антиоксидант, обладающий гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью

Формула изобретения

(1'S,5'S,9'S,10'R)-метил-5-[2-(3-бензил-6-карбокси-4-оксо-10-окса-3-азатрицикло [5.2.1.0^1,5]дeкa-8-eн-9-ил)этил]-1,10-димeтил-6-мeтилeн-декагидронафталин-1-карбоксилат формулы (I),



обладающий антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к (1'S,5'S,9'S,10'R)-метил-5-[2-(3-бензил-6-карбокси-4-оксо-10-окса-3-азатрицикло [5.2.1.0^1,5]дeц-8-eн-9-ил)этил]-1,10-диметил-6-метилен-декагидронафталин-1-карбоксилату формулы (I),

обладающему антиоксидантной, гепатопротективной и гемостимулирующей активностью.

Указанное свойство позволяет предполагать возможность использования соединения в медицине в качестве фармацевтического препарата.

В современной медицинской практике используются антиоксиданты синтетического и природного (растительного) происхождения. Среди антиоксидантов растительного происхождения применение нашли преимущественно флавоноиды, например рутин, кверцетин [1, 2], дигидрокверцетин [3]. Аналогом по фармакологическим свойствам заявляемого соединения является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы (II).

Дигидрокверцетин является основным биофлавоноидом (90% и выше) препарата диквертин, производство которого из древесины лиственницы налажено в последние годы. Дигидрокверцетин обладает антирадикальной и антиоксидантной активностью, противовоспалительными, капилляропротективными, гастро- и гепатопротекторными свойствами [3]. Указанные эффекты обеспечивают этому соединению статус базовой субстанции для создания на ее основе комбинированных препаратов, расширяющих спектр его биологической активности. Основным недостатком препаратов на основе флавоноидов является возможное побочное действие на желудочно-кишечный тракт, проявляющееся в основном в виде тошноты, изжоги [1, 2].

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание на основе отечественного растительного сырья антиоксиданта нового структурного типа с высокой гепатопротекторной активностью. Важным элементом поставленной задачи служит получение агента с улучшенными фармакологическими свойствами, направленными на коррекцию системных побочных эффектов, возникающих при применении высокотоксичных лекарственных препаратов, таких как цитостатики. Препараты данной группы, широко используемые при противоопухолевой терапии, вызывают тяжелые расстройства в виде миело- и гемодепрессии, иммунологических нарушений, функциональных и морфологических повреждений различных органов и т.д. [4, 5]. Анализ литературных данных показывает, что синтез новых соединений из растительного сырья с целью расширения ассортимента нетоксичных антиоксидантов с дополнительными (помимо антиоксидантной активности) протекторными свойствами, является актуальной задачей.

Поставленная задача решается новым химическим соединением - (1'S,5'S,9'S,10'R)-метил-5-[2-(3-бензил-6-карбокси-4-оксо-10-окса-3-азатрицикло [5.2.1.0^1,5]дец-8-ен-9-ил)этил]-1,10-диметил-6-метилен-декагидронафталин-1-карбоксилатом формулы (I), обладающим гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью, в том числе на фоне введения в организм цитостатических препаратов.

Аналогом по структуре указанных соединений является метил-5-[2-(4-бензил-3,5-диоксо-10-окса-4-азатрицикло[5.2.1.0 ^2,6]дeц-8-eн-9-ил)этил]-1,10-диметил-6-метилен-декагидронафталин-1-карбоксилат формулы (III), обладающий антидепрессивной активностью [6].

Способ получения соединения (I), содержащего в структуре лабданоидный остов, соединенный с фрагментом 10-окса-3-азатрицикло [5.2.1.0^1,5]дец-8-ена, реализуется по приведенной схеме 1. Ацилирование 16-[(N-бензил)аминометил]-метилламбертианата (IV), полученного реакцией аминометилирования метилламбертианата по методике работы [7], малеиновым ангидридом протекает в мягких условиях (хлороформ, 20°С) и приводит к образованию замещенного 10-окса-3-азатрицикло[5.2.1.0^1,5]-6-карбокси-дец-8-ен-4-она (I). Соединение образуется в виде смеси (1R,5S,6R,7R)- и (1S,5R,6S,7S)-диастереоизомеров (1:1) (по данным спектра ¹Н ЯМР) (выход 84%).

Схема 1

Биологическая активность соединения (I) изучалась путем определения антиоксидантной и гепатопротекторной активности на модели токсического CCl₄ гепатита у мышей, а также при поражении крыс, вызванном введением циклофосфана. В качестве препарата сравнения использовали антиоксидант дигидрокверцетин (II).

Предварительно в эксперименте на беспородных мышах массой 18-23 г определяли острую токсичность при однократном внутрижелудочном способе введения. Установлено, что LD₅₀ соединения (I) превышает максимально возможную для разового введения дозу 1000 мг/кг.

Для исследования антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического ССl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [8]. Раствор ССl₄ в растительном масле (25%) вводился внутрижелудочно мышам-самцам. Соединение (I) вводили в желудок в дозе 100 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом. Через сутки в сыворотке крови мышей определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ) и концентрацию малонового диальдегида (МДА) общепринятыми методами [9]. Установлено, что соединение (I) в условиях токсического гепатита оказывает достоверный антицитолитический эффект, снижая активность АЛТ и ACT в крови соответственно в 1,5 и 1,9 раз по сравнению с контролем. По влиянию на уровень АЛТ агент (I) не уступает, а по влиянию на ACT - превосходит референс-соединение в 1,6 раз. По выраженности антихолестазного эффекта соединение (I) не уступает ДКВ (табл.1).

Изучение протекторного действия соединения (I) в условиях поражения циклофосфаном (ЦФ) изучали на крысах-самках Вистар. ЦФ вводился однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг в растворе 0.9% NaCl всем животным. Соединение (I) в виде водно-твиновой взвеси вводилось группе крыс (12 шт.) в желудок в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контрольной группе вводили только циклофосфан (10 шт.). В конце опыта определяли состав периферической крови и лейкоцитарную формулу. В сыворотке крови с помощью стандартных наборов реактивов исследовали активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего белка, глюкозы. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) исследовали общепринятым методом [9].

Результаты изучения биологической активности приведены в табл.2-4. Установлено, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг на фоне циклофосфанового поражения уступает ДКВ по антицитолитическим свойствам, но превосходит его по антихолестатическому и антиоксидантному эффекту. Обнаружено, что соединение (I) проявляет тенденцию к уменьшению цитопении, вызванной циклофосфаном, повышая количество лейкоцитов и тромбоцитов относительно контроля соответственно в 1,4 и 1,2 раза, количество нейтрофилов - в 1,8, а моноцитов - в 2,5 раза. Показано, что гемостимулирующий эффект соединения (I) превосходит таковой для ДКВ.

Таким образом, предлагаемое изобретение обладает следующими преимуществами.

- Соединение (I) обладает высокой антиоксидантной и гепатопротекторной активностью, а также гемостимулирующим действием на фоне введения цитостатика циклофосфана.

- Использование для его синтеза исходного, получаемого из доступного сырья - хвои или живицы кедра сибирского Pinus sibirica R. Mayr.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез (1R,5S,6R,7R)- и (1S,5R,6S,7S)-(1'S,5'S,9'S,10'R)-Meтил-5-[2-(3-бензил-6-карбокси-4-оксо-10-окса-3-азатрицикло[5.2.1.0 ^1,5]дека-8-ен-9-ил)этил]-1,10-диметил-6-метилен-декагидронафталин-1-карбоксилатов (I).

К перемешиваемому раствору 0.87 г (1.96 ммоль) фурфуриламина (IV) [7] в 30 мл бензола добавили 0.19 г (1.96 ммоль) малеинового ангидрида. Реакционную смесь перемешивали при 20°С 48 ч. Растворитель выпаривали в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (элюент - хлороформ). Получили 0.90 г (84%) смеси (1R,5S,6R,7R)- и (1S,5R,6S,7S)-диастереоизомеров 10-окса-3-азатрицикло[5.2.1.0^1,5]дека-8-ена (I) в виде бесцветного масла. УФ-спектр, _макс., нм (lg ) 258 (1.71), 264 (1.67). ИК-спектр, см^-1: 692 (C=C); 1132, 1229, 1723 (С=О). Спектр ЯМР ¹Н ( , м.д., J, Гц): 0.45 с (6Н, С^16'Н₃ ), 0.97 м (2Н, Н^4'), 1.00 м (2Н, Н^2' ), 1.14 с (6Н, С^15'Н₃), 1.24 м (2Н, Н^9'), 1.45 м (2Н, Н^3',11'), 1.52 м (4Н, Н^5',11'), 1.73 м (4Н, Н^4',8' ), 1.81 м (6Н, Н^3',7',12'), 1.95 м (2Н, Н⁸), 2.14 д.м. (2Н, Н^2', J_гем 13.1), 2.22 м (2Н, Н^12'),

2.35 м (2Н, Н^7'), 2.83 уш. с (2Н, Н⁶), 2.87 уш. с (2Н, Н⁵), 3.50 д, 3.53 д (2Н, Н², J 13), 3.58 с (6Н, ОСН₃), 3.66 д, 3.68 д (2Н, Н ², J 13), 4.33 с, 4.36 с (2Н, Н^13'), 4.40 д, 4.60 д

(4Н, СН₂Рh, J 12), 4.78 с (2Н, Н^13'), 5.14 уш. с (2Н, Н⁷), 5.94 д (1Н, Н⁸, J 1.3), 5.96 д (1Н, Н⁸, J 1.4), 7.21 м (4Н, Н^2'',6''), 7.26 м (2Н, Н^4''), 7.30 м (2Н, Н^3'',5'' ). Спектр ЯМР ¹³С, , м.д.: 12.31 к, 12.38 к (С^16'), 19.70 т (С^3'), 20.79 т, 21.10 т (С^11'), 25.54 т (С^12'), 25.99 т (С^8'), 28.56 к, 28.58 к (С^15'), 37.92 т (С^2' ), 38.41 т (С^7'), 38.98 т (С^4'), 40.10 с, 40.15 с (С^1'), 44.07 с (С^10' ), 46.81 т, 46.82 т (СН₂), 46.93 т, 47.00 т (С ²), 47.19 д (С⁶), 50.66 д, 50.72 д (С⁵ ), 50.98 к (ОСН₃), 55.28 д, 55.59 д (С^5' ), 56.01 д (С^9'), 81.66 д, 81.70 д (С⁷ ), 89.60 с, 89.68 с (С¹), 106.20 т, 106.24 т (С ^13'), 127.58

д (С^4'' ), 127.77 д, 127.82 д (С^2'',6''), 127.99 д, 128.29 д (С⁸), 128.69 д (С^3'',5'' ), 135.16 с, 135.18 с (С^1''), 147.42 с, 147.63 с (С^6'), 149.60 с, 149.81 с (С⁹), 172.02 с, 172.09 с (С⁴), 173.57 с (СО₂Н), 177.42 с (С¹⁴). Найдено, %: С 72.79; Н 7.40; N 2.55. C ₃₃H₄₆NO₆. Вычислено, %: С 72.53; Н 7.33; N 2.56.

Пример 2. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатита.

Острый токсический гепатит вызывали у беспородных мышей-самцов путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора ССl ₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,1 мл на 10 г массы тела. Соединение (I) вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до воспроизведения гепатита. Контрольным животным аналогично вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме, группе сравнения - дигидрокверцетин в дозе 100 мг/кг. Через сутки в сыворотке крови мышей определяли с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon», «Ольвекс Диагностикум») активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».

Установлено, что соединение (I) в условиях токсического гепатита оказывает достоверный антицитолитический эффект, снижая активность АЛТ и ACT в крови соответственно в 1.5 и 1.9 раз по сравнению с контролем. По влиянию на уровень АЛТ агент (I) не уступает, а по влиянию на ACT - превосходит референс-соединение в 1.6 раза. Обнаружено, что под действием соединения (I) заметно понижается уровень ЩФ (в 1.5 раза по сравнению с контролем), что свидетельствует о антихолестазном действии агента. По выраженности антихолестазного эффекта соединение (I) не уступает ДКВ. Оба агента в условиях данного опыта не проявили влияния на интенсивность процессов перекисного окисления: концентрация МДА в соответствующих группах не имела достоверных различий с контролем (табл.1).

Таблица 1
Влияние соединения (I) на биохимические показатели сыворотки крови мышей с индуцированным ССl4 гепатитом
Группа	Биохимические показатели
АЛТ, мккат/л	ACT, мккат/л	ЩФ, мккат/л	МДА, мкмоль/л
Контроль	880,80±37,12	554,00±48,34	2,91±0,26	3,56±0,35
(I)	592,47±40,76***	301,46±29,36**	1,97±0,27*	3,89±0,22#
ДКВ	577,24±25,81***	480,47±41,14	2,18±0,14*	3,28±0,11
*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 - различия с контролем достоверны; #Р<0,05 различия с ДКВ достоверны

Таким образом, показано, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг обладает гепатопротекторным действием, снижая выраженность цитолитических и холестатических процессов на фоне токсического гепатита.

Пример 3. Исследование гепатопротекторных и антиоксидантных свойств на фоне токсического поражения крыс циклофосфаном

Эксперимент проводили на крысах-самках Вистар, которым вводился однократно внутрибрюшинно циклофосфан в дозе 125 мг/кг (в растворе 0.9% NaCl). Соединение (I) вводилось в желудок 12 крысам в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ (в виде водно-твиновой взвеси). Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контролем являлись животные с введением только ЦФ (10 шт.). В конце опыта в сыворотке крови исследовали с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon», «Ольвекс Диагностикум») активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего белка и глюкозы. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли общепринятым методом [9].

Результаты представлены в табл.2. Установлено, что в данных условиях как соединение (I), так и референс-препарат не оказали существенного влияния на активность АЛТ. В отношении ACT соединение (I) проявило лишь тенденцию к понижению активности (в 1,3 раза по сравнению с контролем), тогда как ДКВ вызвал небольшое, но достоверное уменьшение активности данного фермента в крови (в 1.4 раза). У соединения (I) обнаружена явно выраженная тенденция к антихолестазному действию: активность ЩФ под влиянием соединения (I) снижалась относительно контроля и ДКВ соответственно в 1.3 и 1.4 раза. У референс-агента антихолестатического эффекта не обнаружено. Концентрация МДА у животных с введением агента (I) была в 1.3 раза меньше, чем в группе с введением ДКВ, который в условиях данного опыта усилил интенсивность перекисного окисления. Влияния обоих агентов на показатели общего обмена (белок, глюкозу) не отмечено.

Из данных таблицы видно, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг на фоне циклофосфанового поражения уступает ДКВ по антицитолитическим свойствам, но превосходит его по антихолестатическому и антиоксидантному эффекту.

Таблица 2
Влияние соединения (I) на средние значения биохимических показателей сыворотки крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаном
Группа	АЛТ, мкат/г белка	ACT, мкат/г белка	ЩФ, мкат/г белка	МДА, мкмоль/л	Общий белок, г/л	Глюкоза, моль/л
контроль	54,3±6,8	73,9±7,9	129,0±9,5	1,93±0,09	63,1±2,34	16,43±1,02
(I)	58,4±7,2	58,4±5,5	102,6±15,8	1,93±0,08	65,27±4,12	14,29±0,91
ДКВ	55,2±5,2	53,7±3,9*	146,3±13,6	2,57±0,09*	63,14±1,52	14,19±0,70
*Р<0,05 - различия с контролем достоверны

Пример 4. Исследование гемостимулирующего действия на фоне токсического поражения крыс циклофосфаном

Эксперимент проводили на крысах-самках Вистар, которым вводился однократно внутрибрюшинно циклофосфан в дозе 125 мг/кг (в растворе 0.9% NaCl). Соединение (I) вводилось в желудок 12 крысам в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ (в виде водно-твиновой взвеси). Препарат сравнения - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контролем являлись животные с введением только ЦФ (10 шт.). В конце опыта с помощью гемоанализатора MEDONIC определяли морфологический состав периферической крови. Лейкоцитарную формулу подсчитывали под микроскопом в мазках крови, окрашенных гематоксилинэозином.

Результаты представлены в табл.3. Установлено, что соединение (I) проявляет тенденцию к уменьшению цитопении, вызванной циклофосфаном, повышая количество лейкоцитов и тромбоцитов относительно контроля соответственно в 1.4 и 1.2 раза. Гемостимулирующий эффект дигидрокверцетина проявился в виде тенденции к увеличению в 1.6 раз количества лейкоцитов. Оба соединения характеризуются небольшим достоверным повышением количественных показателей гемоглобина в эритроцитах (МСН, МСНС). В то же время под действием ДКВ наблюдалось небольшое достоверное снижение количества эритроцитов и гематокрита.

Таблица 3
Влияние соединения (I) на средние значения показателей периферической крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаном
Группа	RBC	НСТ	WBC	НGВ	PLT	MCV	RDW%	MPV	МСН	МСНС
контроль	5,06±0,21	28,0±1,2	0,9±0,1	15,5±0,8	93,9±8,4	55,3±1,0	10,2±0,4	8,8±0,01	30,6±0,6	55,5±0,6
(I)	4,77±0,19	26,2±1,0	1,3±0,1	15,6±0,7	109,6±11,9	54,9±0,6	10,3±0,2	8,3±0,03*	32,8±0,5*	59,7±1,0*
ДКВ	4,19±0,20*	22,6±0,9*	1,4±0,2	14,2±0,6	88,3±8,9	55,3±0,8	10,2±0,6	8,3±0,1*	33,9±0,3*	61,3±0,8*
Норма	6,87±0,14	38,7±0,7	17,0±0,9	19,7±0,6	257,0±21,2	57,1±0,9	13,3±0,7	9,0±0,1	29,7±0,5	52,0±0,4
*Р<0,05 - различия с контролем достоверны
RBC - количество эритроцитов, НСТ - гематокрит, WBC - количество лейкоцитов, НGВ - гемоглобин, PLT - тромбоциты, MCV -средний объем эритроцитов, RDW% - процент распределения по абсолютному весу красной крови, MPV - объем тромбоцитов, МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроците, МСНС - средняя концентрация гемоглобина.

На фоне нейтропении, вызванной циклофосфаном, под действием соединения (I) наблюдалась тенденция к увеличению количества гранулоцитарных клеток: количество сегментоядерных нейтрофилов увеличилось в 1.8 раз по сравнению с контролем, появились юные нейтрофилы. В этой же группе животных выявлен относительный моноцитоз, который выражался в 2.5-кратном увеличении числа моноцитов по сравнению с контролем. Отмеченная тенденция к стимуляции клеток лейкоцитарного ряда под действием соединения (I) была более выраженной, чем у ДКВ (табл.4).

Таблица 4
Влияние соединения (I) на средние значения показателей лейкоцитарной формулы крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаном
Группа	эозинофилы	п/ядерные	с/ядерные	Моноциты	Лимфоциты
контроль	0	0	1,43±0,48	2,43±0,81	96,14±0,51
(I)	0	0,14±0,14	2,57±0,84	6,0±1,0	91,29±1,02
ДКВ	0	0	0,71±0,29	4,71±0,47	94,57±0,48
Норма	0,86±0,46	0	19,29±1,44	7,14±1,06	72,61±1,44

Таким образом, показано, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг на фоне гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана, превосходит ДКВ по гемостимулирующему действию.

Источники информации

1. М.Д.Машковский. Лекарственные средства. В 2-х т. Харьков: «Торсинг», 1998, т. 2, с.55.

2. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А. Клюева, Э.А.Бабаяна. М., Медицина, 1979, с.61-65.

3. М.Б.Плотников, Н.А.Тюкавкина, Т.М.Плотникова. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск: Изд-во Томского университета, 2005, 228 с.

4. М.Л.Гершанович, В.А.Филов, М.А.Акимов, А.А.Акимов. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. Санкт-Петербург: Сатис, 1999, 152 с.

5. В.А.Тутельян, М.М.Гаппаров, Л.Ю.Телегин, В.М.Девиченский, Л.А.Певницкий, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003, т. 136, № 12, с.604.

6. Т.Г.Толстикова, И.В.Сорокина, М.П.Долгих, Ю.В.Харитонов, С.В.Чернов, Э.Э.Шульц, Г.А.Толстиков. Химико-фармацевтический журнал. 2004, т. 38, № 10, с.13-15.

7. С.В.Чернов, Э.Э.Шульц, М.М.Шакиров, Г.А.Толстиков. Журнал органической химии. 2000, т.36. № 8. с.1493-1498.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва: Медицина, 2000, с.832.

9. Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000, т.2, с.207.