.13 или 14, отличающаяся тем, что она включает в себя механизмы для перемещения кювет для анализа и/или распределяющей головки.

17. Система по п.13 или 14, отличающаяся тем, что она включает в себя блок управления для автоматического контроля системы.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области клинической химии и к применению двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции в качестве принципа детектирования данных количественного определения компонентов, анализируемых в клиническом образце.

Предыдущий уровень техники в данной области

Публикации и другие материалы, используемые в описании с целью иллюстрации предыдущего уровня техники в данной области, в частности дополнительные сведения, касающиеся практики, включены в текст посредством ссылки.

Анализы в области клинической химии

Под определяемыми в клиническом образце компонентами авторы подразумевают в данном контексте метаболиты или другие компоненты сыворотки, которые обычно измеряют на практике в области клинической химии. Примерами таких анализируемых компонентов являются следующие компоненты: глюкоза, общий холестерин, холестерин ЛВП (HDL), холестерин ЛНП (LDL), триглицериды, билирубин, креатинин, общие белки, железо, магний, мочевина, мочевая кислота, ASAT, ALAT, амилаза, ЛДГ (LDH), GT, щелочная фосфатаза, липаза и креатинкиназа. В данном контексте, определяемые компоненты, содержащиеся в клиническом образце, не включают такие компоненты, которые измеряют способами, основанными на связывании по сродству, такими как количественный иммунный анализ, анализ конкурентного связывания, анализ, основанный на образовании антигенного мостика, или агглютинационный анализ (The Immunoassay Handbook, 1994, David Wild, Editor, ISBN 0-333-51179-4).

Наиболее часто определяемые в клиническом образце компоненты анализируют способами, основанными на фотометрическом определении. Аналитические протоколы включают в себя добавление одного или нескольких реагентов к образцу (например, кровь, плазма, сыворотка, моча или другая жидкость организма, разбавленная или неразбавленная в соответствующем водном или неводном разбавителе) и инкубацию при постоянных условиях в одном или нескольких случаях после добавления реагента или в промежутках между добавлениями реагента. И, наконец, абсорбцию анализируемой смеси измеряют при одном или нескольких диапазонах длин волн, с последующим расчетом концентрации анализируемого компонента с помощью стандартных калибровочных кривых. Большая часть клинических анализов основана на реакции, катализируемой ферментом, где фермент действует либо как анализируемый компонент, либо как специфический катализатор реакции для анализируемого компонента. В результате реакции, катализируемой ферментом, происходит изменение структуры молекулы субстрата, которое приводит к изменению абсорбционных характеристик субстрата. Изменение фотометрического показания при соответствующей длине волны пропорционально концентрации анализируемого компонента в образце. В случае, когда анализируемый компонент действует как субстрат и фермент служит в качестве реагента, реакция может закончиться, при этом измерение осуществляется по конечной точке, в то время как, когда фермент действует как анализируемый компонент, реакция протекает в строго контролируемых условиях и измерение осуществляется с помощью кинетических приемов. В этом контексте, термин "кинетическое измерение" означает, что образец количественно оценивают либо при определенной заданной временной точке (или временных точках), либо, в качестве альтернативы, если кинетика реакции хорошо охарактеризована и промоделирована математически, реакцию можно оценить при любой определенной временной точке (или временных точках) с последующим расчетом конечной ферментативной активности (концентрация в единицах активности), используя кинетические уравнения, рассчитанные заблаговременно для этого отдельного случая. Программы анализа и методология, которые обычно используются в клинической практике, описаны в учебниках и в литературе (Tiez Texbook of Clinical Chemistry, Ed. C.Burtis and E.Ashwood, W.B.Saunders Company). Другой тип клинических анализов представлен таким типом, который не включает в себя ферментативный катализ, но имеет чистую химическую основу (неферментативные реакции). Такие анализируемые компоненты включают в себя, например, анализ билирубина с помощью диазореагента, анализ сывороточного белка с помощью биуретовой реакции и анализ альбумина с помощью BCG-реагента (бромкрезоловый зеленый) (Tiez Texbook of Clinical Chemistry, p.702). В результате этих реакций образуется окрашенный конечный продукт, концентрацию которого измеряют посредством фотометрии в соответствующей области длин волн. Самая типичная форма фотометрического анализатора в клинической практике включает в себя одиночный световой пучок и разовые фотометрические кюветы. Это означает, что любая вариация в оптической длине разовых кювет или в оптических свойствах стенок кювет вызывает неточность в конечном результате анализа. Из-за этих свойств фотометрии и, с другой стороны, из-за жестких требований к точности клинических анализов, требования к качеству разовых кювет являются чрезвычайно необходимыми. По этой причине, кюветы для клинических анализов являются и остаются дорогостоящими. В практике клинической химии, цена кюветы составляет основу стоимости клинических анализов, осуществленных с помощью фотометрии.

Некоторые из анализируемых компонентов клинического анализа также определяли методами, основанными на детекции флуоресценции (однофотонно-возбуждаемая флуоресценция). Указанные анализы были осуществлены путем замены хромогенного субстрата (или реагента), используемого в фотометрических методах, на флуорогенный субстрат (или реагент). В результате, сигнал флуоресценции, исходящий из анализируемой смеси, является пропорциональным концентрации компонента. Примерами таких анализов являются анализ глюкозы с помощью глюкозооксидазы, пероксидазы и Amplex Red (флуорогенный субстрат, торговое название молекулярных зондов, кат.No. A-12222) в качестве реагентов, и анализ креатинина с помощью креатининазы, креатиназы, саркозиноксидазы, пероксидазы и Amplex Red в качестве реагентов. Другим примером является анализ амилазы с помощью меченного флуорофором крахмала в качестве реагента (или другой аналог крахмала, такой как амилопектин или соответствующий синтетический реагент, такой как -1,4-олигосахарид), где меченый крахмал является субстратом для фермента, причем гидролиз субстрата приводит к повышению флуоресценции по мере того, как фермент переваривает полимерный реагент (или олигомер) (Fluorescence Microplate Assays, Molecular Probes, Seventh edition, 2002, p.51). Другим примером флуорометрических методов анализа является анализ щелочной фосфатазы с помощью флуоресцеином меченного фосфата в качестве флуорогенного субстрата (Handbook of fluorescent probes and research products, 9 ^th Ed., p.420, Molecular Probes, Eugene, OR, USA, 2002). Данный анализ основан на увеличении интенсивности флуоресценции при гидролизе флуорогенного субстрата анализируемым компонентом. Однако основанные на флуоресценции анализы используют, в основном, в исследовательских лабораториях, в то время как их использование в клинической практике является весьма ограниченным. В целом, основанные на флуоресценции методы дают порядки величин с большей чувствительностью и более широкого динамического диапазона, чем методы, основанные на фотометрии. В исследовательских лабораториях, эти качества дают явное преимущество, но в области клинической химии это преимущество не имело полезного применения, поскольку требования, предъявляемые к чувствительности или динамическому диапазону анализов в области клинической химии, часто являются скорее недостаточно высокими. Вместо этого, достоверность, точность результатов и стоимость реагента обычно рассматриваются как более важные критерии для анализов в области клинической химии. На примере указанных критериев было показано, что до настоящего времени флуорометрия не продемонстрировала явных преимуществ над фотометрией как способа детектирования в клинической практике.

Применения флуоресценции в биоаффинных анализах

Однофотонно-возбуждаемая флуоресценция нашла различные применения в области биоаналитики. Применения, такие как иммунологический анализ, анализ с помощью ДНК-гибридизации и анализ связывания рецептора, с использованием флуоресценции в качестве метода детектирования были внедрены в течение последних трех декад. В указанных анализах используют специфические биоаффинные реакции при определении анализируемого компонента в образце. Количество анализируемого компонента можно определять посредством контролирования сигнала флуоресценции, который зависит от количества связанного анализируемого компонента. Данные анализы также могут быть основаны на контролировании изменения в свойствах флуоресценции в течение реакции специфического связывания. Указанное изменение свойства флуоресценции может включать в себя либо изменение интенсивности флуоресценции, изменение длины волны испускания, изменение во времени спада импульса, либо в поляризации флуоресценции.

Иммунологические анализы были широко использованы в клинической диагностике для определения некоторых заболеваний или физиологического состояния. Иммуноанализы могут быть разделены на два разных типа анализов, конкурентный и неконкурентный анализы. В конкурентном методе, меченый антиген (второй биоспецифический реагент) конкурирует с анализируемым компонентом за связывание с ограниченным числом антител (первый биоспецифический реагент). Концентрация анализируемого компонента может быть определена из соотношения меченого антигена, связанного с антителом, или из соотношения свободной фракции меченого антигена. В неконкурентном способе (иммунометрический метод), анализируемый компонент связывается с избыточным количеством связывающего антитела (первый биоспецифический реагент). Избыток меченого антитела (второй биоспецифический реагент) связывается с другим участком анализируемого компонента. Количество анализируемого компонента можно определить на основе фракции меченого антитела, связанного с анализируемым компонентом. Физическое разделение связанных и свободных фракций является необходимым приемом до детектирования, если принцип регистрации не дает возможности отличить сигнал связанной фракции от сигнала свободной фракции. Таким образом, методы анализа подразделяются на анализы с разделением и анализы без разделения, часто также названные как гетерогенный и гомогенный анализы. [Miyai К., Principles and Ptactice of immunoassay, (ed. Price C.P. and Newman D.J.) Stockton Press, New York 1991, 246 and Hemmilä I.A., Applications of Fluorescence in Immunoassays, (ed. Winefordner J.D.) John Wiley & Sons, New York 1991]. Способ с использованием трубки с покрытием обычно применяют для анализов с разделением, и в таких случаях свободную фракцию отделяют посредством повторяемых стадий промывки.

Чувствительность и динамический диапазон флуорометрии при однофотонном возбуждении являются выше и обширнее, чем таковые при фотометрии. Однако чувствительность является достаточной только для ограниченного количества анализов. Способы флуоресценции с разрешением во времени, хемилюминесценции или электрохемилюминесценции дают улучшенную чувствительность по сравнению с обычным устойчивым состоянием (т.е. мгновенным) флуоресценции. Указанные способы известны как в области научных исследований, так и в диагностике, и их рассматривают наряду с самыми чувствительными аналитическими методами (Hemmila and Mukkala, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2001).

Двухфотонное возбуждение

В 1931 Maria Göppert-Mayer [Ann. Phys. 9 (1931) 273] показала, что молекула одновременно может поглощать два фотона. Это явление оставалось долгое время без какого-либо практического применения до тех пор, пока не стали доступными источники интенсивного лазерного излучения. Двухфотонное возбуждение создается тогда, когда при фокусировании интенсивного источника света плотность фотонов на единицу объема и в единицу времени становится достаточно высокой для того, чтобы два фотона могли быть одновременно поглощены одним и тем же хромофором. Поглощенная энергия состоит из суммы энергий двух фотонов. Возможность двухфотонного возбуждения будет зависеть от степени плотности 2-го фотона. Таким образом, поглощение двух фотонов является нелинейным процессом второго порядка. Одновременное поглощение двух фотонов одним хромофором приводит хромофор в возбужденное состояние. Затем, указанное возбужденное состояние ослабляется при спонтанной эмиссии фотона с более высокой энергией, чем фотоны освещения. В этом контексте процесс, который включает в себя двухфотонное возбуждение и последующую релаксацию, сопровождающуюся излучением, называют двухфотонно-возбуждаемой флуоресценцией (ТРЕ). ТРЕ обычно имеет характеристики излучения, подобные характеристикам однофотонно-возбуждаемой флуоресценции для такого же хромофора [Хu С.and Webb W.W., J. Opt. Soc. Am. B, 13 (1996) 481]. Спектр возбуждения, однако, иногда расширяется и/или гипсохромно смещается, если сравнивать со спектром однофотонного возбуждения. Молекулы, которые возбуждаются при одновременном поглощении двух фотонов и производят возбужденные состояния и флуоресцентное излучение, в данном контексте называют двухфотонными флуоресцентными красителями.

Одной из ключевых характеристик двухфотонного возбуждения является то, что возбуждение имеет место только в четко ограниченном 3-мерном пространстве (3D) фокусной точки. Следствием данной характеристики является высокая 3D концентрация в пространстве произведенного флуоресцентного излучения. Вследствие нелинейной природы возбуждения, минимальная фоновая флуоресценция производится вне фокусного объема, т.е., в среде, окружающей образец, и в оптических компонентах. Другой ключевой характеристикой двухфотонного возбуждения является то, что освещение и излучение имеют место в существенно различающихся областях длин волн. Результатом этой характеристики является то, что утечку рассеянного света в канале, регистрирующем флуоресцентное возбуждение, можно уменьшить с помощью фильтра низких частот (уменьшение по крайней мере на 10 порядков величин). Поскольку объем возбуждения является небольшим (в области фемтолитров, т.е., 10-15 литров), двухфотонное возбуждение является наиболее подходящим для наблюдения за небольшими объемами образцов и структур.

Биоаналитические применения флуоресценции с двухфотонным возбуждением

Одним из ранних сообщений, касающихся аналитического использования двухфотонного возбуждения, была публикация Sepaniak et al. [Anal. Chem. 49 (1977), 1554]. Авторы обсуждали возможность использования флуоресценции с двухфотонным возбуждением для регистрации ВЭЖХ. Низкий фоновый уровень и простота системы были продемонстрированы. Исследователи Lakowicz et al. [J. Biomolec. Screening 4 (1999) 355] сообщили об использовании мультифотонного возбуждения при скрининге с высокой пропускной способностью. Они показали, что двухфотонно-индуцированная флуоресценция флуоресцеина может быть измерена с большой достоверностью в многолуночных планшетах с высокой плотностью размещения.

Большая часть биоаналитического применения флуоресценции с двухфотонным возбуждением, описанного в литературе, относится к двухфотонной микроскопии [Denk W. et al. патент США 5034613, Denk W. et al., Science 248 (1990) 73]. Использование двухфотонного флуоресцентного возбуждения в лазерной сканирующей микроскопии дает 3D пространственную разрешающую способность без использования маленьких отверстий, необходимых в конфокальной микроскопии. Вместе с простой оптической моделью, микроскопия с двухфотонным возбуждением обеспечивает 3D пространственную разрешающую способность, сравнимую со способностью обычной однофотонной конфокальной микроскопии. Развитие также приводит к промышленному производству двухфотонных лазерных сканирующих микроскопических систем. Препятствием к развитию способа является требование дорогостоящего лазера, способного генерировать сильные ультракороткие импульсы с высокой частотой повторения.

Последняя разработка менее дорогостоящей лазерной технологии является весьма ободряющей в связи с применением флуоресцентной технологии с двухфотонным возбуждением в рутинных биоаналитических способах [Hänninen P. et al., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 548; Soini J.T. et al. Single Mol. 1 (2000) 203; Soini JT (2002) Crit. Rev. Sci. Instr., международные пуоликации WO 98/25143 и WO 99/63344]. Согласно международной публикации WO 98/25143 и международной публикации WO 99/63344, вместо дорогостоящих лазеров с режимом синхронизации мод для двухфотонного возбуждения могут быть использованы микрочип-лазеры с накачкой светодиодами с пассивной модуляцией добротности. Указанные лазеры являются монолитными, небольшими, простыми и низкими по стоимости. Международные публикации WO 98/25143 и WO 99/63344 описывают использование двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции в детектировании данных биоаффинного анализа. В этом способе биоаффинного анализа используются микрочастицы в качестве биоаффинной связывающей твердой фазы, с которой связывается первый биоспецифический реагент. В этом способе биоаффинного анализа используют биоспецифический второй реагент, который метят двухфотонным флуоресцентным красителем. Согласно способам, описанным в международных публикациях WO 98/25143 и WO 99/63344, биоаффинные комплексы образуются на поверхности микрочастиц, и количество биоаффинных комплексов количественно определяют путем измерения интенсивности двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции, исходящей из индивидуальных микрочастиц. Таким образом, этот способ позволяет производить биоаффинный анализ без разделения в микрообъемах.

Меченый второй биоаффинный реагент связывается на поверхности микрочастиц либо через молекулу анализируемого компонента с образованием трехкомпонентных биоаффинных комплексов (неконкурентный, иммунометрический метод), либо он связывается прямо с первым биоспецифическим реагентом с образованием двухкомпонентных биоаффинных комплексов (метод конкурентного связывания). Первый и второй биоспецифические реагенты являются биологически активными молекулами, такими как гаптены, биологически активные лиганды, лекарственные средства, пептиды, полипептиды, белки, антитела или фрагменты антител, нуклеотиды, олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты. Согласно международным публикациям WO 98/25143 и WO 99/63344 лазер с высокой эффективностью двухфотонного возбуждения фокусирован на реакционную суспензию, и двухфотонно-возбуждаемую флуоресценцию, исходящую от единичных микрочастиц, измеряют, когда они перемещаются по всему фокусному объему лазерного пучка. В качестве альтернативы, микрочастицы могут быть «уловлены» в течение периода регистрации флуоресценции оптической ловушкой, которая вызывается лазерным лучом. Захват микрочастиц к фокусной точке лазерного пучка основан на оптическом давлении, которое производится на микрочастицу посредством луча лазера. Согласно международной публикации WO 98/25143, оптическое улавливание повышает продолжительность существования частицы в фокусном объеме лазерного пучка и увеличивает рабочий цикл регистрации флуоресценции. Схема оптического расположения типичного флуорометрического устройства с двухфотонным возбуждением показана на фигуре 1 (ArcDia TPX Plate Reader). Конструкция устройства может различаться в зависимости от отдельного использования и применения. Наиболее важными компонентами, которые отличают устройство, являются:

- Лазерный луч фокусирован с помощью линз объектива микроскопа с минимумом числовой апертуры от 0,4 до 0,7.

- Для улавливания микрочастиц используют двухмерный пьезоактивный сканер, который способен остановить сканирование мгновенно, когда микрочастица обнаруживается вблизи фокусного объема.

- Лазер для ближней инфракрасной области спектра представляет собой импульсный лазер с длительностью импульса короче 10 наносекунд, частотой повторения импульсов выше 10 кГц и средней мощностью луча в образце порядка 100 мВт, с ТЕМ 00 типом выхода поляризованного луча. Типичным лазером является микрочип-лазер на Nd:YAG или Nd:LBS с пассивной модуляцией добротности [Danailov M.B. & ai., Appl. Phys. В 73, 1-6 (2001)]. Альтернативным лазером может быть Yb-промотированный волоконный лазер с синхронизацией мод [Grudinin А. В. & ai., Optics Letters (2003), Vol.28 Issue 17 Page 1522].

Сигнал флуоресценции в видимой области оптического спектра определяют с помощью фотоумножителей СРМ, используя простой подсчет фотонов.

Текущее состояние вопроса в диагностическом тестировании in vitro

Основными областями диагностического тестирования in vitro (IVD) являются: клинические анализы, биоаффинные анализы, гематология и микробиология. Из указанных четырех областей диагностика чаще требуется в практике клинической химии, однако, самый высокий объем продаж и темп роста приходится на биоаффинные анализы. Другие области, микробиология и гематология, вместе составляют 1/6 от объема продаж IVD, но они являются необходимыми для полного первичного диагноза и лечения.

В обычной лабораторной практике небольших и средних больниц или поликлиник, обычно требуются три типа анализаторов: 1) устройство для подсчета клеток крови в гематологии, 2) автоматический анализатор для клинической химии и 3) анализатор для иммунологических анализов. Микробиологическое тестирование можно выполнить быстрым способом с помощью тест-полосок, путем визуализации микробных культур или с помощью иммуноанализа, таким образом, специализированных инструментов не требуется для считывания результатов проверки.

Как обсуждалось выше, сегодня в диагностической лаборатории in vitro требуются по крайней мере три основных анализатора для осуществления ряда анализов, в которых чаще всего имеется потребность. Такое большое число анализаторов требует затрат, и эти затраты окупаются только тогда, когда пропускная способность образцов в лаборатории является достаточно высокой, чтобы резервное время работы анализатора было как можно меньше. Согласно современной тенденции, наблюдающейся в промышленно развитых странах, система здравоохранения подвергается критическому анализу относительно эффективности затрат. Правительство, выплачивающее компенсацию за расходы в системе здравоохранения, находится в затруднительном положении относительно снижения затрат. Исходя из этой ситуации как клинические лаборатории, так и производители анализаторов и наборов для анализов вынуждены сокращать общую стоимость операций на анализ и осуществлять IVD обслуживание более эффективно. В результате, происходит централизация IVD механически выполняемых работ в больших лабораториях. Однако эта тенденция находится в противоречии с необходимостью интенсивной терапии, терапии в условиях чрезвычайного положения и поликлинического дежурства, где IVD результаты анализа образцов одного больного требуются без промедления. Тенденция к централизации не применима в сельских областях, где расстояния от кабинета врача до центральной больницы являются значительными. Таким образом, кроме тенденции к централизации, существует повышенная потребность в проверке здоровья на местах (РОС) и в распределении IVD анализаторов.

Тенденция к централизации IVD

Тенденция к централизации приводит к тому, что высокопроизводительные IVD-анализаторы устанавливают в центральных лабораториях. Сбор образцов у больных будет происходить либо на местах в отдаленных кабинетах врача, либо в медицинских центрах или в приемной центральной IVD-лаборатории. В первом случае, образцы, взятые у больных, должны быть собраны и транспортированы из отдаленных районов курьером в центральную IVD-лабораторию, в то время как в последнем случае требуется транспортировка самих больных. Очевидно, прямые затраты на проверку оказываются минимальными, когда анализы выполняют партиями в центральной лаборатории с помощью высокопроизводительных анализаторов. Однако структуры здравоохранения обычно фокусируют свое внимание на анализах, требующих прямых затрат и не в состоянии подсчитать косвенные затраты на IVD во всей системе здравоохранения. Часть денег направляют на транспортировку образцов или больных к центральным лабораториям и небольшую часть дают на (i) время ожидания больного, (ii) многочисленные визиты больного и (iii) свободностоящие образцы в неконтролируемых условиях. В незначительном количестве случаев, общая стоимостная структура служб IVD и материально-технического обеспечения принимается во внимание, когда методологию IVD и устройства выбирают власти. Кроме того, изменяемое время ожидания образцов индивидуального больного в неконтролируемых условиях (температура, экспозиция дневного света) неизбежно вызывает изменения в композиции образца, приводящие к ошибочным результатам анализа и ошибочному диагнозу.

Анализы, производимые в пунктах медицинского обслуживания

Платформы для медицинского обслуживания (РОС) предназначены для проверки единичных образцов и характеризуются ограниченным портфелем заказов. Обычно, при проверке единичных образцов в РОС-пунктах используют нестандартные методы анализа, получают качественные или полуколичественные результаты, работают без надзора специалистов в клинической химии и без обращения к базе данных, обычно, РОС-тесты основываются на использовании собранных разовых площадок для анализа. Некоторые из них основаны на иммунохроматографических способах, которые включают в себя хроматографическую среду и зону проверки с иммобилизованным иммунным реагентом. Определение может иметь место визуально или, например, с помощью фотометрического метода, флуорометрического метода, резонанса поверхностного плазмона или электролюминесцентного метода. РОС-тестирование является эффективным. по затратам при ограниченном использовании - 1000-10000 тестов в год. В больших количествах, превышающих 10000 тестов в год, РОС-тесты становятся менее эффективными по затратам вследствие высокой цены на разовый анализ компонента. РОС-устройства являются практичными только в случаях, где немедленно требуются качественные результаты для образцов единичного больного.

Децентрализация средств диагностического тестирования IVD

В противоположность тенденции к централизации, наблюдается явное увеличение необходимости в распределении служб IVD и анализаторов. Под децентрализацией диагностического IVD-тестирования авторы подразумевают осуществление на практике IVD-диагностики с помощью компактных комплексных анализаторов для IVD, которые распределены в помещениях, где образцы берут у больных, таких как местные кабинеты врачей или отдаленные главные медицинские учреждения района. Анализаторы связаны с базой данных центральной лаборатории посредством сети дальней связи. Анализаторы функционируют и за их работой наблюдают специалисты в области клинической химии в центральной лаборатории, таким образом, анализаторы работают подобно химическим датчикам, расположенным близко к больному.

Технология для распределения средств IVD все еще недостаточно развита. До сих пор не имеется какой-либо образцовой и подходящей методологии и коммерчески доступной аппаратуры, которые делали бы децентрализованные анализы IVD-диагностики эффективными по затратам. Это есть одна из главных причин современной тенденции к централизации IVD в промышленно развитых странах. Образцовый анализатор для децентрализованной IVD-диагностики должен выполнять все из наиболее часто требующихся анализов, включающих как клинические анализы, так и чувствительные иммуноанализы, с одним детектором. Для того, чтобы осуществлять эффективные по затратам анализы, анализатор для децентрализованной IVD-диагностики должен выполнять все анализы без разделения, другими словами, без стадий промывки. Такой свободный от разделения формат анализа должен в значительной степени упрощать обращение с жидкостной техникой, таким образом, делая аппарат меньше и менее дорогим для производства. Физический размер анализатора должен быть подходящим для настольного использования. Анализатор должен позволять осуществлять операции в небольших анализируемых объемах. Это вместе с форматом без разделения (без стадий промывки) должно сэкономить реагенты и жидкие расходные материалы, таким образом повышая эффективность по затратам на способ. Работа на анализаторе не должна требовать персонала, обладающего знаниями, необходимыми в клинической лаборатории. Стоимость анализатора не должна быть выше, чем, например, стоимость небольшого анализатора, применяемого в клинической химии, или анализатора, применяемого в иммунологии. Устройство должно включать специализированную программу обработки данных для применений в клинической химии и для количественной оценки анализов и должно осуществлять связь с сетью передачи данных для наблюдения специалистом в центральной лаборатории. Это означает, что анализаторы должны быть распространены в отдаленных местах, где берут образцы, в то время как экспертиза клинической химии, применение результатов анализа, контроль качества и содержания должны быть централизованы. В настоящее время имеется немного коммерчески доступных анализаторов и технологий, которые удовлетворяли бы указанным требованиям. Небольшие анализаторы, применяемые в клинической химии, и анализаторы, применяемые в иммунологии, обычно доступны как отдельные единицы. Некоторые из коммерческих анализаторов, применяемых в клинической химии, осуществляют также иммуноанализы в формате без разделения. Однако указанные иммуноанализы обычно основаны на принципах либо турбидиметрии, либо нефелометрии (анализ агглютинации), которые не позволяют осуществлять высокочувствительные анализы, но ограничиваются анализом компонентов с относительно высокой клинической исходной концентрацией.

Для того чтобы справиться с анализами компонентов с более низкой исходной концентрацией, некоторые производители недавно разработали анализаторы, которые комбинируют клинические анализы с иммунологическими анализами, используя принцип гетерогенного иммуноанализа. Примером такого анализатора является анализатор Adaltis (Adaltis Italia S.p.A, Bologna, Italy), который осуществляет клинический анализ посредством регистрации данных с помощью фотометрии и иммуноанализы посредством регистрации данных с помощью хемилюминесценции. Принцип, на котором основан гетерогенный иммуноанализ, не позволяет, однако, осуществлять анализы без разделения и поэтому не является образцовым для децентрализованной IVD-диагностики. В заключение, рынок сбыта IVD находится в поиске новой инструментальной технологии, которая будет удовлетворять требованиям, обсуждаемым выше.

Одной из самых важных проблем фотометрической методологии является надобность дорогостоящих кювет для испытания. Если анализатор снабжен проточными кюветами, годными к повторному использованию, стоимость кюветы на анализ не составляет проблему. Однако проточные кюветы, годные к повторному использованию, обычно не используют в настоящее время вследствие их чувствительности к анализируемому компоненту и остающемуся реагенту и загрязнению. Таким образом, для большинства коммерческих анализаторов, применяемых в клинической химии, используют разовые фотометрические кюветы. Благодаря природе фотометрической регистрации данных, результат анализа зависит от оптического качества испытуемой кюветы и от длины оптического пути. Указанные требования качества вынуждают создавать высокие промышленные технологии, что делает продукцию кювет дорогостоящей и соответствующие анализы склонными к погрешности вследствие изменений от кюветы к кювете. По этой причине, кюветы для анализов, применяемых в клинической химии, являются и остаются дорогостоящими. Действительно, кювета является главной составляющей затрат на анализы в области клинической химии, которые основаны на фотометрической регистрации данных.

Дополнительная проблема, касающаяся точности фотометрических анализов, связана с помехами, исходящими от матрикса образца. Сыворотка и плазма крови являются типичными образцами, где анализируют метаболиты. Однако образец может содержать мешающие определению матриксные компоненты, такие как билирубин, гемоглобин из гемолизированных эритроцитов, или мутность из-за частиц, липидов. Все указанные субстанции могут сильно мешать фотометрическим измерениям, если образец не разбавлять в большой степени до анализа.

Третья проблема фотометрической регистрации данных относится к анализируемым объемам. Аналитическая чувствительность фотометрической регистрации зависит от длины оптического пути. Чем длиннее оптический путь, тем выше фактор разведения может быть использован. Это повышает диапазон допуска к помехам, создаваемым компонентами матрикса, и точность регистрации. Типичная оптическая длина у коммерческих анализаторов составляет от 5 до 8 мм. В зависимости от геометрии кюветы, эта длина приводит к анализируемому объему 100-300 микролитров. Такая кювета не является оптимальной для иммунологических анализов, поскольку стоимость реагентов для иммуноанализов обычно составляет в десять раз выше стоимости реагентов для клинической химии. Следовательно, анализаторы, применяемые в клинической химии, с фотометрической регистрацией являются относительно крупными по размеру, и для работы с ними требуются скорее большие объемы реагентов и разбавителей. Это свойство повышает затраты на иммуноанализы, и преимуществом маленьких анализируемых объемов нельзя воспользоваться.

Суммируя вышесказанное, авторы заключают, что рынок сбыта средств IVD-диагностики не является достигшим желаемых результатов относительно технологии и анализатора, которые должны способствовать осуществлению обычных клинических анализов и высокочувствительных иммунологических анализов и которые должны выполнять все наиболее часто требующиеся анализы с методологией без разделения в микрообъемах. Кроме того, методология должна сводить к минимуму или исключать необходимость жидкостной обработки, отличной от разбавления и распределения образца. Методология должна способствовать выполнению анализов с высокой точностью путем использования разовых кювет с низкой стоимостью и без необходимости предварительно изготовленных трубок с нанесенным покрытием или другого дорогостоящего компонента анализа. Таким образом, анализатор должен сочетать функции двух больших клинических анализаторов - анализатора для клинической химии и иммуноанализатора, и, таким образом, способствовать осуществлению эффективных по затратам анализов в микрообъемах.

Цель и сущность изобретения

Одной целью настоящего изобретения является разработка улучшенного способа количественной оценки компонентов в области клинической химии, содержащихся в клиническом образце.

Другой целью настоящего изобретения является применение устройства для улучшенной количественной оценки компонентов в области клинической химии, содержащихся в клиническом образце.

Также целью настоящего изобретения является создание улучшенной системы количественной оценки компонентов в области клинической химии, содержащихся в клиническом образце.

Другой целью настоящего изобретения является разработка программы для системы количественной оценки компонентов в области клинической химии, содержащихся в клиническом образце.

Таким образом, настоящее изобретение относится к in vitro диагностическому способу количественной оценки компонента в области клинической химии, содержащегося в клиническом образце, где анализируемый компонент

a) претерпевает химическую реакцию или реакции с реагентом или реагентами, протекающую в одну или нескользко стадий, или последовательность реакций, или

b) катализирует химическую реакцию или реакции, или реакцию в последовательности реакций, реагента или реагентов, в одну или несколько стадий;

в реакционной системе, причем указанная реакция, или реакции, или последовательность реакций приводит к изменению количественно определяемого свойства соединения или соединений указанной реакции, или реакций, или последовательности реакций. Характерным признаком способа является то, что

i) указанная химическая реакция, или реакции, или последовательность реакций приводит к

- образованию соединения с двухфотонной фруоресценцией или

- изменению свойств двухфотонной флуоресценции реакционной системы, включающей в себя по крайней мере одно соединение с двухфотонной флуоресценцией;

и

ii) указанное анализируемое вещество количественно определяют с помощью возбуждения указанного соединения или соединений с двухфотонной флуоресценцией и измерения интенсивности двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции, и соотнесения указанной измеренной интенсивности флуоресценции с методом стандартизации данных, основанным на измерениях, полученных от эталонного материала указанного анализируемого компонента.

Настоящее изобретение также относится к применению флуорометрического устройства, основанного на флуоресценции при двухфотонном возбуждении, для in vitro диагностического количественного определения анализируемого компонента или компонентов в клиническом образце или образцах, где способ указанного количественного определения одного или более указанных анализируемых компонентов включает в себя одну или более химических реакций, приводящих к образованию по крайней мере одного соединения с двухфотонной флуоресценцией, или к изменению свойств двухфотонной флуоресценции реакционной системы, включающей в себя по крайней мере одно соединение с двухфотонной флуоресценцией.

Настоящее изобретение также относится к системе для in vitro диагностического количественного определения по крайней мере одного анализируемого компонента в клиническом образце или образцах. Характерным для системы является то, что она включает в себя

а) флуорометрическое устройство, в котором используется двухфотонно-возбуждаемая флуоресценция для количественной оценки одного или нескольких анализируемых в клинических образцах компонентов, и

b) блок обработки данных с программой для специализированной обработки данных указанной количественной оценки указанного анализируемого компонента или компонентов с помощью указанного флуорометрического устройства, где указанная количественная оценка одного или более указанных анализируемых компонентов включает в себя одну или более химических реакций, приводящих к образованию по крайней мере одного соединения с двухфотонной флуоресценцией или к изменению свойств двухфотонной флуоресценции реакционной системы, содержащей по крайней мере одно соединение с двухфотонной флуоресценцией.

Настоящее изобретение также относится к программному продукту для системы, которая характеризуется тем, что программный продукт содержит средства контролирования блока обработки данных системы определения количества, чтобы осуществлять или контролировать количественное определение анализируемого компонента путем возбуждения соединения или соединений с двухфотонной флуоресценцией, измерения интенсивности двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции и соотнесения указанной измеренной интенсивности флуоресценции с методом стандартизации данных, основанным на измерениях, полученных от эталонного материала указанного анализируемого компонента.

Краткое описание рисунков

Фиг.1 представляет собой пример схемы оптической конфигурации флуорометрического детектора, который основан на двухфотонном возбуждении и используется как измерительное устройство согласно настоящему изобретению.

Фиг.2 представляет собой графическое изображение влияния степени гемолиза на восстановление сигнала однофотонно-возбуждаемой флуоресценции и двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции.

На фиг.3 представлена кривая отклика сигнала и профиль точности анализа билирубина.

На фиг.4 представлена кривая отклика сигнала в анализе билирубина в логарифмической шкале.

На фиг.5 представлены стандартные кривые анализа глюкозы с тремя различными периодами времени инкубации.

На фиг.6 представлена стандартная кривая анализа щелочной фосфатазы.

На фиг.7 представлена стандартная кривая анализа креатинина.

Подробное описание изобретения

Изобретение направлено на разработку технологии и методологии, которые удовлетворяют требованиям, предъявляемым к децентрализованному анализатору для IVD-диагностики, описанной выше. Изобретение относится к применению технологии двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции (ТРЕ) и аппаратуре, применяемой для клинических анализов в области клинической химии. Изобретение основано на удивительном открытии того, что ТРЕ можно применять не только для чувствительных биоаффинных анализов (которые уже были описаны в литературе, как упоминалось выше), но также для анализируемых компонентов, содержащихся в клиническом образце, и изобретение позволяет осуществлять указанные два класса анализов с эффективностью по затратам посредством одного и того же анализатора. Значимость изобретения повышается, если учесть удивительное открытие того, что методология ТРЕ исключительно приемлема к помехам, создаваемым матриксом образца. Матрикс может плохо влиять на анализы, которые основаны на фотометрии и обычной флуоресценции с однофотонным возбуждением. ТРЕ-методология позволяет осуществлять иммунологические анализы и клинические анализы без разделения, в микрообъемах, с помощью разовых кювет низкой стоимости (например, стандартные титрационные микропланшеты). Кюветы с качеством, требуемым для спектрофотометрического определения, в данном случае не требуются. Изобретение в значительной степени способствует снижению общей стоимости клинических анализов, поскольку кювета, имеющая спектрофотометрическое качество, является самым дорогим расходным компонентом типичного клинического анализа. Таким образом, ТРЕ-методология позволяет осуществлять высокочувствительные биоаффинные анализы и клинические анализы с помощью одного прибора с улучшенными техническими характеристиками. ТРЕ-методология также позволяет снизить анализируемые объемы до 10% от объемов, применяемых в обычной практике. ТРЕ-анализатор может быть настольным и не включает в себя никакой жидкостной обработки, отличной от разбавления образца и распределения.

Термины

- Однофотонно-воэбуждаемая флуоресценция: Процесс, который включает в себя линейное поглощение одного фотона флуорофором и последующее ослабление возбужденного состояния, сопровождающееся излучением.

- Двухфотонно-возбуждаемая флуоресценция (ТРЕ): Процесс, при котором хромофор возбуждается при одновременном поглощении двух фотонов с последующим ослаблением возбужденного состояния, сопровождающимся излучением.

- Соединение с двухфотонной флуоресценцией: Соединение, которое может быть возбуждено посредством двухфотонного возбуждения, т.е. путем одновременного поглощения двух фотонов, с последующим ослаблением возбужденного состояния, сопровождающимся излучением.

- Биоаффинные анализы: Общее название для всех биологических анализов, которые основаны на реакциях связывания по сродству, т.е. на реакции, в которой образуются биоаффинные комплексы. Эти анализы включают в себя, например, иммуноанализы и анализы методом гибридизации нуклеиновых кислот. Анализы, которые основаны на химических реакциях, катализируемых ферментами, не являются анализами связывания по сродству.

- Компонент, анализируемый посредством биоаффинного анализа: Общее название для анализируемых компонентов, которые определяют количественно в клинической практике посредством биоаффинных анализов, используя, например, антитела или ДНК зонды в качестве специфического связывающегося по сродству зонда.

- Анализы в области клинической химии: Общее название для количественных анализов, которые включают в себя химическую реакцию, измеренную на регулярной основе в клинической практике, исключая биоаффинные анализы.

- Анализируемый в клиническом образце компонент: Общее название для анализируемых компонентов, которые количественно определяют средствами «анализов, основанных на методах клинической химии».

- Флуорогенный субстрат: Субстрат, который характеризуется либо увеличением, либо уменьшением интенсивности флуоресценции, или изменением длины волны излучения, когда он подвергается реакции, катализируемой ферментом.

- 3SD: Стандартное отклонение, умноженное на коэффициент 3. Указанную функцию постоянно используют для определения нижнего предела регистрации данных.

- Измерение кинетических характеристик: Образец определяют количественно либо при определенной заданной временной точке (или определенных временных точках), или, в качестве альтернативы, если кинетика реакции хорошо охарактеризована и моделирована математически, реакцию можно измерить при любой определенной временной точке (или временных точках) с последующим расчетом конечной ферментативной активности (концентрация в единицах активности), используя кинетическое уравнение, установленное до работы для данного отдельного использования.

- Анализ стандартизации данных: Количественное определение основано на использовании соответствующего эталонного материала для калибровки сигнального ответа, полученного из детектора, в соответствующей анализируемому компоненту концентрации или единицах активности, и на методе специфической ответной информации, обеспеченной производителем наряду с эталонным материалом.

- Химическая реакция. Реакция, где химические или биохимические соединения реагируют с образованием нового соединения или соединений, т.е. реакция, где химическая первичная структура соединения изменяется, или реакция, где изменение химической структуры происходит на уровне ковалентного связывания.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Настоящее изобретение касается in vitro диагностического способа анализа, посредством которого можно определять количественно анализируемые компоненты в клинических образцах (например, кровь, плазма, сыворотка, моча или другие жидкости организма), используя принцип двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции в качестве способа регистрации данных. Анализ осуществляют без разделения.

Типичным способом согласно настоящему изобретению является in vitro диагностический способ количественной оценки анализируемого в клиническом образце компонента, где анализируемый компонент, содержащийся в клиническом образце,

a) претерпевает химическую реакцию или реакции с реагентом или реагентами, или

b) катализирует химическую реакцию или реакции реагента или реагентов;

в реакционной системе, включающей в себя реакцию или реакции в последовательности, где указанная реакция, или реакции указанного анализируемого компонента, или катализируемые реакции приводят к изменению измеряемой характеристики соединения или соединений указанной реакционной системы. Характерным для способа является то, что

i) указанная химическая реакция, или реакции указанного анализируемого компонента, или каталитические реакции приводят к

- образованию соединения, проявляющего двухфотонную флуоресценцию или

- изменению свойств двухфотонной флуоресценции реакционной системы, включающей в себя по крайней мере одно соединение, проявляющее двухфотонную флуоресценцию; и

ii) указанный анализируемый компонент количественно оценивают с помощью возбуждения указанного соединения или соединений, проявляющего двухфотонную флуоресценцию, и измерения интенсивности двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции, и соотнесения указанной измеренной интенсивности флуоресценции с методом стандартизации данных, основанным не на измерениях, полученных от эталонного материала указанного анализируемого компонента.

Предпочтительный способ согласно настоящему изобретению включает в себя стадии:

a) осуществления контакта клинического образца, содержащего анализируемый компонент, со специфическим для анализа реагентом или реагентами;

b) осуществления в реакционной системе химической реакции анализируемого компонента с указанным реагентом или реагентами или осуществления химической реакции или реакций указанного реагента или реагентов, катализируемой анализируемым компонентом;

с) возможно, повтор стадий а) и b) один или несколько раз;

d) указанная реакция или реакции стадии или стадий b) приводят к образованию соединения, проявляющего двухфотонную флуоресценцию, или приводят к изменению характеристик двухфотонной флуоресценции указанной реакционной системы, включающей в себя по крайней мере одно соединение, проявляющее двухфотонную флуоресценцию; и

е) количественной оценки анализируемого компонента путем возбуждения указанного соединения или соединений, проявляющего двухфотонную флуоресценцию, измерения интенсивности двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции и соотнесения указанной измеренной интенсивности флуоресценции с методом стандартизации данных, основанным на измерениях, полученных от эталонного материала указанного анализируемого компонента.

Измерения интенсивности флуоресцентного сигнала, исходящего вследствие двухфотонного возбуждения флуоресценции, выполняли кинетически или по сигналу в конечной точке.

Количественное определение анализируемого компонента или компонентов, содержащегося в клиническом образце, можно осуществлять для нескольких образцов, а также для нескольких анализируемых в образце компонентов путем повторения способа согласно настоящему изобретению для каждого образца и/или анализируемого компонента.

Обычно, анализируемый компонент включает в себя, но не ограничивается альбумином, общим белком, гемоглобином, аммиаком, карбонатом, прямым билирубином, общим билирубином, кальцием, хлоридом, железом, магнием, фосфатом, холестерином ЛВП, холестерином ЛНП, общим холестерином, креатинином, фруктозамином, глюкозой, лактатом, триглицеридами, мочевиной, мочевой кислотой, кислой фосфатазой, щелочной фосфатазой, аланинаминотрансферазой, аспартатам-инотрансферазой, панкреатической амилазой, общей амилазой, холинэстеразой, креатинкиназой, глутамилтрансферазой, глутаматдегидрогеназой, гидроксибутиратдегидрогеназой, лактатдегидрогеназой и липазой.

Флуорометрическое устройство, использующее принцип флуоресценции при двухфотонном возбуждении, может быть использовано, согласно настоящему изобретению, для количественной оценки одного или нескольких анализируемых компонентов, содержащихся в клинических образцах. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения некоторые анализируемые в клиническом образце компоненты, например такие, которые описаны выше, могут быть определены количественно с помощью одного и того же флуорометрического устройства, в котором используется принцип флуоресценции при двухфотонном возбуждении. Обычно по крайней мере 2, предпочтительно 5, более предпочтительно 10, даже более предпочтительно 20 и наиболее предпочтительно все из описанных выше анализируемых в клиническом образце компонентов могут быть последовательно определены количественно с помощью одного и того же устройства. То же флуорометрическое устройство может, конечно, быть использовано для количественного определения анализируемых компонентов биоаффинным методом.

Устройство, которое предполагают использовать согласно изобретению, обычно включает в себя импульсный лазер для двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции с длительностью импульсов излучения короче 10 наносекунд, с частотой повторения импульсов выше 10 кГц, с ТЕМ 00 типом выхода поляризованного луча, со средней мощностью импульсов излучения в образце от 20 до 200 мВт, предпочтительно от 85 до 120 мВт и наиболее предпочтительно приблизительно 100 мВт.

Согласно настоящему изобретению концентрацию анализируемого компонента можно определить количественно с помощью двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции. Обычно, лазер направляют на реакционную суспензию посредством линз объектива, предпочтительно высокой числовой апертуры, и двухфотонно-возбуждаемая флуоресценция генерируется в фокусном объеме (или объемах), собирается из такого же объема (или объемов) и определяется количественно в одном или нескольких каналах длин волн.

Согласно настоящему изобретению интенсивность флуоресценции, обычно, пропорциональна концентрации или активности анализируемого компонента. Ответный сигнал может исходить из анализируемого компонента как такового, или он может исходить от реагента или продукта реакции, концентрация которого либо уменьшается (реагента), либо увеличивается (продукта реакции), как функция концентрации анализируемого компонента. Ответный сигнал может исходить также от продукта реакции или продукта последовательности реакций или каскада реакций, где анализируемый компонент действует как реакционный компонент или катализирует по крайней мере одну из реакций из последовательности реакций или каскада реакций.

В качестве альтернативы, сигнал может исходить от флуоресцентного реагента, испускание от которого поглощается (или гасится) продуктом реакции, где образование указанного продукта реакции является пропорциональным концентрации или активности анализируемого компонента.

Некоторые из способов анализа компонентов, определяемых в клиническом образце, которые первоначально были разработаны для регистрации однофотонно-возбуждаемой флуоресценции, можно применять как таковые или после небольшой модификации в виде регистрации двухфотонно-возбужденной флуоресценции, тогда как некоторые другие способы анализа не являются конструктивными, но требуют больших модификаций для того, чтобы их можно было применять для регистрации двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции. Является ли способ применимым как таковой или требует модификаций, зависит от химических свойств флуорогенного компонента способа анализа.

Изобретение также относится к системе и к программному продукту для осуществления количественного способа. Система включает в себя много элементов из предыдущей известной системы, с помощью которой осуществляют количественный анализ, но блок управления системы контролирует элементы, чтобы обеспечить выполнение количественного способа согласно изобретению. Блок управления системы предпочтительно включает в себя процессор, блок памяти и измерительное устройство. Сигналы из фотоумножителей и возможных других датчиков принимаются и измеряются в измерительном устройстве. Параметры измерения и полученные данные хранятся в блоке памяти. Программа, обеспечивающая работу процессора, также хранится в средствах памяти. Сохраняющий программный продукт включает в себя средства регулирования процессора для осуществления стадий способа количественного определения согласно изобретению. Предпочтительный программный продукт может включать в себя способы регулирования устройства обработки данных, входящего в состав системы осуществления количественного определения, чтобы выполнять или контролировать любую комбинацию одной или более стадий способа согласно изобретению.

Преимущества изобретения

В настоящем изобретении описано применение двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции в качестве способа регистрации данных клинических анализов, отличающееся следующими удивительными преимуществами по сравнению с внедренными способами:

Преимущество 1:

Помехи, создаваемые присутствием матриксных компонентов в образце, таких как гемоглобин (подвергнутая гемолизу сыворотка) или билирубин (т.е. желтуха, билирубинемия), как было показано, в значительной степени меньше с регистрацией данных посредством двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции, чем с фотометрией. Кроме того, такое же преимущество обнаружено, когда регистрацию данных посредством двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции сравнивают с обычной однофотонно-воэбуждаемой флуорометрией. Это преимущество иллюстрировано примером 1, который описывает изучение зависимости интенсивности сигнала флуоресценции от степени гемолиза образца. Результаты указанного исследования представлены графически на фиг.2. На фигуре показано, что увеличение степени гемолиза сопровождается уменьшением сигнала флуоресценции вследствие поглощения гемоглобином. В случае однофотонно-возбуждаемой флуорометрии, увеличение степени гемолиза от 0 до 1,5 г/литр вызывает значительное снижение сигнала флуоресценции, от 100% падает до 55%, в то время как на двухфотонно-возбуждаемую флуоресценцию гемолиз в такой же степени практически не оказывает влияния. Степень гемолиза, 1,5 г/литр, является скорее умеренной и встречается часто в клинической лаборатории. Указанный пример демонстрирует, что анализы клинической химии с регистрацией посредством двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции являются исключительно толерантными к эффектам матрикса, поэтому, регистрация с помощью двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции дает значительно улучшенную точность по сравнению с анализами с регистрацией посредством однофотонно-возбуждаемой флуоресценции. Вообще, анализируемые компоненты клинического образца характеризуются скорее узкой нормированной областью значений. Это означает, что даже незначительное изменение концентрации анализируемого компонента может иметь значительный физиологический эффект или отражать значительное физиологическое нарушение. Для таких анализов требуется высокая точность и аккуратность. С точки зрения аппаратуры, точность 2-3% CV (коэффициент вариации) может быть легко достигнута с помощью различных методов регистрации, таких как фонометрия или однофотонная флуорометрия, но соблюдать точность в такой же области представляет собой основную проблему для современных технологий регистрации данных анализа в клинической химии. Действительно, многие из способов анализа в клинической химии, которые основаны на фотометрии или однофотонно-возбуждаемой флуорометрии, не могут обеспечить удовлетворительную точность для образцов, содержащих матриксный компонент, мешающий определению. Регистрация посредством двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции, описанная в данном изобретении, способствует устранению проблемы относительно точности анализа, поскольку является исключительно устойчивой к влиянию матриксных компонентов, таких как продукты гемолиза сыворотки.

Преимущество 2

Второе преимущество настоящего изобретения относится к кюветам для анализа. Благодаря свойству двухфотонно-возбуждаемой флуорометрии, интенсивность сигнала флуоресценции не зависит от длины оптического пути или от общего объема кюветы. Вместо этого, ТРЕ-флуоресценция генерируется только в фокусном объеме пучка с дифракционной расходимостью, который располагается в нескольких сотнях микрометров от тыльной поверхности окна кюветы. Флуоресцентный сигнал собирается от того же пучка с дифракционной расходимостью посредством таких же линз объектива (эпифлуоресцентная регистрация). Таким образом, этот формат возбуждения исключает необходимость иметь кюветы с точной оптической длиной и способствует использованию разовых кювет для анализа с низкой стоимостью, таких как стандартные микротитрационные планшеты. Это преимущество иллюстрируется в примере 2, который описывает изучение влияния оптического качества окна кюветы для анализа на точность измерения флуоресценции. Результаты (таблица 1) показывают, что оба микротитрационных планшета, один с донным окном из высококачественного оптического стекла и другой с донным окном из необработанной полимерной пленки, проявляют практически равную точность сигнала (<2% CV). Этот пример указывает на то, что двухфотонно-возбуждаемая флуоресценция способствует использованию стандартных кювет с низкой стоимостью без нарушения точности анализа. Следовательно, способ регистрации ТРЕ исключает необходимость в дорогостоящих кюветах высокого оптического качества и способствует проведению более рентабельных анализов в клинической химии, чем способы предыдущего уровня техники, основанные на фотометрии или однофотонно-возбуждаемой флуорометрии.

Преимущество 3

Третье преимущество настоящего изобретения относится к анализируемым объемам. Поскольку уровень сигнала ТРЕ не зависит от анализируемого объема, регистрация посредством ТРЕ позволяет снизить анализируемые объемы, не влияя на эффективность анализа. Обычные анализируемые объемы в современной практике клинической химии составляют от 100 до 200 мкл. С регистрацией посредством ТРЕ анализируемые объемы можно без труда снизить до 10 мкл или даже ниже. Такое уменьшение анализируемого объема обычно сопровождается снижением расхода реагента и стоимости. Этот аспект усиливает экономическую эффективность способа регистрации с помощью ТРЕ.

Преимущество 4

Четвертое преимущество настоящего изобретения заключается в более высокой чувствительности регистрации посредством ТРЕ по сравнению с фотометрией. Самый нижний предел регистрации ТРЕ микрофлуорометра (смотри пример 1) для флуорофора в водном буферном растворе, такого как флуорофор ArcDia BF560 в сыворотке, составляет около 100 рМ (10^-10 моль/литр), в то время как фотометрия (длина пути = 5-8 мм) позволяет регистрировать такое же соединение (коэффициент молярной абсорбции 80000 M ^-1·см^-1) в концентрации 100 нМ (10 ^-7 моль/литр). Таким образом, разница в пределах регистрации двух способов регистрации составляет три порядка величин. Что касается анализов в клинической химии, разница в пределах регистрации, вероятно, является меньше, в пользу ТРЕ, из-за ограничений, являющихся результатом кинетики реакции способов анализа. Так как анализируемые в клиническом образце компоненты обычно существуют скорее в высоких концентрациях, предел регистрации при фотометрии обычно является весьма удовлетворительным. Однако более низкий предел имеет преимущество, когда образец содержит мешающий определению матриксный компонент. При увеличении разведения образца, на способ регистрации ТРЕ матриксный компонент влияет в меньшей степени, таким образом, такой способ обеспечивает большую точность анализа.

Преимущество 5

Пятое преимущество настоящего изобретения проистекает вследствие того факта, что анализаторы, применяемые в клинической химии, основанные на детекции ТРЕ, дают возможность проводить высокочувствительные иммунологические анализы в формате без разделения. Прототип такого анализатора в настоящее время сконструирован, и его использование для осуществления высокочувствительных биоаффинных анализов продемонстрировано. Таким образом, способ детекции ТРЕ позволяет разработать анализатор, который будет удовлетворять всем требованиям, подходящим для успешного функционирования анализатора, предназначенного для децентрализованной IVD-диагностики, (i) путем осуществления как анализа в клинической химии, так и чувствительных: иммуноанализов с одним и тем же регистрирующим устройством, (ii) посредством обеспечения типа анализа без разделения, (iii) с помощью разработки простой конструкции компактного анализатора настольного типа, (iv) допуская проведение анализов с уменьшенными реакционными объемами, (v) с помощью проведения автоматизированных операций после «ручной» загрузки образца (в данном случае, персонал со специальным опытом в клинической химии не требуется), (vi) путем обеспечения связи с сетью передачи данных для наблюдения экспертом в центральной лаборатории, (vii) посредством осуществления анализов с повышенной рентабельностью по сравнению с самыми современными способами.

Подробное описание фигур

Фиг.1

Фиг.1 представляет собой пример схемы оптической конфигурации флуорометрического детектора, который основан на двухфотонном возбуждении и используется как измерительное устройство согласно настоящему изобретению. Конструкция может различаться в зависимости от отдельного использования и области применения. Обычно элементы характеризуются следующим образом.

- Кювета является одноразовой кюветой или микротитрационным планшетом, включающим оптическое нижнее окно. Различные микрожидкостные чипы (технология, основанная на лабораторных чипах) также могут быть использованы.

- Линзы являются линзами объектива микроскопа с числовой апертурой минимум 0,5.

- Сканер является двухмерным пьезодвижущимся сканером, способным остановить сканирование мгновенно, если микрочастица находится вблизи фокусного пучка.

- Лазером является импульсный лазер с ближним инфракрасным спектром с длиной волны излучения короче 10 наносекунд, с частотой повторения импульсов выше 10 кГц и средней мощностью импульсов излучения от 10 до 100 мВт, с ТЕМ 00 типом выхода поляризованного пучка. Типичным лазером является микрочип-лазер на Nd:YAG или Nd:LBS с пассивной модуляцией добротности.

- Вр является фильтром для пропускания полос.

- M1 и М2 являются зеркалами для отражения луча.

- BS является расщепляющим пучок устройством.

- РН представляет собой отверстие.

- SD является детектором, рассеивающим свет, работающим при выходной длине волны лазера.

- DM1-DM3 являются дихроичными зеркалами.

- PD представляет собой фотодиод для мониторинга лазерного импульса.

- М3 является зеркалом.

- F1-F2 представляют собой интерференционные светофильтры, оптимально настроенные на длину волны эмиссии меченого реагента.

- СРМ1-СРМ3 являются фотоумножителями для однофотонного счета.

- Блок управления, включающий:

- измерительное устройство для получения сигналов из датчиков /фотоумножителей,

- процессор для контролирования элементов системы для осуществления количественного способа согласно изобретению,

- блок памяти для хранения результатов измерений и других данных анализа и программы, реализованной программно, для работы процессора.

Фиг.2

На фиг.2 показано влияние степени гемолиза на возвращение сигнала однофотонно-возбуждаемой флуоресценции (треугольник) и двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции (квадрат).

Фиг.3

На фиг.3 представлена кривая сигнального ответа (квадрат) и соответствующего профиля точности (треугольник) метода анализа билирубина. Величины точности даны в единицах коэффициента вариаций (CV%).

Фиг.4

На фиг.4 представлена кривая сигнального ответа метода анализа билирубина в логарифмической шкале. 3SD уровень отрицательного контроля также представлен (горизонтальная линия).

Фиг.5

На фиг.5 представлены стандартные кривые метода анализа глюкозы с тремя различными периодами времени инкубации. На фигуре также показан уровень 3SD отрицательных контрольных образцов.

Фиг.6

На фиг.6 представлена стандартная кривая метода анализа щелочной фосфатазы. Ордината (наклон) рассчитана, исходя из изменения интенсивности флуоресценции как функции времени, и она соответствует ферментативной активности образца.

Фиг.7

На фиг.7 представлена стандартная кривая для креатинина. Пересечение стандартной кривой и линии для 3SD отрицательных контрольных образцов (горизонтальная пунктирная линия) дает предел детектирования для данного метода анализа.

ПРИМЕРЫ

Изобретение иллюстрируется примерами 1-15 следующим образом, однако, применения в случаях, где настоящее изобретение доказало преимущества, не ограничиваются указанными примерами.

Пример 1

Влияние гемолиза на интенсивность сигнала однофотонно-возбуждаемой флуоресценции и двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции

Бычий сывороточный альбумин (БСА) подвергали мечению флуоресцирующим реагентом, ArcDia BF560 (Arctic Diagnostic Oy, Turku, Finland) с получением конъюгата метка-БСА со степенью замещения 2, 7. Конъюгат разбавляли раствором гемоглобина (вариабельная концентрация гемоглобина, трис 50 мМ, NaCl 150 мМ,

NaN₃ 10 мМ, твин 20 0,01%, БСА 0,5%, рН 8,0) до концентрации 100 нМ. Этот раствор распределяли в лунки микротитрационного планшета либо 384-луночного типа (Greiner BIO-One GmbH, Code: 788096, µClear SV-plate, 2^nd Gen, с черными стенками и дном из полимерной пленки), либо 96-луночного типа (Greiner BIO-One GmbH, Code 655096) в количествах 10 и 100 мкл соответственно. Количественное определение с 96-луночным планшетом осуществляли с помощью обычного однофотонно-возбуждаемого флуорометра (Ascent, Thermo Electron Oy, Vantaa, Finland), используя фильтр для возбуждения 530 нм и фильтр для эмиссии 590 нм. Количественное определение с 384-луночным планшетом осуществляли с планшетом-ридером ArcDia TPX Plate Reader (Arctic Diagnostic Oy, Turku, Finland), прототипом микрофлуорометра, специально сконструированного для измерения флуоресценции с поверхности индивидуальных микрочастиц согласно принципу биоаффинных анализов ArcDia TPX [Hänninen et al., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 548]. Прибор, используемый в данном исследовании, представляет собой модификацию системы, которая недавно была описана подробно исследователем Soini et al. (Rev. Sci. Instr. 2002, 37, 7, 2680). С помощью планшета-ридера можно измерять образцы в стандартных микротитрационных планшетах. Он снабжен функцией автоматической фокусировки для точного расположения лазерного пучка в образце, находящегося в лунке микротитрационного планшета, и длинным рабочим расстоянием объектива для облегчения считывания из микролунок различной толщины дна. Схема оптической конфигурации прибора показана на фиг.1. Микрочип -лазер на Nd:YAG с пассивной модуляцией добротности, с накачкой светодиодами LASER (NanoPulse NP-07014-400, Nanolase, Meylan France) использовали в качестве источника света для флуоресценции при двухфотонном возбуждении. Лазер генерирует импульсы с длительностью в наносекундах при 1064 нм с 17 кГц частотой повторения импульсов. Падающий лазерный пучок сфокусирован через дно микролунки планшета в образец с помощью линз объектива микроскопа (Lens, Leica C-Plan 63х/0,75, Leica Microsystems, Bensheim, Germany). Средняя мощность импульсов излучения лазера сфокусированного лазерного пучка составляет ~40 мВт. Сигнал двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции направлен через дихроичное зеркало DM1 и фильтруется с помощью дихроичного зеркала DM2 кг фильтра полосы пропускания F1 и записывается с помощью фотоумножителя СРМ1 в области длин волн 535-600 нм. Сигналы флуоресценции трех повторных образцов были усреднены и нормализованы, представлены как функция концентрации гемоглобина на фиг.2, где показано значительное влияние гемоглобина на сигнал однофотонно-возбуждаемой флуоресценции, в то время как в случае двухфотонно-возбуждаемой флуоресценции наблюдалось только слабое влияние. Полученные результаты свидетельствуют о том, что способ детектирования ТРЕ дает значительно большую точность анализа, чем способы, основанные на однофотонно-возбуждаемой флуоресценции.

Пример 2

Влияние материала кюветы на точность определений между кюветами

Мышиные моноклональные антитела подвергали мечению флуоресцентной меткой ArcDia BF 560-SE (Arctic Diagnostics Oy, Turku, Finland) согласно стандартному протоколу [M.E.Waris et al. Anal. Biochem. 309 (2002), 67-74] с получением конъюгата со степенью замещения 3,2 метки на IgG. Конъюгат разбавляли буфером (трис 50, NaCl 150 mm, NaN₃ 10 мМ, БСА 0,5%, твин 20 0,01%, рН 8,0) до концентрации 50 нМ и распределяли в лунки двух различных микропланшетов 384-луночного типа. Один из микропланшетов был стандартным микропланшетом низкой стоимости с донным окном из полимерной пленки (Greiner BIO-One GmbH, Code: 788096, µClear SV-plate, 2^nd Gen, с черными стенками и дном из полимерной пленки), в то время как другой планшет был специальным планшетом с донным окном, сделанным из высококачественного оптического стекла (Greiner, SensoPlateTM 96 Well). Образцы измеряли посредством двухфотонно-возбуждаемого микрофлуориметра (ArcDia TPX Plate Reader, описанного в примере 1) в восьми параллельных образцах, используя время интегрирования 10 секунд на лунку. Изменения между кюветами рассчитывали в единицах коэффициента вариации. Полученные результаты показывают (таблица 1), что два различных планшета дают сравнимую точность измерений между кюветами.

Таблица 1
Точность ТРЕ измерений при использовании (i) кювет из высококачественного оптического стекла и (ii) кювет с оптической стенкой из полимерной пленки
Планшет из полимерной пленки	Планшет из оптического стекла
Кювета №	Сигнал	CV (%)	Кювета №	Сигнал	CV (%)
1	63,0	0, 95	1	66,1	0,81
2	64,0		2	67,2
3	63,3	3	67,5
4	64,4	4	66,8
5	63,2	5	66,8
6	64,7	6	67,2
7	63,8	7	67,0
8	63,6	8	66,0

Пример 3

Анализ общего билирубина

Анализ общего билирубина осуществляли по модифицированному протоколу анализа общего билирубина Sigma Diagnostics^® (процедура по 605), который основан на реакции между билирубином и солями диазония. Процедура анализа по 605 была выполнена за исключением того, что добавление реагента щелочного тартрата не производили. Билирубин растворяли в смеси, содержащей 1 часть диметилсульфоксида и 2 части карбоната натрия (100 мМ, водн.), и далее разбавляли буфером (бычий сывороточный альбумин 40 г/л, трис 100 мМ, рН 7,4) с получением билирубиновых стандартов 2, 5, 10, 15 и 20 мг/дл. Стандартный образец билирубина в количестве 2 мкл помещали в кювету для анализа (384-луночный планшет, Greiner BIO-ONE GmbH, Code: 788096), далее добавляли раствор кофеина (10 мкл, кофеин 25 г/л, бензоат натрия 38 г/л, в растворе NaAc, code 605-2, Sigma) и раствор диазореагента (5 мкл, сульфаниловая кислота 1,25 мМ, NaNO₂ 1 мМ, НСl 0,05 M). Смесь хорошо перемешивали с последующим добавлением цистеинового реагента (1 мкл, code 605-6, Sigma, реконструированного с помощью 10,5 мл H₂O). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 мин при комнатной температуре. Флуоресценцию, исходящую из образца, собирали в области 630-660 нм с помощью микрофлуориметра с двухфотонным возбуждением (ArcDia TPX Plate Reader, описанного в примере 1), используя время интегрирования 10 секунд. Флуоресцентный сигнал имел место как функция стандарта билирубина, как показано на фиг.3 и 4 (т.е. стандартная кривая).

Пример 4

Анализ глюкозы

Флуорометрический анализ глюкозы основан на двух последовательных ферментативных реакциях. Первая, глюкоза окисляется молекулярным кислородом в присутствии глюкозооксидазы. В результате реакции образуются глюконолактон и перекись водорода. На следующей, второй реакции, флуорогенный реагент, Amplex Red , окисляется перекисью водорода в присутствии фермента пероксидазы хрена (HRP) с получением флуоресцентного продукта "резоруфина". Процедура реакции была следующая: стандартный исходный раствор глюкозы приготовляли путем растворения 0,198 г моногидрата D- (+)-глюкозы в 10 мл буфера для анализа (NaH ₂PO₄ 10 мМ, NaCl 150 мМ, рН 6,2). Исходный раствор затем разбавляли буфером с получением стандартов глюкозы различных концентраций. Коктейль с реагентом для анализа приготовляли путем смешивания, в равных объемных отношениях, глюкозооксидазы (6 Е/мл, Sigma G-7016), HRP (300 мЕ/мл, Sigma Р8375) и Amplex Red (75 PM, Molecular Probe A-12222). Коктейль с реагентом использовали без промедления. Коктейль с реагентом для анализа (75 мкл) распределяли по лункам для анализа (96-луночный планшет Greiner BIO-One GmbH, cat. No GRE 655096) и добавляли стандартный образец (75 мкл). Пробы инкубировали в течение различных периодов времени (15 мин, 30 мин и 1 ч) при 32°С и затем производили измерения в определенные периоды времени посредством микрофлуориметра с двухфотонным возбуждением (ArcDia ТРХ Plate Reader, описанный в примере 1), используя время интегрирования 10 секунд. Сигнальный ответ и точность анализа, сравненные между кюветами, представлены на фиг.5 и в таблице 2 соответственно.

Таблица 2
Точность анализа глюкозы, сравненная между кюветами
Глюкоза (мкМ)	15 мин	Время инкубации 30 мин	1 ч
1	4%	4%	2%
3	3%	3%	3%
10	2%	1%	1%
30	1%	1%	0,02%
100	1%

Пример 5

Анализ амилазы

Для анализа амилазы, -1,4-олигосахарид подвергали мечению флуорофором и гасящим агентом относительно восстановительного конца и невосстановительного конца соответственно. Образованный конъюгат демонстрировал снижение испускания флуоресценции по сравнению с испусканием свободного флуорофора вследствие близости гашения фрагментом гасящего агента. Конъюгат функционирует как субстрат для фермента амилазы и, таким образом, может быть использован для определения активности амилазы в клинических образцах. В присутствии амилазы, конъюгат олигосахарида расщепляется. Таким образом, флуорофор и гасящий агент расщепляются на части, что приводит к менее эффективному гашению и повышению определяемого флуоресцентного испускания.

Пример 6

Анализ щелочной фосфатазы

Анализ щелочной фосфатазы (ALP, ЕС 3.1.3.1) можно осуществить с помощью флуорогенного субстрата, гидролиз которого ферментом щелочной фосфатазой приводит к повышению флуоресценции. Повышение флуоресценции как функции времени (=наклон) является пропорциональным активности анализируемого компонента. В данном примере, анализ осуществляли с использованием DDAO-фосфата (Molecular Probes, D-6487) в качестве флуорогенного субстрата. Анализ выполняли следующим образом: исходный раствор ALP приготовляли путем растворения 0,54 мг лиофилизированной щелочной фосфатазы (Р-5931, Sigma, 42 Е/мг) в 0,54 мл воды. Исходный раствор ALP далее разбавляли раствором 1,0 мМ MgCl₂ с получением стандартных растворов ALP с различными концентрациями. Исходный раствор DDAO-фосфата приготовляли путем растворения 1,11 мг DDAO-фосфата в 0,525 мл N,N-диметилформамида. Реагент для анализа приготовляли путем разбавления 66 мкл исходного раствора DDAO-фосфата 7,36 мл глицинового буфера (100 мМ глицин, 1,0 М MgCl₂, 1,0 мМ ZnCl₂, pH 10,4). Реагент для анализа (75 мкл) распределяли по лункам (96-луночный планшет Greiner BIO-One GmbH cat. No. GRE-655096) с последующим добавлением стандартного образца ALP (7,5 мкл). Реакционную смесь инкубировали при 32°С и флуоресценцию измеряли кинетически посредством микрофлуориметра с: двухфотонным возбуждением (ArcDia TPX Plate Reader) с интервалами 5 мин при времени интегрирования 15 сек.

На основании кинетических данных было рассчитано увеличение интенсивности флуоресценции как функции времени (=наклон) для каждого стандартного образца, и результаты представлены на фиг.6.

Пример 7

Анализ креатинина

Данный метод анализа креатинина основан на использовании различных ферментов и двухстадийного протокола анализа. На первой стадии креатин метаболизирует посредством трех последовательных катализируемых ферментами реакций (креатиназа, саркозиноксидаза, каталаза). За удалением креатина следует вторая стадия, где креатинин анализируют посредством четырех последовательных реакций, катализируемых ферментами (креатининаза, креатиназа, саркозиноксидаза и пероксидаза хрена). Каскад реакций приводит к образованию флуоресцентного конечного продукта "резоруфина".

Стандартный раствор креатинина (10 микролитров, в буфере, содержащем 10 мМ NaH₂PO₄, 150 мМ NaCl, титрован до рН 8) распределяли по лункам (384-луночный планшет от Greiner BIO-ONE, cat. No. GRE 7810966) и далее добавляли 5 мкл реагента 1 для анализа (содержащего саркозиноксидазу 80 кЕ/л, креатиназу 140 кЕ/л, пероксидазу хрена 20 кЕ/л, раствор каталазы 200 кЕ/л). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин. Затем в лунки распределяли по 5 мкл реагента 2 для анализа (содержащего креатининазу 60 кЕ/л, Amplex Red 300 мкМ). Реакционную смесь инкубировали в течение 15 мин и измеряли флуоресценцию с помощью планшет-ридера ArcDia TPX Plate Reader (Koskinen J.O. et al., 2004, Anal. Biochem. 328, 210-218), используя режим измерения раствора и время интегрирования 10 сек. Результаты представлены на фиг.7.

Пример 8

Анализ креатинкиназы

Креатинкиназа катализирует реакцию между креатинфосфатом и АДФ (ADP) с образованием креатина и АТФ (АТР). Метод анализа креатинкиназы основан на определении перекиси водорода после превращения креатина с добавлением креатиназы и саркозиноксидазы. Последовательность реакций приводит к высвобождению перекиси водорода, которую измеряют стандартным методом с использованием флуорогенного субстрата "Ampiex Red" и пероксидазы хрена в качестве катализатора.

Пример 9

Анализ аланиламинотрансферазы (ALAT)

Метод анализа аланинаминотрансферазы основан на определении пирувата после превращения L-аланина и 2-оксоглутарата до пирувата и L-глутамата. Далее, пируват взаимодействует с фосфатом с помощью катализатора пируватоксидазы с образованием ацетилфосфата, перекиси водорода и двуокиси углерода. В конце концов, перекись водорода измеряют стандартным методом с использованием флуорогенного субстрата "Amplex Red" и пероксидазы хрена в качестве катализатора.

Пример 10

Анализ аспартатаминотрансферазы (ASAT)

Аспартатаминотрансфераза катализирует превращение L-аспартата и 2-оксоглутарата в оксалоацетат и L-глутамат. Далее, оксалоацетат превращается в пируват при добавлении оксалоацетатдекарбоксилата. Далее, пируват взаимодействует с фосфатом, реакцию катализирует пируватоксидаза с образованием ацетилфосфата, перекиси водорода и двуокиси углерода. В конце реакции, перекись водорода измеряют стандартным методом, используя флуорогенный субстрат "Amplex Red" и пероксидазу хрена в качестве катализатора.

Пример 11

Анализ кальция

Кальций определяли количественно с помощью специфических агентов, хелатирующих кальций, способом, который характеризуется повышением эффективности флуоресценции или изменением длины волны испускания при образовании комплекса с ионами кальция.

Пример 12

Анализ общего холестерина

Вначале сложные эфиры холестерина образца превращаются в холестерин и жирные кислоты при добавлении холестеринэстеразы. Затем, холестерин превращается в холест-4-ен-3-он с помощью реакции, катализируемой холестериноксидазой. Указанное превращение сопровождается освобождением перекиси водорода, которую определяют количественно стандартным методом, используя флуорогенный реагент "Amplex Red" в качестве субстрата, пероксидазу хрена в качестве катализатора, и детектирование производят с помощью флуорометра с двухфотонным возбуждением.

Пример 13

Анализ холестерина ЛВП

Фракции липопротеина, отличные от фракции ЛВП, блокируют путем добавления блокирующих реагентов ( -циклодекстрин и Mg²⁺). Фракцию холестерина ЛВП превращают в холест-4-ен-3-он при добавлении фермента холестериноксидазы с повышенной специфичностью к холестерину ЛВП. Указанное превращение сопровождается: освобождением перекиси водорода, которую количественно определяют стандартным методом, используя флуорогенный реагент "Amplex Red" в качестве субстрата, пероксидазу хрена в качестве катализатора, и детектирование производят с помощью флуорометра с двухфотонным возбуждением.

Пример 14

Анализ триглицеридов

Триглицериды гидролизуются при добавлении липазы с образованием жирных кислот и глицерина. Затем, глицерин фосфорилируется путем обработки АТФ и глицеролкиназы с образованием глицерол-3-фосфата и АДФ. В конце концов, глицерол-3-фосфат окисляется посредством О ₂ с добавлением глицеролфосфатоксидазы с образованием дигидроксиацетонфосфата и перекиси водорода. Перекись водорода количественно определяют стандартным методом, используя флуорогенный реагент "Amplex Red" в качестве субстрата, пероксидазу хрена в качестве катализатора, и детектирование производят с помощью флуорометра с двухфотонным возбуждением.