способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов

Формула изобретения

1. Способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов, включающий комбинированное введение в организм противомикробных средств и анилиновых красителей, отличающийся тем, что противомикробные средства вводят в средних терапевтических дозах, а анилиновые красители - в субингибирующих концентрациях от 0,00063 до 0,0025% к объему раствора вводимого антимикробного средства, местно и/или системно - парентерально, энтерально.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при бактериальных инфекциях, обусловленных или стафилококками, или энтеробактериями, или коринебактериями, вводят местно в виде мазей, гелей или растворов антимикробные препараты, выбираемые из группы фторхинолонов, аминогликозидов, макролидов, тетрациклинов, цефалоспоринов, левомицетина, нитрофуранов, к которым они резистентны в средних терапевтических дозах, в комбинации с анилиновыми красителями в субингибирующих концентрациях: либо с фуксином основным 0,0025%, либо с метиленовым синим 0,0025%, либо с бриллиантовым зеленым 0,00125%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при инфекциях, обусловленных грибами, вводят местно в виде мазей, гелей или растворов антимикробные препараты, выбираемые из группы: итраконазола, флюконазола, кетоконазола, к которым они резистентны в средних терапевтических дозах, в комбинации с анилиновыми красителями в субингибирующих концентрациях: либо с бриллиантовым зеленым 0,00125%, либо с метиленовым синим 0,00063%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и фармакологии, а именно к клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии, и может быть использовано для лечения заболеваний микробной природы, обусловленных штаммами бактерий и грибов, обладающих множественной резистентностью к антимикробным препаратам.

Известен способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий, включающий комбинированное применение двух антибиотиков с различным механизмом действия: пенициллина и стрептомицина, гентамицина и ампициллина, тетрациклина и олеандомицина (1).

Недостатком данного способа является ограниченный спектр антагонистического действия применяемых комбинаций антибиотиков.

Известен способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий, включающий частое введение антимикробных препаратов в высоких дозах, значительно превышающих минимальные подавляющие концентрации (2).

Универсальность этого способа ограничена переносимостью высоких доз некоторых антибиотиков большинством пациентов.

Известен способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий, включающий применение антибиотиков в комбинации с ингибиторами бактериальных ферментов. Например, в целях преодоления бета-лактамазной резистентности были разработаны специальные ингибиторы бета-лактамаз: клавулановая кислота (клавуланат), сульбактам и тазобактам (3). На этой основе созданы комбинированные препараты, содержащие аминопенициллиновый антибиотик и один из ингибиторов бета-лактамаз (амоксициллин/клавуланат).

Недостатком данного способа является ограниченный спектр антагонистического действия применяемых комбинаций препаратов (активны только в отношении микробов, резистентность которых обусловлена выработкой бета-лактамаз).

За прототип принят способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий, включающий комбинированное применение антибиотика (эритромицина), анилинового красителя (метиленового синего), экстракта ромашки (4), что обеспечивало выраженный антимикробный эффект, превышающий таковой при раздельном использовании каждого из компонентов.

Недостатком данного способа является ограничение перечня возможных антибиотиков одним эритромицином, а также предназначение для лечения только местных гнойно-воспалительных процессов кожи и слизистых оболочек.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам с различным механизмом действия при лечении патологии, обусловленной полирезистентными штаммами бактерий и грибов за счет использования противомикробных средств в средних терапевтических дозах, а анилиновых красителей в субингибирующих концентрациях.

Поставленная цель достигается тем, что резистентность бактерий и грибов к антимикробным лекарственным средствам преодолевается путем комбинированного введения в организм противомикробных средств и анилиновых красителей, причем противомикробные средства вводят в средних терапевтических дозах, а анилиновые красители - в субингибирующих концентрациях от 0,00063 до 0,0025%, местно и/или системно-парентерально, энтерально.

При этом при бактериальных инфекциях, обусловленных стафилококками, энтеробактериями и корниобактериями, вводят местно в виде мазей, гелей или растворов антимикробные препараты фторхинолоны, аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, цефлоспорины, левомицитин, нитрофураны, к которым они резистентны в средних терапевтических дозах, в комбинации с анилиновыми красителями, либо с фуксином основным в субингибирующей концентрации 0,0025%, либо с бриллиантовым зеленым - 0,00125%, либо с метиленовым синим - 0,0025%. Последний может применяться в комбинации с антимикробным препаратом парентерально, либо реr os, либо в виде раствора в концентрации 0,00063%.

При инфекциях, обусловленных грибами, вводят местно в виде мазей, гелей или растворов антимикробные препараты итраконазол, флюконазол, кетоконазол, к которым они резистентны в средних терапевтических дозах, в комбинации с анилиновыми красителями, либо с бриллиантовым зеленым в субингибирующей концентрации 0,00125%, либо с метиленовым синим - 0,0025%. Кроме того, метиленовый синий вводят в комбинации с антимикробными препаратами парентерально или реr os в виде раствора в концентрации 0,00063%.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом:

Лекарственными средствами для реализации предлагаемого способа, пригодными для хранения в течение 1 года при комнатной температуре,являются:

- «Ципробрил» - 0,02% водный раствор ципрофлоксацина с 0,00125% бриллиантового зеленого (для местного применения);

- «Ципромет» - 0,02% водный раствор ципрофлоксацина с 0,00063% метиленового синего для парентерального применения и реr os или 0,0025% для местного применения;

- «Гентабрил» - 4% водный раствор гентамицина с 0,00125% бриллиантового зеленого (для местного применения);

- «Гентамет» - 4% водный раствор гентамицина с 0,0025% метиленового синего для местного или 0,00063% для парентерального применения или реr os;

- Мазь «Гентабрил» с 0,1% гентамицина и 0,00125% бриллиантового зеленого;

- Мазь «Гентамет» с 0,1% гентамицина и 0,0025% метиленового синего;

- Мазь «Эритробрил» с 10000 ЕД/г эритромицина и 0,00125% бриллиантового зеленого;

- Мазь «Эритромет» с 10000 ЕД/г эритромицина и 0,0025% метиленового синего;

- Мазь «Ципробрил» с 3% ципрофлоксацина и 0,00125% бриллиантового зеленого;

- Мазь «Ципромет» с 3% ципрофлоксацина и 0,0025% метиленового синего;

- «Левобрил» - 0,25% раствор левомицетина и 0,00125% бриллиантового зеленого (глазные капли);

- «Левомет» - 0,25% раствор левомицетина и 0,0025% метиленового синего (глазные капли);

- Мазь «Тетрамет» - 10000 ЕД/г тетрациклина и 0,0025% метиленового синего;

- Крем «Кетобрил» - крем «Низорал» (с кетоконазолом) с 0,00125% бриллиантового зеленого;

- Крем «Кетомет» - крем «Низорал» (с кетоконазолом) с 0,0025% метиленового синего;

- Порошок для приготовления суспензии для приема внутрь «Флукомет» (порошок для приготовления суспензии для приема внутрь «Дифлюкан», содержащий флуконазол 50 мг и метиленовый синий 0,1 г);

- Раствор для приема внутрь «Орунгамет» (раствор для приема внутрь «Орунгал», содержащий итраконазол 100 мг и метиленовый синий 0,1 г);

- Порошок для приготовления суспензии для интравагинального введения «Флукомет-гин» (порошок для приготовления суспензии для приема внутрь «Дифлюкан», содержащий флуконазол 50 мг и метиленовый синий из расчета 0,00063% к объему раствора);

- Раствор для интравагинального введения «Орунгамет-гин» (раствор для приема внутрь «Орунгал», содержащий итраконазол 100 мг и метиленовый синий из расчета 0,00063% к объему раствора).

Лекарственными средствами для реализации предлагаемого способа, которые готовятся непосредственно перед применением (ex tempore), являются:

- водные растворы цефазолина, цефтриаксона, тетрациклина, эритромицина, левомицетина с 0,00125% бриллиантового зеленого (для местного применения) либо 0,00063-0,0025% метиленового синего (для местного или парентерального применения);

- 0,02% водный раствор фурациллина с 0,00125% бриллиантового зеленого либо 0,0025% метиленового синего (для местного применения);

- 0,1% водный раствор фурагина калиевой соли со 125 мкг метиленового синего (для парентерального применения или peг os).

Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с аналогами и прототипом являются: универсальность (преодоление резистентности к антибиотикам с различным механизмом действия, нитрофуранам, противогрибковым препаратам), широкий спектр активности (грамположительные и гамотрицательные бактерии, грибы рода Candida), возможность применения как местно, так и системно (парентерально, реr os).

Для планирования эксперимента по выбору оптимального соотношения антимикробного препарата и анилинового красителя использовали метод оптимизации процесса по схеме ортогональных латинских прямоугольников.

Результирующим признаком выбрали величины зон подавления роста полирезистентных клинических изолятов бактерий (золотистого и эпидермального стафилококка, коринебактерий, клебсиеллы, энтеробактера) и грибов Candida albicans на плотной питательной среде, либо количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в

1 мл жидкой питательной среды.

Матрица планирования эксперимента и полученные результаты представлены в таблицах 1-4.

Таблица 4
Результаты эксперимента с грибами Candida albicans по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в плотной питательной среде
		В миллиметрах
Факторы	Уровни факторов	Эффекты уровней факторов при подавлении грибов
флуконазол	итраконазол	кетоконазол
Антимикробный препарат	I	+4,6	+5,3	+6,6
II	+1,3	+0,9	+1,6
III	-6,0	-6,1	-7,9
Метиленовый синий	I	-0,7	+0,2	-0,9
II	+1,6	-0,4	-0,2
III	-1,0	+0,3	+1,1

Данные в таблицах 2-4 показывают, что увеличение содержания антимикробных препаратов приводило к повышению ингибирования роста различных микроорганизмов (исключение составляло только действие левомицетина в жидкой питательной среде). В плотной питательной среде такое же явление наблюдалась в действии на бактерии анилиновых красителей, сочетавшихся с цефазолином, тетрациклином и фурагином.

В то же время в остальных исследованных случаях как в плотной, так и в жидкой питательных средах с бактериями, а также в отношении грибов Candida albicans закономерности «доза - эффект» у красителей не наблюдалось. Это было дополнительным доказательством, что данные вещества действительно применялись в субингибирующих концентрациях и самостоятельного антимикробного действия не проявляли.

Основываясь на таком факте, было принято решение применять анилиновые красители в максимальных (из испытанных) концентрациях местно и минимальных парентерально и реr os: метиленовый синий - 0,0025% (местно) и 0,00063% (парентерально и реr os), бриллиантовый зеленый - 0,00125%, фуксин основной - 0,0025% (местно).

Для разработки лекарственных средств, с помощью которых реализуется предлагаемый способ, проведен выбор условий их приготовления и хранения. Результаты свойств мазей приведены в таблице 5.

При выборе основы для приготовления мазей для смешивания со спиртовыми и водными растворами бриллиантового зеленого и метиленового синего пригодным оказался медицинский вазелин. Ланолин мог быть использован только в смеси с метиленовым синим, так как при смешивании с бриллиантовым зеленым происходило обесцвечивание красителя.

Все приготовленные мази из антимикробных препаратов и красителей на основе вазелина, а также включающие метиленовый синий на основе ланолина не изменили своей консистенции и цвета в процессе хранения в течение 1 года при комнатной температуре.

Не отмечено и утраты антимикробной активности мазей и растворов с антибиотиками и красителями в процессе таких условий хранения, что было показано в опытах с использованием клинических изолятов бактерий и грибов (таблицы 6, 7).

Таблица 6
Динамика антимикробной активности смесей антигрибковых препаратов и красителей в процессе хранения
Исследуемые мази	Диаметры зон подавления роста тестируемых штаммов грибов, мм
Candida albicans 1	Candida albicans 2
Мазь кетоконазола (низорал) и метиленового синего:
до хранения	21	22
через 1 год после хранения	21	23
Мазь итраконазола и бриллиантового зеленого:
до хранения	27	20
через 1 год после хранения	24	19
Примечание - В таблице приведены средние данные по трем опытам с использованием метода колодцев в плотной питательной среде.

Примеры экспериментального изучения предлагаемого способа преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов и лекарственных средств для его реализации:

ПРИМЕР 1. Результаты эпидемиологической оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении полирезистентных клинических изолятов бактерий и грибов (таблицы 8-13).

Таблица 8
Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Corynebacterium spp.
Антимикробный препарат	Результаты
контроль	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Левомицетин (n=12)	7,4±3,0
Эритромицин (n=10)	1,5±2,3
Доксициклин (n=10)	2,3±3,5
Гентамицин (n=10)	7,7±3,8
Ципрофлоксацин (n=13)	4,4±3,8
Фурагин (n=14)	6,1±3,8
Примечания: 1. n - количество исследованных штаммов. 2. В поле таблицы в числителе - диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое и доверительный интервал для P=95), в знаменателе - доля штаммов, в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя.

Таблица 9
Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Staphylococcus aureus.
Антимикробный препарат	Результаты
	контроль	Фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Эритромицин (n=13)	2,1±2,5
Доксициклин (n=14)	3,0±2,9
Гентамицин (n=14)	4,2±3,0
Цефазолин (n=8)	8,4±6,0
Ципрофлоксацин (n=13)	5,0±3,5
Фурагин (n=11)	7,2±3,8
Примечания: 1. n - количество исследованных штаммов. 2. В поле таблицы в числителе -диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое и доверительный интервал для P=95), в знаменателе - доля штаммов, в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя.

Таблица 10
Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Staphylococcus epidermidis
Антимикробный препарат	Результаты
	контроль	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
1	2	3	4	5
Левомицетин (n=10)	5,6±4,4
Эритромицин (n=12)	4,5±3,6
Доксициклин (n=11)	4,3±4,0
Гентамицин (n=10)	3,9±3,7
Цефазолин (n=10)	6,7±4,2
Ципрофлоксацин (n=12)	5,3±3,6
Фурагин (n=11)	5,0±3,9	.
Примечания: 1. n - количество исследованных штаммов. 2. В поле таблицы в числителе - диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое и доверительный интервал для P=95), в знаменателе - доля штаммов, в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя.

Таблица 11
Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Klebsiella pneumoniae
Антимикробный препарат	Результаты
контроль	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Доксициклин (n=10)	3,8±3,5
Цефазолин (n=7)	3,4±5,4
Ципрофлоксацин (n=4)	6,0±11,0			-
Фурагин (n=9)	6,6±4,8
Примечания: 1. n - количество исследованных штаммов.2. В поле таблицы в числителе - диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое и доверительный интервал для P=95), в знаменателе - доля штаммов, в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя.

Таблица 12
Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Enterobacter spp.
Антимикробный препарат	Результаты
контроль	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
1	2	3	4	5
Доксициклин (n=10)	3,6±3,4
Гентамицин (n=8)	6,3±4,5
Фурагин (n=10)	6,8±4,3
Примечания: 1. n - количество исследованных штаммов. 2. В поле таблицы в числителе - диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое и доверительный интервал для P=95), в знаменателе - доля штаммов, в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя

Таблица 13
Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Candida albicans
Антимикробный препарат	Результаты
контроль	метиленовый синий	бриллиантовый зеленый
Итраконазол (n=6)	7,7±6,4
Флуконазол (n=11)	4,9±3,8
Кетоконазол (n=7)	6,7±5,8
Примечания: 1. n - количество исследованных штаммов. 2. В поле таблицы в числителе - диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое и доверительный интервал для P=95), в знаменателе - доля штаммов, в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя

Данные таблиц 8-13 показывают, что микробиологическая эффективность предлагаемого способа для комбинаций антимикробных препаратов с бриллиантовым зеленым и метиленовым синим в отношении стафилококков и коринебактерий составляет 67-100%, энтеробактерий - 40-75%, грибов Candida albicans - 100%. Комбинации антибиотиков и фурагина с метиленовым синим подавляли рост значительно меньшего количества штаммов: 55-85% коринебактерий и стафилококков, 20-50% энтеробактерий.

ПРИМЕР 2. Результаты оценки безвредности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями

1. Трем экспериментальным группам (каждая по 20 разнополых белых мышей весом 16-18 г) ежедневно однократно в течение 10 суток вводили внутрибрюшинно шприцем следующие композиции препаратов:

- в первой группе - 0,2 мл Акваципро (0,2% водный раствор ципрофлоксацина) со 125 мкг метиленового синего;

- во второй группе - 0,13 мл 4% водного раствора гентамицина со 163 мкг бриллиантового зеленого;

- в третьей группе - 0,1 мл дифлюкана (0,2% водный раствор флуконазола) с 250 мкг метиленового синего.

Через 1 месяц наблюдения после завершения введения композиций препаратов все животные из трех экспериментальных групп по внешнему виду, общему состоянию, поведенческим реакциям (число вставаний в минуту, характер походки, тремор, активность) не отличались от контрольной группы из 20 мышей (которой препараты не вводились).

Через 5 суток после завершения вышеуказанного эксперимента в каждой их трех групп мышей выделили по 10 животных, которым ввели 0,05 мл соответствующих композиций препаратов под апоневроз задней лапки. Через 20 часов после этого достоверных отличий в толщине лапок у контрольных и опытных животных не выявлено (по результатам измерения микрометром). Это указывало на отсутствие сенсибилизирующего действия. При вскрытии 10 животных из каждой экспериментальной группы патологических изменений со стороны внутренних органов не выявлено, что свидетельствовало об отсутствии хронической токсичности.

2. Трем экспериментальным группам кроликов весом 1,5-2 кг (по 3 животных в каждой) ежедневно в течение 10 суток однократно в конъюнктивальный мешок нижнего века правого глаза вводили 0,1 мл следующих композиций:

0,2% водный раствор ципрофлоксацина с 0,0025% метиленового синего;

4% раствор гентамицина с 0,00125% бриллиантового зеленого;

0,2% водный раствор флуконазола с 0,0025% метиленового синего.

Левый глаз использовали в качестве контроля. При ежедневной оценке (и через 10 суток после завершения эксперимента) состояния конъюнктивы глаза и слизистой оболочки века каких-либо патологических изменений по сравнению с контрольным глазом не выявлено у всех девяти кроликов. Это свидетельствовало об отсутствии раздражающего действия.

ПРИМЕР 3. Результаты доклинических испытаний комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями

40 белым мышам весом 16-18 г однократно ввели внутримышечно в заднюю лапку 2,5 мг гидрокортизона для подавления реакций иммунитета. Затем животных разделили на 2 группы:

- в первой (20 мышей) внутрибрюшинно ввели 10⁸ живых клеток золотистого стафилококка (штамм, резистентный к ципрофлоксацину). Через 3 суток после заражения 10 мышам ежедневно однократно производилось внутрибрюшинное введение «Ципромет» (0,2 мл 0,2% водного раствора ципрофлоксацина с 125 мкг метиленового синего). Другим 10 мышам (контроль) вводили только 0,2 мл Акваципро;

- во второй (20 мышей) внутрибрюшинно ввели 10 живых клеток Candida albicans (штамм, резистентный к флуконазолу). Через 3 суток после заражения 10 мышам ежедневно однократно производилось внутрибрюшинное введение 0,1 мл «Флукомет» (0,2% водный раствор флуконазола с 250 мкг метиленового синего). Другим 10 мышам (контроль) вводили только 0,1 мл дифлюкана.

Результаты эксперимента приведены в таблице 14.

Таблица 14
Результаты доклинических испытаний композиций «Ципромет» и «Флукомет» на десятые сутки после заражения
Испытываемый препарат	Исходы инфекционного процесса (количество мышей)
гибель	выделение микробов из внутренних органов
«Ципромет»	0	0
Акваципро (контроль)	2	7
«Флукомет»	0	0
Дифлюкан (контроль)	0	8
Примечание - Высев микробов из печени и селезенки проводили после вскрытия животных.

20 белым крысам весом 250-300 г однократно ввели внутримышечного в заднюю лапку 30 мг гидрокортизона для подавления реакций иммунитета. Затем под общим эфирным наркозом выстригли шерсть в межлопаточной области, скарифицировали кожу на участке 4 см². На образовавшуюся рану нанесли 0,1 мл суспензии золотистого стафилококка, содержащей 10 КОЕ/мл (штамм, резистентный к гентамицину). Через 3 суток после заражения 10 крысам ежедневно однократно производилось нанесение на рану мази «Гентабрил» (мазь с гентамицином и 0,00125% бриллиантового зеленого (0,125 мг на 100 г мази) в течение 10 суток. Другим 10 крысам (контроль) наносили мазь с гентамицином без бриллиантового зеленого.

Через 10 суток наблюдения в контроле у всех десяти крыс отмечалось гнойно-некротическое воспаление раны. У 9 из 10 животных, которых лечили мазью «Гентабрил», площадь раны уменьшилась не менее чем в 1,5 раза, а ее внешний вид был без признаков некроза и гнойного воспаления.

Предлагаемый способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов и лекарственные средства для его реализации целесообразно использовать для терапии воспалительных заболеваний, обусловленных полирезистентными штаммами микроорганизмов.

Источники информации, принятые во внимание

1. Навашин С.М. и др. Рациональная антибиотикотерапия. Справочник., 4-е изд., перераб. и доп., М., Медицина, 2002, 496 с.

2. Aguado-Garcia J.M. et al. Bacterial resistance and pharmacodynamics as the prescribing antibiotics in respiratory infections. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 2004, Vol.22, № 4, pp 230-237.

3. Friese S. Prophylaxin in gynaecological surgery: a pprospective randomized comparision between single dose profilaxis with amoxicillin clavulanate and the combination of cefuroxime and metronidazole. Antimicrob. Chemother., 1989, Vol.24, Suppl. B.-P., pp.213-216.

4. Заявка на изобретение RU 2002130114 от 20.05.2004