ассоциированная вакцина против ротавирусной и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Формула изобретения

1. Ассоциированная вакцина против ротавирусной и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота (KPC) эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, сем. Reoviridae, рода Rotavirus, коллекция ФГУ «ВГНКИ» № 101 ВНИИЗЖ-ДЕП, и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, сем. Coronaviridae, рода Coronavirus, коллекция ФГУ «ВГНКИ» «ВНИИЗЖ-ДЕП», полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата.

2. Ассоциированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток почки теленка MDBK, из культуры клеток свиной почки СПЭВ, из культуры клеток почки зеленой мартышки Marc-145, из культуры клеток почки обезьяны Vero и из культуры клеток коронарных сосудов теленка КСТ, в эффективном количестве.

3. Ассоциированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в иммуноферментном анализе (ИФА) не менее 5,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

4. Ассоциированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

5. Ассоциированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток Marc-145 со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

6. Ассоциированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

7. Ассоциированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток KTC со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см ³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

8. Ассоциированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток почки теленка Таурус-1, из культуры клеток КСТ и из культуры клеток Vero, в эффективном количестве.

9. Ассоциированная вакцина по п.8, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10 ⁸ вирусных частиц/см³ и активностью в реакции гемагглютинации (РГА) не менее 7,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

10. Ассоциированная вакцина по п.8, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Таурус-1 со степенью накопления не менее 10 ⁹ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

11. Ассоциированная вакцина по п.8, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток KCT со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

12. Ассоциированная вакцина по п.8, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

13. Ассоциированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит масляный адъювант в количестве не менее 70,0 мас.%.

14. Ассоциированная вакцина по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученных в культурах клеток животного происхождения, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
№ 101 ВНИИЗЖ вируса ротавируса KPC, полученного в
культуре клеток животного происхождения, взятой
из группы, состоящей из культуры клеток MDBK, из
культуры клеток СПЭВ, из культуры клеток Marc-145,
из культуры клеток Vero и из культуры клеток KTC,
со степенью накопления не менее 106 вирусных
частиц/см 3 и активностью в ИФА не менее 5,0 log2	15,0
Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
«ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре
клеток животного происхождения, взятой из группы,
состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток
Таурус-1, из культуры клеток KCT и из культуры клеток
Vero, в концентрации вирусных частиц,
обеспечивающей протективную иммунную активность
в организме животного при введении ему
целевого препарата	15,0
Масляный адъювант	До 100,0

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается ассоциированной вакцины для специфической профилактики желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота (КРС), преимущественно телят, обусловленных возбудителями ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС.

В структуре заболеваний телят в ранний постнатальный период превалирующее место занимают нарушения функции пищеварительной системы, клинически проявляющиеся диареей, обуславливающей развитие выраженной дегидратации, токсемии, иммунодефицитов, нарушения обмена веществ.

Этиопатогенетически поражения органов пищеварения отмечаются значительным полиморфизмом, включающим широкий спектр различных факторов, в том числе генетических, физиологических, санитарно-гигиенических и инфекционных. Массовые нарушения функции пищеварения, клинически проявляющиеся диареями, регистрируются у 70-100% новорожденных телят уже к концу первых суток после рождения. Больные телята отказываются от молозива, мало подвижны, быстро наступает обезвоживание, интоксикация и резко понижается тонус. Гибель новорожденных телят, как правило, наступает на 2-5-й или 7-10-й дни. Обычно погибает от 15 до 55% новорожденных телят (1, 2, 3).

Основной причиной гастроэнтеритов новорожденных телят являются инфекционные агенты, в том числе вирусы, бактерии, простейшие и грибы, вирулентность которых повышается на фоне различных неблагоприятных условий содержания и кормления. Возбудители инфекционных заболеваний попадают в организм обычно в первый день жизни телят (4, 5).

Принято считать, что вирусы являются пусковым механизмом для развития патологии кишечника. При диареях новорожденных телят выделяют преимущественно ротавирус и коронавирус. Эти вирусы играют ведущую роль в этиологии желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят, особенно в крупных животноводческих хозяйствах (5, 6, 7).

Ротавирусная инфекция КРС широко распространена во всех странах мира и наносит большой экономический ущерб промышленному животноводству за счет высокого уровня заболеваемости телят, смертности в результате диареи, потери массы тела животных и снижения сопротивляемости другим инфекциям.

Ротавирусы КРС характеризуются значительным антигенным полиморфизмом и нестабильностью антигенной структуры. Сложная структура генома, в том числе его фрагментарность, и относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают постоянную возможность модификации его антигенной структуры и энзоотическое течение заболевания в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания животных.

Для специфической профилактики ротавирусного энтерита применяют живые и инактивированные вакцины, которыми прививают глубокостельных коров. При этом практическое значение для профилактики ротавирусной диареи новорожденных телят имеют колостральный иммунитет, обусловленный поступлением с молозивом в организм новорожденных телят специфических антител, нейтрализующих возбудитель в просвете тонкого кишечника, а также иммунокомпетентных клеток и других протективных факторов

Коронавирусная инфекция у КРС проявляется в виде коронавирусной диареи новорожденных телят, коронавирусной зимней дизентерии взрослого КРС и коронавирусной респираторной инфекции.

Чрезвычайно широкое распространение, тенденция вызывать длительную персистенцию, относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают энзоотическое течение болезни в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания и кормления. Стационарность болезни поддерживается за счет длительной персистенции возбудителя коронавирусной инфекции в организме животных-реконвалесцентов.

Важными условиями успешной борьбы с вышеуказанными заболеваниями являются их своевременная и правильная диагностика и проведение специфической профилактики, для которой применяются живые и инактивированные вакцины как в виде моно-, так и ассоциированных препаратов (8, 9, 10).

Преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты при применении не вызывает сомнений. Однако иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации: вакцина может вызвать повышенную реактогенность, иммуносупрессию, а иногда и гибель до 2% животных при вакцинации в зависимости от условий содержания и наличия коинфекций, проблемы воспроизводства, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. По этой причине они не нашли широкого применения.

Для специфической профилактики указанных заболеваний используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в культуре клеток животного происхождения, выбранной из группы, состоящей из культуры клеток почек теленка MDBK и культуры клеток свиной почки СПЭВ, со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см ³ и активностью в иммуноферментном анализе (ИФА) не менее 5,0 log₂, и в качестве целевых добавок гидроокись алюминия (ГОА) и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4 (11).

Известна вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток Таурус-1, из культуры клеток КСТ и из культуры клеток Vero, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективном соотношении (12).

Недостатки моновалентных инактивированных вакцин заключаются в том, что они стимулируют образование иммунитета у животных только к одной инфекции, требуют проведения профилактических обработок против каждой инфекции в отдельности, что сказывается на затратах труда, увеличивают сроки формирования иммунитета у животных, способствует возникновению стрессовых явлений и осложнений.

Указанные недостатки частично устранены созданием ассоциированных вакцин, содержащих отдельно или в сочетании возбудителей ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС различных штаммов.

В ряде случаев в состав известных вакцин, особенно предназначенных для защиты телят, включают антигены возбудителей, вызывающих вторичные инфекции.

Известна ассоциированная вакцина против энтеральной инфекции новорожденных телят эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса, из штамма BCV 9 (CAPM V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4804 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий E.coli КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении (13).

Известна ассоциированная вакцина против вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма VDV-Oregon-C24 V (CAPM V-293) вируса ВД-БС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4804 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий E.coli КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (14).

Известна ассоциированная вакцина против инфекционного ринотрахеита (ИРТ), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-PTOB-8 INRV № 3760 вируса ИРТ, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий E.coli КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (15).

Известна ассоциированная вакцина против парагриппа-3 (ПГ-3), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма РI-3/T ₁/11 V-30 вируса ПГ-3 КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4808 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий E.coli КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (16).

Известна ассоциированная вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диарей новорожденных телят сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «III-1» Bovine rotavirus, из штамма «СМ-1» Bovine coronavirus, из штамма «ТКА-ВИЭВ-В 2» Bovine Herpesvirus и из штаммов бактерий E.coli, содержащих адгезины К₉₉ и А₂₀, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (17).

Известна ассоциированная вакцина против рота- и коронавирусной инфекций, эшерихиоза и клостридиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов Cody 81-4,10 В223 типа G и В 641 ротавируса КРС, штамма Mebus (АТСС № VR-874) коронавируса KPC, штаммов В41, В43, В44 и В141 бактерий E.coli и штамма GL 47 (АТСС РТА-3000) бактерий Clostridium perfringens, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (18).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезни телят «КОМБОВАК» сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из 6 (шести) производственных штаммов вирусов - возбудителей: ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезни KPC, - полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (19).

Известна ассоциированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов КРС и телят сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов В-25 и ТК-А вируса ИРТ KPC, из штаммов BD-N и BD-R вируса ВД-БС KPC, из штаммов В-19 и ПТК-45/86 вируса ПГ-3 KPC, из штаммов КВ-90 и К-22 коронавируса KPC и из штаммов PC-89 и PC-71 возбудителя респираторно-синцитиальной инфекции KPC, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (20).

Известен также способ количественной оценки вируссодержащих суспензий с помощью электронной микроскопии, возникший как результат многолетних опытов по электронно-микроскопическому контролю вирусных препаратов и сопоставлению его данных с показателями биологических тестов, например титром инфекционности вируса (21).

Авторами данного способа установлена зависимость между титром инфекционности нативных суспензий вируса ящура и количеством физических вирусных частиц, наблюдаемых под электронным микроскопом, что послужило основанием для определения общей концентрации вирусных частиц в единице объема суспензии (степень накопления вирусных частиц в определенном объеме жидкости).

Для определения общей концентрации (N) вирусных частиц в единице объема анализируемой суспензии на экране электронного микроскопа площадью S₂ подсчитывают число одновременно наблюдаемых частиц n. По известному инструментальному увеличению электронного микроскопа (М) определяют размер участка пленки-подложки S₁, соответствующего полезной площади экрана:

.

При нанесении вирусных препаратов на пленки-подложки концентрация вирусных частиц n на данном участке S₁ соответствует суммарному количеству адсорбированных частиц и частиц, осажденных на подложку при испарении остаточной жидкости. Следовательно, наблюдаемое одновременно на экране число частиц распределяется в микрообъеме, равном:

v=S ₁·I, где:

I - толщина остаточного слоя жидкости на подложке (мм).

В определяемом объеме вируссодержащей суспензии число частиц равно:

,

после замены значений v и S₁ :

, где:

V - объем анализируемой суспензии (1 см³);

N - среднее арифметическое ряда значений числа частиц, просчитанных с экрана электронного микроскопа или экспонированных фотопластинок.

Толщину остаточного слоя I на подложке измеряют предварительно охлажденным микрометром после замораживания жидкости на подложке в парах жидкого азота. Она составляет 0,03-0,04 мм и ее принимают как постоянную величину.

Электронно-микроскопическое определение концентрации физических вирусных частиц позволяет не только определять количественную характеристику вируса в анализируемых суспензиях, но и одновременно оценивать морфологическое состояние исследуемых вирусных частиц.

Указанный способ оказался универсальным и пригодным для определения количественной характеристики различных вирусов в исследуемых жидкостях.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является ассоциированная вакцина против рота- и коронавирусных инфекций KPC эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма ТМ-91 (CAMP V-279) ротавируса KPC, полученного в культуре клеток почки теленка MDBK с инфекционной активностью от 10³ до 10⁵ ТЦД₅₀ , и из штамма BCV 9 (CAMP V-280) коронавируса KPC, полученного в культуре клеток MDBK с гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью) 1:256-1:512, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (13).

Общим существенным недостатком известных ассоциированных вакцин, в том числе вакцины-прототипа, предназначенных для профилактики рота- и коронавирусной инфекций KPC различных половозрастных групп, является их недостаточно высокая эффективность вследствие:

1) неполноценности (неполноты) антигенного состава входящих в них ингредиентов и сложных взаимодействий антигенов, из которых они изготовлены;

2) узости антигенного спектра действия используемых штаммов;

3) низкой иммуногенной активности препаратов. Причиной этого явления может быть использование для инактивации вирусов формалина, вызывающего деструктивные изменения вирусных белков.

Поэтому проблема создания ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC, преимущественно новорожденных телят, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по ее совершенствованию.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных различных половозрастных групп против возбудителей рота- и коронавирусной инфекций KPC, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионных инактивированных, способных защитить поголовье KPC различных половозрастных групп от возбудителей рота- и коронавирусной инфекций KPC, циркулирующих на территории России.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма № 101 ВНИИЗЖ (авторское наименование) ротавируса KPC и из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) коронавируса KPC, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Ассоциированная вакцина против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. В качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата.

4. Целевая добавка.

5. В качестве целевой добавки масляный адъювант.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Ассоциированная вакцина против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевая добавка.

По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток почки теленка МОВК, из культуры клеток свиной почки СПЭВ, из культуры клеток почки зеленой мартышки Marc-145, из культуры клеток почки обезьяны Vero и из культуры клеток коронарных сосудов теленка КСТ, в эффективном количестве.

2. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в иммуноферментном анализе (ИФА) не менее 5,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

3. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

4. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток Marc-145 со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

5. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

6. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре клеток КСТ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см ³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

7. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток почки теленка Таурус-1, из культуры клеток KCT и из культуры клеток Vero, в эффективном количестве.

8. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/см³ и активностью в реакции гемагглютинации (РГА) не менее 7,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

9. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Таурус-1 со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

10. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток KCT со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

11. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

12. Масляный адъювант в количестве не менее 70,0 мас.%

13. Смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученных в культурах клеток животного происхождения, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
№ 101 ВНИИЗЖ вируса ротавируса KPC, полученного в
культуре клеток животного происхождения, взятой
из группы, состоящей из культуры клеток MDBK,
из культуры клеток СПЭВ, из культуры клеток Marc-145,
из культуры клеток Vero и из культуры клеток KCT,
со степенью накопления не менее 106 вирусных
частиц/см 3 и активностью в ИФА не менее 5,0 log2	15,0
Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
«ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре
клеток животного происхождения, взятой из группы,
состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток
Таурус-1, из культуры клеток KCT и из культуры клеток
Vero, в концентрации вирусных частиц, обеспечивающей
протективную иммунную активность в организме
животного при введении ему целевого препарата	15,0
Масляный адъювант	до 100,0.

Входящие в предлагаемую вакцину штаммы вирусов известны и являются производственными при изготовлении моновакцин (22, 23).

В результате проведенных исследований авторами установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция.

Авторами обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вируссодержащих материалов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого препарата достигается также за счет использования в его составе масляного адъюванта марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Вакцинный штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC адаптирован к культурам клеток MDBK, СПЭВ, Vero, Marc-145 и KCT.

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным наименованием: культуральный штамм № 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса KPC.

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC характеризуется следующими признаками и свойствами (22).

Морфологические свойства

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции KPC: сферическая форма диаметром 65-75 нм, имеющая вид «колеса». Вирион состоит из сердцевины, внутреннего и наружного капсида. Сердцевина диаметром 40-45 нм имеет гексагональную форму и состоит из 3-х белков (VP1, VP2 и VP3) и РНК. Внутренний капсид (диаметр 15-20 нм) имеет икосаэдрическую форму и построен из 260 морфологических единиц, каждая из которых представлена белком VP6. Наружный капсид представлен белком VP7. На поверхности наружного капсида расположены «шипики», представленные димером белка VP4.

Плавучая плотность полных вирионов ротавируса KPC в градиенте хлористого цезия составляет 1,36 г/см³, а однокапсидных частиц 1,38 г/см³ . Коэффициент седиментации полных частиц составляет 500-530 S, а однородных частиц 380-400 S.

Антигенные свойства

Антиген ротавируса KPC штамма № 101 ВНИИЗЖ индуцирует в организме иммунизированных морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции диффузионной преципитации (РДП) в разведениях от 1:16 до 1:64. В ИФА сыворотки положительно реагировали в разведениях от 1:128 до 1:2048, в реакции связывания комплемента (РСК) от 1:40 до 1:160.

В сыворотках крови глубокостельных коров через 10 дней после второй вакцинации антитела к ротавирусу в ИФА выявляли в титрах от 8,2 до 10,8 log₂, в молозиве от вакцинированных коров титры антител к ротавирусу в ИФА составляли 8,8-14,0 log₂. Скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (7,0-8,5 log₂ ) в организме телят.

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC обладает широким антигенным спектром и доминантностью. Средний показатель двустороннего антигенного родства (R%) используемого штамма в реакции нейтрализации (РН) с 12-эталонным и эпизоотическими штаммами ротавируса KPC составил 56,3%.

Результаты исследований, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC доминирует над изученными возбудителями ротавирусной инфекции KPC.

Биотехнологические характеристики

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC адаптирован к культурам клеток MDBK, СПЭВ, KCT. Vero и Marc-145 и репродуцируется в них в течение 18-48 часов при 37°С со степенью накопления от 10⁶ до 10⁸ вирусных частиц/см³. Результаты исследований по адаптации штамма № 101 ВНИИЗЖ к указанным культурам клеток представлены в таблице 2.

Штамм № 101 ВНИИЗЖ сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в указанных культурах на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).

Устойчивость к внешним факторам

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC устойчив к хлороформу, фреону, эфиру, кислой (рН 4,0) и щелочной (рН 8,0) средам. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина.

Инактивированный антиген ротавируса KPC штамма № 101 ВНИИЗЖ устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцинных препаратов.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированных вакцинных препаратов, препарата для гипериммунизации доноров диагностических сывороток и антительных лечебных препаратов.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в перевиваемых культурах клеток на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуры клеток MDBK и СПЭВ.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC можно использовать культуры клеток Marc-145, Vero и KCT.

Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием и производят контроль вирусного сырья. Производственная серия ротавируса KPC должна иметь степень накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см ³ и активность в ИФА не менее 5,0 log₂.

Для инактивации ротавируса используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию антигена 1М раствора тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в чувствительной биологической системе со степенью накопления не менее 10 ⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Производственный штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC адаптирован к культурам клеток MDBK, Таурус-1, KCT и Vero.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC характеризуется следующими признаками и свойствами (23).

Морфологические признаки

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции KPC: сферический или плеоморфный вирион диаметром 80-100 нм состоит из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются булавовидные выступы длиной 18-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы составляет 1,15-1,18 г/см³.

В составе вирионов обнаружены три структурных белка: пепломерный гликопротеин Е2 (180-200 кД), нуклеокапсидный фосфопротеин N (50-60 кД) и матриксный гликопротеин Е1 (23-30 кД).

Антигенные свойства

Антиген коронавируса KPC штамма «ВНИИЗЖ» индуцирует в организме морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В сыворотках крови вакцинированных кроликов уровень антител колеблется от 5,4±0,25 до 7,25±0,47 log₂ (в среднем 6,32±0,39 log₂), а в сыворотках крови иммунизированных морских свинок - от 5,4±0,38 до 8,2±0,8 log₂ (в среднем 6,1±0,49 log₂).

В сыворотках крови проб, отобранных за 10-15 дней до отела, дважды вакцинированных коров выявляются антитела в РТГА в титрах от 7,9±0,35 до 8,9±0,47 log₂.

Своевременное скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (до 8,0 log₂) в организме новорожденных телят.

Биотехнологические характеристики

Коронавирус KPC штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток почек теленка (MDBK, Таурус-1), коронарных сосудов теленка (KCT) и в гетерологичной культуре клеток почек обезьяны (Vero). При 37°С в течение 3-4 суток инкубирования вирус накапливается в количестве до 10⁸ вирусных частиц/см ³ (данные электронно-микроскопического исследования). Результаты исследований по адаптации коронавируса KPC штамма «ВНИИЗЖ» к культурам клеток MDBK, Таурус-1, Vero и KCT представлены в таблице 3.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC обладает способностью в культуре клеток MDBK репродуцироваться с такой же степенью накопления при 34°С. Срок репродукции при этой температуре увеличивается почти на сутки, однако позволяет получать двойной урожай вируса путем смены поддерживающей среды. «Слив» обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC проявляет максимальную устойчивость в диапазоне pH 6,0-7,2. Кислая (pH 3,0) и щелочная (pH 11,0) среды оказывают на вирус инактивирующее действие. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина. Вирус разрушается жирорастворителями: хлороформом, метиленхлоридом, эфиром, твином и тритоном Х-100. Инактивированный антиген коронавируса KPC штамма «ВНИИЗЖ» устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцин.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK в течение 30 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуру клеток MDBK.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC можно использовать культуры клеток Таурус-1, KCT и Vero.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1%. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию антигена 1М раствора тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления предлагаемой вакцины используют в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного преимущественно в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 7,0 lоg₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая ассоциированная вакцина может содержать в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Таурус-1 со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 9,0 log ₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая ассоциированная вакцина может содержать в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток KCT со степенью накопления не менее 10 ^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая ассоциированная вакцина может содержать в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

Полученный таким образом антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC используют для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины.

Для получения ассоциированной вакцины антигенные материалы смешивают в равных весовых долях и смесь тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в гомогенизаторе в соотношении, мас.%: 30,0:70,0.

Из масляных адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

Содержание антигенов в предлагаемой вакцине в указанном выше соотношении является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Использование предлагаемого изобретения расширяет арсенал высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионных инактивированных, способных защитить поголовье KPC различных половозрастных групп от возбудителей рота- и коронавирусной инфекций KPC, циркулирующих на территории России.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его реализации и использования.

Пример 1

Для получения ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной используют производственные штаммы вирусов: штамм № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC и штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC.

Посевной вирус производственного штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, хранившийся при минус 20°С, размораживают и подогревают до 37°С. К суспензии добавляют трипсин до концентрации 15-20 мкг/см³ и термостатируют при 37°С в течение 30 минут. Перед заражением культуру клеток MDBK или СПЭВ с качественным монослоем дважды отмывают от ростовой сыворотки раствором Хенкса. В культуральные сосуды вносят вирус, обработанный трипсином. Доза заражения должна составлять 0,1-1,0 вирусных частиц/клетку. После заражения в культуру клеток вносят поддерживающую питательную среду, содержащую трипсин в концентрации 10-15 мкг/см³. Сосуды инкубируют при 37°С до появления ЦПД вируса более чем в 90% клеток монослоя (24-48 часов). Полученную вируссодержащую суспензию замораживают-оттаивают. Охлажденную суспензию очищают от балластных примесей низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин) в течение 30 минут. Полученный вирус подвергают контролю на инфекционную и антигенную активность. Производственная серия ротавируса должна иметь инфекционную активность не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активность в ИФА не менее 4,0 log₂.

Инактивацию вируса проводят рабочим раствором АЭЭИ. Во избежание изменения pH вирусной суспензии раствор АЭЭИ предварительно доводят 5М раствором уксусной кислоты до pH 7,8-8,2. Конечная концентрация инактиванта в вирусной суспензии должна быть не менее 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3-5 минут через каждые 5-6 часов). По окончании инактивации для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Затем антигенный материал охлаждают до 2-8°С и отбирают пробы для проверки на остаточную инфекционную активность в культуре клеток MDBK.

Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного преимущественно в монослойной культуре клеток MDBK или СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/см³ и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

Посевной вирус производственного штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC хранят перед использованием при температуре -20°С. Посевной вирус должен быть свободным от бактериальной и грибковой микрофлоры, специфичным, вызывать агглютинацию эритроцитов мышей, иметь активность в РГА не ниже 1:8 и концентрацию вирусных частиц (по результатам электронной микроскопии) в пределах от 10^5,0 до 10^6,5 вирусных частиц/см³ (21). Посевной коронавирус KPC дважды замораживают-оттаивают и используют для заражения монослойной культуры клеток MDBK. Перед заражением культуру клеток MDBK с качественным монослоем дважды отмывают от ростовой сыворотки раствором Хенкса, содержащим трипсин (15-20 мкг/см³ ). Множественность заражения составляет 0,1-1,0 вирусных частиц/клетку. После заражения культуральные сосуды инкубируют при 37°С в течение 1,5-2 часов, периодически покачивая. Затем производят слив вируссодержащего материала и в него вносят поддерживающую среду, содержащую трипсин (15-20 мкг/см³). Сосуды инкубируют при 34°С или 37°С до появления ЦПД вируса более чем в 90% клеток. После этого культуру дважды замораживают-оттаивают. Полученный вирусный материал очищают от балластных примесей низкоскоростным центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение 30 минут. Инактивацию вируса проводят с помощью АЭЭИ. Для этого в вируссодержащую суспензию вносят 6%-ный рабочий раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до значения pH 7,8-8,2. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть не менее 0,1%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3-5 минут через каждые 5-6 часов). Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением 1М раствора тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Полученный антигенный материал исследуют на стерильность, авирулентность, содержание вирусных частиц в суспензии с помощью электронного микроскопа и активность в РГА. Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного преимущественно в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10 ⁸ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 7,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости для изготовления предлагаемой вакцины можно использовать авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток KCT со степенью накопления не менее 10 ^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости для изготовления предлагаемой вакцины можно использовать авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10 ^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

Полученные таким образом антигенные материалы используют для изготовления предлагаемой ассоциированной вакцины. Для этого антигенные материалы смешивают в равных весовых долях и смесь тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в гомогенизаторе в соотношении, мас.%: 30,0:70,0 соответственно. Из масляных адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

Предлагаемая вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:

Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
№ 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре
клеток животного происхождения, взятой из группы,
состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры
клеток СПЭВ, из культуры клеток Marc-145,
из культуры клеток Vero и из культуры клеток KCT,
со степенью накопления не менее 106 вирусных
частиц/см 3 и активностью в ИФА не менее 5,0 log2	15,0
Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
«ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре
клеток животного происхождения, взятой из группы,
состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток
Таурус-1, из культуры клеток KCT и из культуры клеток
Vero, в концентрации вирусных частиц,
обеспечивающей протективную иммунную активность в
организме животного при введении ему
целевого препарата	15,0
Масляный адъювант	до 100,0.

Содержание антигенных материалов в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого или бело-розового цвета слегка вязкой консистенции. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла на верхней поверхности эмульсии и водной фазы на дне флакона толщиной не более 1 см.

Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89. Авирулентность препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей инактивированного антигена в перевиваемой культуре клеток MDBK по отсутствию ЦПД.

Для проверки безвредности вакцину вводят внутримышечно в область бедра 10 белым мышам в дозе 0,1 см³. Вакцина считается безвредной, если белые мыши в течение 10 суток остаются клинически здоровыми: без каких-либо патологических изменений. На месте введения препарата допускается местная тканевая реакция.

Вязкость вакцины определяют на вискозиметре ВПЖ-2 и выражают мм²/с. Предлагаемая вакцина, содержащая в своем составе масляный адъювант марки Montanide ISA-70, образующего тип эмульсии «вода-масло», имеет вязкость 38,3±0,5 мм² /с.

Контроль вакцины на стабильность эмульсии осуществляют посредством центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 минут, а также в процессе хранения при 2-8°С и 37°С с последующей визуальной оценкой однородности эмульсии. Вакцина с масляным адъювантом марки Montanide ISA-70 обладает высокой стабильностью эмульсии при хранении в различных температурных условиях и при центрифугировании.

Для проверки реактогенности препарата предлагаемую вакцину вводят внутримышечно в область бедра 3 кроликам и 5 морским свинкам в дозе 2,0 см ³ и 1,0 см³ соответственно. За клиническим состоянием животных ведут наблюдение в течение 14 суток.

После иммунизации у кроликов и морских свинок отмечено незначительное местное повышение температуры тела и образование припухлости диаметром около 1 см в месте введения. Эти признаки полностью исчезают к концу срока наблюдения.

Таким образом, предлагаемая вакцина относится к типу слабореактогенных препаратов.

Антигенную активность предлагаемой вакцины проверяют на кроликах. Для этого берут 6 кроликов массой 2,0-2,5 кг. Вакцину вводят 4 кроликам подкожно в область спины по 1,0 см³ . Через 14 суток после двукратного введения вакцины с интервалом 20-25 суток у кроликов берут из ушной вены по 2,0-3,0 см ³ крови. Кровь выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют ее на наличие антител к ротавирусу KPC в РДП и ИФА, а к коронавирусу KPC в РТГА. Невакцинарованных животных (2 головы) обескровливают одновременно с вакцинированными, отделяют сыворотку и ее используют для контроля.

Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенность, если титр вирусспецифических антител к ротавирусу в РДП не ниже 4,0 log ₂ или в ИФА не ниже 7,0 log₂, а к коронавирусу KPC в РТГА не ниже 5,0 log₂.

Ассоциированная вакцина против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионная инактивированная предназначена для иммунизации стельных коров и телят в хозяйствах, неблагополучных по данным заболеваниям. Специфическую профилактику начинают с иммунизации всего поголовья KPC. Вакцину вводят телятам и взрослому KPC внутримышечно в область средней трети шеи в объеме

2,0 см³ двукратно с интервалом 21-30 дней с последующей ревакцинацией через 6 месяцев.

Для поддержания благополучия по данным заболеваниям следует придерживаться следующей схемы вакцинации:

1. Нетелей и коров вакцинируют двукратно с интервалом 21-30 дней. Ревакцинация через 6 месяцев.

2. Глубокостельных коров вакцинируют двукратно с интервалом 21-30 дней за 60-65 дней и 40-45 дней до отела. Ревакцинация через 6 месяцев.

Иммунитет у вакцинированных животных формируется через 10-15 суток после второго введения вакцины и продолжается 6 месяцев.

Пример 2

Проведены испытания антигенной активности ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
№ 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре
клеток СПЭВ со степенью накопления 108 вирусных
частиц/см 3 и активностью в ИФА 5,0 log2	15,0
Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
«ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре
клеток MDBK со степенью накопления 108 вирусных
частиц/см 3 и активностью в РГА 7,0 log2	15,0
Масляный адъювант	до 100,0.

Антигенную активность полученной вакцины определяли по следующей схеме:

- определение уровня антител к рота- и коронавирусной инфекциям в сыворотках крови иммунизированных кроликов;

- определение уровня антител к ротавирусу и коронавирусу KPC в сыворотках крови вакцинированных глубокостельных коров и в сыворотках крови новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров и в молозиве.

Результаты исследований сывороток крови кроликов, привитых ассоциированной вакциной против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной, представлены в таблице 4.

Согласно данным, приведенным в таблице 4, испытуемая вакцина индуцировала в организме привитых кроликов образование вирусспецифических антител к ротавирусу в РДП в титрах 5,87±0,55 log₂ и в ИФА в титрах 8,90±0,17 log₂, а к коронавирусу в РТГА в титрах 6,79±0,30 log₂.

Для изучения влияния прививной дозы вакцины на иммунный ответ было сформировано 2 группы кроликов по 9 животных в каждой. Кроликам первой группы вводили образцы испытуемой вакцины в дозе 0,5 см³, а кроликам второй группы в дозе 1,0 см³. До вакцинации, через 21 день и 35 дней после вакцинации у животных брали пробы крови, полученные сыворотки исследовали в ИФА и РТГА для определения титров специфических антител к ротавирусу и коронавирусу KPC соответственно, которые выражали в виде log₂. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Полученные данные свидетельствуют о том, что испытуемая вакцина в дозе 0,5 см³ и 1,0 см³ на 35 день после вакцинации индуцирует образование антител к ротавирусу в титрах 8,88±0,27 log₂ и 10,08±0,35 log₂, а к коронавирусу в титрах 6,30±0,27 log₂ и 7,50±0,45 log ₂ соответственно, что также подтверждает существование зависимости «доза-эффект».

Предлагаемая вакцина была испытана на глубокостельных коровах. Результаты этих исследований представлены в таблице 6.

Данные, представленные в таблице 6, свидетельствуют о том, что испытуемая вакцина индуцирует в организме глубокостельных коров образование антител к ротавирусу и коронавирусу в высоких титрах.

Пример 3

Проведены испытания эффективности ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас%:

Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
№ 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC, полученного в культуре
клеток СПЭВ со степенью накопления 108 вирусных
частиц/см 3 и активностью в ИФА 5,0 log2	15,0
Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма
«ВНИИЗЖ» коронавируса KPC, полученного в культуре
клеток MDBK со степенью накопления 108 вирусных
частиц/см 3 и активностью в РГА 7,0 log2	15,0
Масляный адъювант	до 100,0.

В 11 животноводческих хозяйствах была испытана схема профилактики вирусных диарей, вызванных ротавирусом и коронавирусом KPC. Иммунизацию глубокостельных коров проводили предлагаемой вакциной за 40-45 и 20-25 дней до отела. Результаты вакцинации представлены в таблице 7.

Приведенные в таблице 7 данные свидетельствуют о том, что у 78% новорожденных телят, полученных от невакцинированных (контрольных) коров, регистрировались признаки диареи. В течение 20 дней в контрольной группе погибло 25,1% телят. У 11% новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров, отмечены нарушения пищеварения, из них пало 3,9% телят.

Источники информации

1. Литвин В.П., Поживал А.И. Инфекционные и инвазионные болезни телят. - Киев, 1991. - 207 с.

2. Миськевич С.В. Разработка реакции связывания комплемента для диагностики ротавирусной диареи телят: Автореф. дис. на соискание уч. степени канд. вет.наук. - Киев, 1985. - 22 с.

3. Огбу Огбоная, Онуфриев В.П., Скибицкий В.Г. и соавт. Опыты инактивирования ротавируса крупного рогатого скота // Тез. докл. Республ. научно-производ. конф. - Харьков, 1990. - с.262.

4. Онуфриев В.П., Скибицкий В.Г., Миськевич С.В. и соавт. Конструирование поливалентных комбинированных специфических биопрепаратов для профилактики желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят // Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных: Тез. докл. Респ. научно-произв. конф. - Минск, 1990. - с.14.

5. Скибицкий В.Г. Ротавирусная инфекция крупного рогатого скота (ротавирусный энтерит). - Киев. Укр. IHTEI, 1999. - 208 с.

6. Гаффаров Х.З., Иванов А.В., Непоклонов Е.А., Равилов А.З. Моно- и смешанные диареи новорожденных телят. - Казань: ФЭН, 2002. - 590 с.

7. Миськевич С.В. и Скибицкий В.Г. Профилактическая эффективность ассоциированной вакцины против смешанной рота- и коронавирусной инфекции крупного рогатого скота // Вет. мед. Украины. - 2000. - № 10. - с.18.

8. Инфекционные болезни животных: Справочник. Под ред. Д.Ф.Осидзе. - М.: Агропромиздат, 1987, 288 с.

9. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИИТИБП, 1998, 928 с.

10. Инфекционная патология животных: В 2 т. / под ред. А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронина. - М.: «Академкнига», 2006. - Т.1. - 911 с.

11. Пат. РФ № 2302258; A61K 39/15, A61P 31/12; 10.07.2007 г.

12. Пат. РФ № 2301079; A61K 39/215, A61P 31/12; 20.06.2007 г.

13. Пат. ЧССР № 238179; A61K 39/295, 01.05.1987 г. (прототип)

14. Пат. ЧССР № 249880; A61K 39/295. 39/108; 15.03.1988 г.

15. Пат. ЧССР № 250849; A61K 39/295, 39/108; 15.03.1988 г.

16. Пат. ЧССР № 250850; A61K 39/295, 39/108; 15.03.1988 г.

17. Пат. РФ № 2145236; A61K 39/295, 39/108, 39/215, 39/245, 39/12; C12N 7//00 (C12N 7/00, C12R 1:93); 10.02.2000 г.

18. WO 2002/062382; A61K 39/15, 39/215. 39/08, 39/108; 15.08.2002 г.

19. Наставление по применению вакцины инактивированной комбинированной против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезни телят КОМБОВАК, № 13-3-04/0703 от 20.03.2003 г., утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ РФ 20.03.2003 г.

20. Пат. РФ № 2261111, A61K 39/295, 27.09.2005 г.

21. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Узюмов В.Л. Определение концентрации частиц вируса ящура в суспензиях. - Ветеринария, 1983, № 1, 22-24.

22. Пат. РФ № 2264458; C12N 7/00, A61K 39/15; 20.11.2005 г.

23. Пат. РФ № 2268937; C12N 7/00, A61K 39/215, A61P 31/12; 27.01.2006 г.

Таблица 1 Результаты изучения антигенного родства (R%) штаммов ротавируса в реакции нейтрализации
№ № п/п	Наименование штаммов ротавируса	Среднее (R%) антигенное родство изучаемых штаммов
1	Тиверваль	31,6
2	Линкольн	44,5
3	SA-11	12,5
4	№ 101	56,3
5	3	21,3
6	ЛА	31,6
7	В	26,7
8	С	22,7
9	ВО	28,8
10	К	26,0
11	П	30,7
12	Д	32,8
13	Б	26,9

Таблица 2 Сравнение продуктивности различных клеточных культур при заражении штаммом № 101 ВНИИЗЖ ротавируса KPC
Культура клеток	Время репродукции (часы)	Концентрация вирусных частиц (частиц/см3)
MDBK	18-20	107,5-8,0
СПЭВ	18-20	108,0
Marc-145	24	106,5
Vero	48	106,0
KCT	48	106,0

Таблица 3 Чувствительность перевиваемых культур клеток к коронавирусу KPC штамма «ВНИИЗЖ»
Культура клеток	Накопление вирусных частиц в см3 (электронная микроскопия)	Титр в реакции гемагглюцинации (РГА) в log2
MDBK	107-9	7,0-10,0
Таурус-1	109	9,0-10,0
Vero	107,5	6,0-7,0
KCT	107,5	7,0

Таблица 4 Антигенная активность ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной п=3
№ № п/п	Средние титры антител (log2)
к ротавирусу в	к коронавирусу в РТГА
РДП	ИФА
1	6,02±0,51	8,22±0,15	6,40±0,28
2	5,80±0,76	8,74±0,12	7,40±0,36
3	4,87±0,72	7,56±0,20	6,60±0,21
4	5,90±0,51	8,62±0,11	7,20±0,31
5	6,03±0,74	8,20±0,20	6,28±0,34
6	5,80±0,76	9,12±0,20	7,30±0,33
7	6,20±0,20	10,06±0,12	7,00±0,48
8	5,42±0,41	9,10±0,35	6,60±0,19
9	6,30±0,70	10,10±0,01	6,70±0,26
10	6,35±0,20	9,35±0,24	6,50±0,27
Среднее значение	5,87±0,55	8,90±0,17	6,79±0,30

Таблица 5 Зависимость уровня иммунного ответа кроликов от величины прививной дозы ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной
Прививная доза, см3	Количество кроликов	Средний уровень антител после вакцинации, log2
к ротавирусу, ИФА	к коронавирусу, РТГА
21 день	35 день	21 день	35 дней
0,5	9	6,48±0,24	8,88±0,27	3,90±0,22	6,30±0,27
1,0	9	7,68±0,29	10,08±0,35	5,10±0,33	7,50±0,45

Таблица 6 Динамика образования антител к ротавирусу и коронавирусу KPC у глубокостельных коров, иммунизированных ассоциированной вакциной против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной
№ № п/п	Характеристика сывороток	Средний уровень антител к ротавирусу KPC в ИФА, log2	Средний уровень антител к коронавирусу KPC в РТГА, log2
1	Сыворотка крови коров до вакцинации	5,71±0,76	4,80±0,74
2	Сыворотка крови коров за 10-15 дней до отела	8,40±0,78	8,36±0,66
3	Молозиво - первый день после отела	12,10±0,68	9,80±0,66
4	Сыворотка крови 3-4 дневных телят, полученных от вакцинированных коров	7,86±0,42	7,70±0,53

Таблица 7 Результаты испытания ассоциированной вакцины против рота- и коронавирусной инфекций KPC эмульсионной инактивированной на глубокостельных коровах
№ п/п	Невакцинированные коровы (гол.)	Заболело телят (%)	Пало телят (%)	Вакцинированные коровы (гол.)	Заболело телят (%)	Пало телят (%)	Защищено телят (%)
1	20	70	25,0	52	13	3,8	96,2
2	22	77	31,8	36	18	2,7	97,3
3	56	88	23,2	393	11	2,5	97,5
4	24	79	25,0	28	14	3,5	96,5
5	57	72	22,8	124	15	3,2	96,8
6	62	81	27,4	268	13	6,3	93,7
7	102	79	29,4	143	8	2,8	97,2
8	66	67	24,2	98	13	2,0	98,0
9	45	89	28,9	173	9	5,2	94,8
10	56	88	21,4	215	8	6,1	93,9
11	34	68	17,6	156	10	5,1	94,9
Итого	544	78	25,1	1686	11	3,9	97,1