способ диагностики кровепаразитарных инфекций

Формула изобретения

1. Способ диагностики кровепаразитарных инфекций, включающий забор крови, предварительное центрифугирование, нанесение донной части эритроцитов в форме капли на предметное стекло, формирование мазка с помощью стекла, ширина которого в 2 раза уже, чем предметное стекло, фиксирование мазка на стекле, сушку на воздухе, окрашивание мазка красителем, отмывание мазка от избытка красителя, сушку мазка после окрашивания на воздухе и последующее исследование крови с помощью оптической микроскопии с иммерсией, отличающийся тем, что кровь предварительно центрифугируют при 3500-5000 об/мин., наносят на 2 отдельных стекла по 3,3 мкл плазмы крови, при этом на первое стекло к плазме добавляют 1,7 мкл эритроцитов, взятых из верхней фракции крови, а на второе - 1,7 мкл эритроцитов, взятых из нижней фракции крови, и при выявлении эндоглобулярных включений вишнево-сиреневого цвета в эритроцитах, пораженных сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов диагностируют кровепаразитарную инфекцию.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрированный раствор красителя перед использованием фильтруют через бумажный фильтр или фильтровальную бумагу.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что мазки сушат в потоке холодного воздуха с использованием фена.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что краситель с мазков смывают дистиллированной водой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области гуманитарной и ветеринарной медицины и предназначено для лабораторной диагностики кровепаразитарных инфекций у человека, сельскохозяйственных и мелких домашних животных.

Для диагностики кровепаразитарных инфекций (гемоспоридиозов) в гуманитарной и ветеринарной медицине используют цитологический метод (окрашивание мазков по Романовскому-Гимза или Райту-Гимза), метод полимеразной цепной реакции (PCR), биопробу на лабораторных животных, например на золотистых хомячках, и серологические методы диагностики: реакция связывания комплемента (РСК или CFT-complement fixation test), реакцию непрямой иммунофлуоресценции (IFAT-indirect fluorescent antibody test), конкурентное ингибирование - энзим-связывающий иммуносорбентный метод (CI-ELISA - competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbemt assay) [1-5].

Недостатком вышеперечисленных серологических способов диагностики при клиническом проявлении заболевания являются ограниченные временем периоды для постановки реакций, трудоемкость и дороговизна, а также отсутствие полной воспроизводимости результатов несколькими методиками. Во многих лабораториях отсутствует оборудование и реактивы, а также квалифицированный персонал для постановки сложных современных методик, таких как PCR-анализ (метод определения ДНК полимеразной цепной реакцией). Биопроба на лабораторных животных продолжительна по времени - 6 недель; РСК - в свежих случаях (на ранних стадиях) заболевания отрицательна, активна через 2-3 недели после заболевания, после чего титр падает и через 3 мес. практического значения уже не имеет [5]; IFAT - дает положительные результаты через 7-10 дней после начала заболевания, CI-ELISA - разработан только для крупного рогатого скота. Цитологические методы окраски нативной крови по Романовскому-Гимза или Райту-Гимза неинформативны при низкой паразитемии.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ диагностики кровепаразитарных инфекций [6], включающий следующие последовательные стадии.

Производят забор 5 мл венозной крови с последующим центрифугированием при 1000-3000 об/мин в течение 10-15 мин и отбором в отдельную пробирку 6-10 мкл плазмы крови и 3-5 мкл концентрированной донной части осадка и тщательным перемешиванием. Из полученной взвеси готовят 2-3 мазка (по 5 мкл на стекло) специальным шлифованным стеклом, ширина которого в два раза уже, чем предметного стекла, и сушат на воздухе до высыхания 2-3 мин. Мазки фиксируют в метаноле 10 мин и сушат на воздухе 5 мин, окрашивают 20% раствором стандартного красителя азур-эозина рН 5.0 в течение 15-30 мин, промывают под проточной водопроводной водой и отмывают от избытка красителя метиленового азура в ванночке с дистиллированной водой в сменных водах 15-20 мин, после чего сушат на воздухе 15-20 мин. Микроскопию мазков проводят в проходящем свете с иммерсией. Поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляют от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами и далее по верхнему и нижнему краям мазка. При выявлении эндоглобулярных включений вишнево-сиреневого цвета в эритроцитах оранжевого цвета диагностируют кровепаразитарное заболевание.

Затраты времени на выявление кровепаразитарных инфекций при микроскопии мазка крови составляют от 3 до 10 минут. Общее затраченное время на диагностику составляет от 75 до 115 мин.

Способ прост и не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, но у него есть ряд недостатков. Не всегда можно сделать забор 5 мл крови, особенно у больных особей и мелких животных. Использование плазмы в количестве 6-10 мкл и 3-5 мкл концентрированной донной части осадка с приготовлением 2-3 мазков по 5 мкл на стекло существенно увеличивает затраты на лабораторное оборудование (пробирки) и время приготовления и исследования самих мазков. Кроме того, не учитываются эритроциты в начальной фазе инфицирования бабезиями или пораженные мелкими видами паразита (около 0.1-0.5 мкм), которые легче и имеют более высокий заряд мембраны, поэтому не оседают, а находятся в верхней фракции крови. Использование нефильтрованного концентрированного раствора красителя может приводить к выпадению крупных частиц краски на мазок, что существенно усложняет процедуру последующего исследования мазка крови. Сушка мазков на воздухе и при повышенной влажности занимает дополнительное время, поэтому сушить мазки проще и быстрее феном с потоком холодного воздуха.

Технической задачей изобретения является повышение точности диагностики и сокращение времени на анализ.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Производят забор 0.5-1.5 мл крови в шприц или пробирку с антикоагулянтом. Исследуемую кровь центрифугируют 5-10 мин при 3500-5000 об/мин, на два предметных стекла наносят в форме капли по 3.3 мкл плазмы крови. На одно из них добавляют 1.7 мкл эритроцитарной массы, взятой из пограничного слоя с плазмой (верхняя фракция крови), а на другое - 1.7 мкл эритроцитарной массы, взятой из нижней фракции крови. Капли на стекле тщательно перемешивают, что позволяет сохранить вязкость нативной крови (соотношение 2 к 1) и существенно увеличить в мазках количество пораженных бабезиями эритроцитов. Получают 2 мазка (по 5 мкл на стекло). Мазки делают специальным шлифованным стеклом, ширина которого в два раза уже, чем предметного стекла, и сушат на воздухе. Затем мазки фиксируют в метаноле и сушат в потоке холодного воздуха с использованием фена. Далее мазки окрашивают 20% раствором стандартного красителя азур-эозина (по Романовскому-Гимза) рН 5.0, причем концентрированный краситель перед использованием фильтруют через бумажный фильтр или фильтровальную бумагу для удаления из него нерастворенных частиц краски. Мазки промывают дистиллированной водой, чтобы на мазок не оседали соли из водопроводной воды, и отмывают от избытка красителя метиленового азура в ванночке с дистиллированной водой в сменных водах. Далее мазки сушат в потоке холодного воздуха с использованием фена. Микроскопию мазков проводят в проходящем свете с иммерсией. Поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляют от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами, и далее по верхнему и нижнему краям мазка. При микроскопии эритроциты имеют оранжевый цвет, а эндоглобулярные включения имеют вишнево-сиреневый цвет, в отдельных трофозоитах выделяется контурированное ядро. При выявлении эндоглобулярных включений вишнево-сиреневого цвета в эритроцитах желтого цвета диагностируют кровепаразитарную инфекцию.

Затраты времени на выявление кровепаразитарных инфекций при микроскопии мазка крови составляют от 3 до 5 минут. Суммарное время на диагностику предлагаемым способом составляет от 55 до 68 минут.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

- исследуемую кровь предварительно центрифугируют при 3500-5000 об/мин, что позволяет в два раза сократить время на данную стадию и за 5-10 мин быстро осадить на дно пробирки большинство пораженных эритроцитов с бабезиями, занимающими большую часть объема клетки;

- после центрифугирования наносят в форме капли на два предметных стекла по 3.3 мкл плазмы крови, на одно из них добавляют 1.7 мкл эритроцитарной массы из верхней фракции крови, а на другое - 1.7 мкл эритроцитарной массы из нижней фракции крови и тщательно перемешивают, что позволяет сохранить вязкость нативной крови (соотношение 2 к 1) и существенно увеличить в мазках количество пораженных бабезиями эритроцитов.

Концентрированный краситель перед использованием, в частном случае, фильтруют через бумажный фильтр или фильтровальную бумагу для удаления из него нерастворенных частиц красок.

Краситель с мазков смывают, преимущественно, дистиллированной водой, что позволяет избежать выпадения нерастворимых солей железа, кальция и магния на мазок при использовании водопроводной воды.

Принцип диагностики построен на том факте, что эритроциты, пораженные внутриэритроцитарными паразитами (бабезиями, малярийным плазмодием, анаплазмами и другими гемоспоридиозами), имеют скорость оседания больше за счет снижения заряда мембраны эритроцитов [7], чем у нормальных непораженных эритроцитов. В крови образуются конгломераты (адгезированные эритроциты) за счет выброса гемоспоридиями на мембрану эритроцитов цитоадгезивных лигандов [8], поэтому при центрифугировании их можно легко осадить. Эритроциты с ранними стадиями развития гемоспоридий и кольцевидными формами паразитов поднимаются наверх, к слою клеток белой крови, граничащих с плазмой. Мазок, приготовленный из верхней фракции эритроцитов, значительно повышает точность прямого определения паразита в крови. Если паразитемия в нативной крови низкая (1 пораженный эритроцит на 20-100 мкл и более), то при исследовании 5 мкл нативной крови можно получить ложноотрицательный результат. Более того, пораженная кровь из-за наличия цитоадгезивных лигандов по количеству паразитов имеет неоднородную структуру: одна капля крови из забранного объема крови может не содержать гемоспоридий, а в другой капле крови количество зараженных эритроцитов будет высокое. Забор крови осуществляют в минимальном репрезентативном объеме в количестве 0.5-1.5 мл в шприц или пробирку с любым антикоагулянтом (гепарином, трилоном Б, цитратом натрия), что позволяет при использовании заявляемого способа просмотреть объем крови в 5 мкл, что соответствует в действительности 100-300 каплям крови.

Заявляемый способ позволяет быстро и точно определить наличие паразитов в крови.

Заявляемым способом проведена диагностика кровепаразитарных инфекций у собак (n=180) и кошек (n=48). Диагностика проведена после лечения в городских ветеринарных лечебницах и клиниках, где при исследовании крови получен отрицательный результат на бабезиоз, однако владельцы животных вновь обращались для постановки диагноза с хроническими дерматитами, локальными и тотальными алопециями, быстрой утомляемостью животных, анорексией, функциональной сердечно-сосудистой недостаточностью, воспалительными явлениями на ушной раковине, в среднем и внутреннем ухе, гематомами ушной раковины, с прогрессирующей кахексией, лимфаденитами, лимфомами, аллергическими реакциями, бронхитами и пневмониями, поражениями центральной и периферической нервной системы, артритами, гломеруло- или пиелонефритами, анемиями, энтеритами и кишечными кровотечениями, иммунодефицитными состояниями, желтушностью и анемичностью кожных покровов, конъюнктивитами и кератитами, хроническими воспалительными явлениями в репродуктивных органах неясной этиологии. Исследование мазков из нативной крови под микроскопом показало наличие редко встречающихся очень мелких включений внутри эритроцитов, а также V-образных и точечных структур, типичных для бартонелл, на мембранах и внутри эритроцитов от 0 до 1 в поле зрения. При обработке крови по предлагаемому способу в мазке выявлены эритроциты с крупными трофозоитами внутри и четкими контурированными ядрами в них, что свидетельствовало о наличии в крови бабезий в состоянии активного размножения. В эритроцитах из верхней фракции присутствовали мелкие бабезии размером от 0.5 до 1-3 мкм. У некоторых животных морфологически можно было выделить одновременно несколько видов бабезий. Количество бартонелл на эритроцитах увеличилось до 8-10 и более 100 в отдельных полях зрения.

Заявляемым способом проведена диагностика кровепаразитарных инфекций у 750 человек с различными хроническими заболеваниями неясной этиологии и с рядом симптомов, идентичных наблюдаемым у животных. У 525 человек в мазках из нативной крови, пораженных бабезиями эритроцитов, было от 1 на весь мазок до 5 в отдельных полях зрения. Бартонеллы встречались в количестве от 1 до 3 в мазке. При обработке крови заявляемым способом количество выявленных бабезий в мазке увеличилось до 25-75 в поле зрения. У 225 человек в 2 мазках из нативной крови не было найдено ни одного пораженного бабезиями эритроцита. После приготовления мазков из нижней фракции центрифугированной крови удалось выявить у них от 1 до 9 пораженных эритроцитов на 2-4 поля зрения (скрытая, слабая паразитемия) и от 1 до 7 пораженных эритроцитов в верхней фракции). Количество выявленных бартонелл на эритроцитах и внутри увеличилось до 1-4 и более 100 в отдельных полях зрения. В некоторых мазках после центрифугирования выявлялись анаплазмы в эритроцитах, риккетсии в сегментоядерных нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах.

Способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Собака породы немецкая овчарка по кличке Улдари - сука в возрасте 7 лет. Исследование крови из вены по стандартной методике дало отрицательный результат.

Проведено исследование венозной крови заявляемым способом. Для этого произвели забор 0.5 мл крови в шприц с гепарином, исследуемую кровь процентрифугировали 5 мин при 5000 об/мин, на два предметных стекла нанесли в форме капли по 3.3 мкл плазмы крови. На одно из них добавили 1.7 мкл эритроцитарной массы, взятой из верхней фракции крови, а на другое - 1.7 мкл эритроцитарной массы, взятой из нижней фракции крови. Капли на стекле тщательно перемешали, сформировали два мазка, зафиксировали их в метаноле (10 мин) и высушили их в потоке холодного воздуха с использованием фена. Далее мазки окрасили 20% раствором стандартного красителя азур-эозина рН 5.0 в течение 15 мин. Концентрированный краситель перед использованием профильтровали через бумажный фильтр. Мазки промыли дистиллированной водой, отмыли от избытка красителя метиленового азура в ванночке с дистиллированной водой в сменных водах 15 мин и высушили. Микроскопию мазков проводили в проходящем свете с иммерсией. Поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляли от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами и далее по верхнему и нижнему краям мазка. При микроскопии эритроциты имели оранжевый цвет, а эндоглобулярные включения имели вишнево-сиреневый цвет, в отдельных трофозоитах выделялось контурированное ядро. Исследование венозной крови заявляемым способом позволило выявить от 10 до 30 пораженных бабезиями эритроцитов и от 1 до 3 бартонелл в отдельных полях зрения в верхней и нижней фракциях центрифугата.

Пример 2.

Пациент А., 43 года, донор со стажем 5 лет. При исследовании мазка крови, приготовленного по стандартной методике, паразиты крови (гемоспоридии) не выявлены.

Проведено исследование венозной крови заявляемым способом. Для этого произвели забор 1.5 мл крови в пробирку с трилоном Б, исследуемую кровь центрифугировали 10 мин при 3500 об/мин, на два предметных стекла нанесли в форме капли по 3.3 мкл плазмы крови. На одно из них добавили 1.7 мкл эритроцитарной массы, взятой из верхней фракции крови, а на другое - 1.7 мкл эритроцитарной массы, взятой из нижней фракции крови. Капли на стекле тщательно перемешали, сформировали два мазка, зафиксировали их в метаноле (10 мин) и высушили их в потоке холодного воздуха с использованием фена. Далее мазки окрасили 20% раствором стандартного красителя азур-эозина рН 5.0 в течение 20 мин. Концентрированный краситель перед использованием профильтровали через фильтровальную бумагу. Мазки промыли дистиллированной водой, отмыли от избытка красителя метиленового азура в ванночке с дистиллированной водой в сменных водах 20 мин и высушили. Микроскопию мазков проводили в проходящем свете с иммерсией. Поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляли от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами и далее по верхнему и нижнему краям мазка. При микроскопии эритроциты имели оранжевый цвет, а эндоглобулярные включения имели вишнево-сиреневый цвет, в отдельных трофозоитах выделялось контурированное ядро. Исследование венозной крови заявляемым способом позволило выявить от 15 до 32 пораженных бабезиями эритроцитов в поле зрения нижней фракции центрифугированных эритроцитов и от 11 до 23 пораженных эритроцитов в верхней фракции. Риккетсии были выявлены в сегментоядерных нейтрофилах и моноцитах.

Использование данного способа позволит существенно снизить затраты времени на качественную диагностику кровепаразитарных инфекций, позволит специалистам гуманитарной и ветеринарной медицины эффективно, своевременно и быстро выявлять пациентов с острым и хроническим течением кровепаразитарного заболевания, доноров со скрытым носительством инфекции или асимптомным течением заболевания, проводить предварительный контроль донорской крови перед гемотрансфузией.

Способ технически прост, эффективен и доступен в любой лаборатории для качественной диагностики кровепаразитарных инфекций.

Источники информации

1. Krause P.J. et al. Comparison of PCR with Blood Smear and Inoculation of Small Animals for Diagnosis of Babesia microti Parasitemia. - J. Clinical Microbiology. - 1996. - P.2791-2794.

2. Avarzed A. et al. Monoclonal Antibody against Babesia equi: Characterization and Potential Application of Antigen for Serodiagnosis. - J. Clinical Microbiology. - 1998. - P.1835-1839.

3. Boustani M.R., Gelfand J.A. Babesiosis. - Clinical Infectious Diseases. - 1996. - P.611-614.

4. Lodes M.J., Houghton R.L., Bruinsma E.S. et al. Serological expression cloning of novel immunoreactive antigens of Babesia microti. - Infection of immunity. - 2000. - V.68. - N.5 - P.2783-2790.

5. Ажинов С.А. Динамика РСК при гемоспоридиозах лошадей // Тр. Ростовск. обл. н.-и. вет. опыт. ст. - 1955. - вып.11. - С.197-200.

6. Патент РФ № 2218565. «Способ диагностики кровепаразитарных заболеваний», кл. G01N 33/48, опубл. 10.12.2003.

7. Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А. Клиническая гематология животных. - М.: Колос, - 1974. - 399 с.

8. Allred D.R. Antigenic variation in babesiosis: is there more than one why // Microb. Infect. - 2001. - Vol.3 - P.481-491.