способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в

Формула изобретения

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита В, заключающийся в совместном культивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В с обработанными антигеном вируса гепатита В аутологичными дендритными клетками, отличающийся тем, что культивирование дендритных клеток проводят с неприлипающей фракцией мононуклеарных клеток в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита В.

В основе патогенеза хронического вирусного гепатита В лежит нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток. Персистенция вируса гепатита В развивается в результате подавления индукции и реализации иммунного ответа. Механизмами ускользания вируса из-под иммунного ответа являются: интеграция генома вируса в геном иммунокомпетентных клеток; изменение протективных эпитопов каждые 5-6 лет; истощение антивирусных Т-клонов; аутоагрессия против Т-клеток, экспрессирующих вирусные пептиды; блокирование представления собственных антигенов за счет снижения синтеза ФНО- ; репликация вируса в органах, не подлежащих иммунному надзору; персистенция вируса в иммунокомпетентных клетках и разобщение всех клеток иммунной системы. Стандартное лечение хронического вирусного гепатита В основано на применении интерферонов и противовирусных средств, подавляющих репликацию вируса. Лекарственная химиотерапия часто приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов возбудителей инфекции и поэтому становится неэффективной, кроме того, обладает выраженным гепатотоксическим действием. В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Эффективный иммунный ответ на вирус гепатита В связан с индукцией клеточного звена иммунного ответа, который в данном случае реализуется посредством Т хелперов 1 типа. Активность Т хелперов 1 типа напрямую зависит от представления им антигена и их направленной дифференцировки, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Дендритные клетки (ДК) усиливают врожденный иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, обеспечивают развитие иммунологической толерантности. В настоящее время активно исследуется возможность применения дендритных клеток для модуляции специфического иммунного ответа и развития новых методов иммунокоррекции. Это связано, прежде всего, с той ролью, которую ДК играют в организме в развитии иммунного ответа, в частности, дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, определяя направленность и активность иммунных реакций.

Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В путем культивирования в полной среде с добавлением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в течение 7 дней, незрелые ДК в течение 2 суток культивировались с ФНО- . Затем полученные дендритные клетки, обработанные антигенным пептидом HbcAg18-27 в течение последующих 5 суток культивировались совместно с аутологичными Т-клетками. Была показана стимуляция цитотоксической активности Т-клеток и увеличение количества ИФН- -продуцирующих CD8+ клеток в ответ на антигенный пептид HbcAg18-27. При этом МНК ПК, сокультивированные с ДК, обработанными специфическим белком, индуцируют специфическую Т клеточную реакцию, в которой уровень секреции цитокинов и литической аткивности выше, чем в реакции, индуцированной клетками памяти [Li RB, Chen HS, Xie Y, Fei R, Cong X, Jiang D, Wang SX, Wei L, Wang Y. Dendritic cells from chronic hepatitis В patients can induce HBV antigen-specific T cell responses. World J Gastroenterol 2004; 10(11): 1578-1582].

Направленность развития протективного иммунного ответа зависит от многих факторов, в том числе во многом от баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Интерлейкин-18 (ИЛ-18) - провоспалительный цитокин, который стимулирует продукцию ИФН- Т- и НК-клетками, тем самым, способствуя активации макрофагов и уничтожению инфицированных вирусом клеток. Показано, что культивация CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови детей, больных гепатитом В, в присутствии рекомбинантного НВс антигена и рекомбинантных ИЛ-18 и ИЛ-12 вызывает значительное увеличение антигенспецифической продукции ИФН- , что является основополагающим моментом противовирусной защиты организма Szkaradkiewicz A. [Szkaradkiewicz A, Jopek А, Wysocki J. Effects of IL-12 and IL-18 on HBcAg-specific cytokine production by CD4 T lymphocytes of children with chronic hepatitis В infection. // Antiviral Res. 2005 Apr; 66(1):23-7]. Культивация мононуклеарных клеток периферической крови взрослых больных гепатитом В в присутствии НВс антигена и ИЛ-18 также приводит к увеличению продукции ИФН- и усилению цитотоксической активности этих клеток против клеток линии HepG2.2.15, трансфецированной вирусом гепатита В [Sun Y, Chen HY, Xin SJ. Effect of IL-18 on peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis В and hepatitis В virus DNA released by HepG2.2.15 cell lines. // Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2004 May; 3(2):230].

Таким образом, для эффективной модуляции противовирусной защиты необходимо повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток, продуцирующих ИФН- .

Задачей настоящего изобретения является создание способа генерации максимально эффективных антиген-специфических цитотоксических клеток из периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В культивируют с обработанными антигеном вируса гепатита В дендритными клетками в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.

Техническим результатом изобретения является активация антиген-специфических иммунных реакций по Т-хелпер 1 типу на антиген вируса гепатита В с помощью цитотоксических ИФН- -продуцирующих клеток, полученных при сокультивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В с аутологичными антигенпрезентирующими дендритными клетками и интерлейкином-18 in vitro.

Предложенный способ позволяет генерировать клетки, обладающие высоким цитотоксическим потенциалом в отношении клеток, инфицированных антигенами гепатита В, за счет синергизма воздействия на модуляцию специфического иммунного ответа аутологичных активированных дендритных клеток и провоспалительного цитокина интерлейкина-18.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенные из периферической крови пациентов больных хроническим вирусным гепатитом В мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО₂ при 37°С с добавлением ГМ-КСФ (50 нг/мл) и ИЛ-4 (200 нг/мл). Через 24 часа культивирования к полученным незрелым ДК добавляется специфический антиген вируса гепатита В HBcAg в дозе 5 мкг/мл, а еще через 2 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФНО- в дозе 25 нг/мл.

Полученные дендритные клетки культивируются с мононуклеарными клетками неприлипшей фракции в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-18 в дозе 40 нг/мл.

Для определения эффективности модуляции противовирусного иммунного ответа с помощью полученных ДК оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген вируса гепатита В HBcAg (табл.1).

Таблица 1
Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных хроническим вирусным гепатитом В, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16).
Группы	Спонтанный пролиферативный ответ, имп/мин	НВсAg-стимулированный пролиферативный ответ, имп/мин
МНК	721,98±127,70	1102,54±308,65
МНК+рчИЛ-18	1560,47±644,18	2867,11±1325,05
МНК+ДК (без антигена)	4249,20±2403,54*(**)	6100,60±2975,46*
МНК+ДК (с антигеном)	5574,30±2090,43*	6047,00±2498,02*#
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18	8399,76±5560,53*(**)	11260,19±7325,00**
Примечание:	МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
	МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18
	МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся, антиген вируса гепатита В НВсAg
	МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg
	МНК+ДК (с антигеном) + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg с добавлением рчИЛ-18
** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
* - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+IL-18
# - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК (с антигеном)

Кроме того, для тестирования активации Т-хелперов 1 типа оценивали уровень продукции ИФН- в кондиционных средах от клеточных культур МНК в ответ на НВсAg с помощью иммуноферментного анализа (табл.2).

Таблица 2
Продукции ИФН- МНК пациентов, больных хроническим вирусным гепатитом В, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16).
	Содержание ИФН- в кондиционных средах МНК, пг/мл
	Спонтанная продукция	НВсAg-стимулированная продукция
МНК	12,29±3,37	16,06±5,02
МНК+IL-18	11,23±2,25	24,04±9,42
МНК+ДК (без антигена)	15,91±4,17	20,13±4,65
МНК+ДК (с антигеном)	16,39±3,48	23,39±5,89*
МНК+ДК (с антигеном)+IL-18	17,03±3,41**	34,39±17,85**
Примечание:	МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
	МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18
	МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген вируса гепатита В НВсAg
	МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg
	МНК+ДК (с антигеном) + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg с добавлением рчИЛ-18
** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
* - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+IL-18

Для исследования потенциальной цитотоксической активности определяли экспрессию молекул перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с антиген-активированными ДК в ответ на специфический антиген HBcAg. Перфорин - фактор цитотоксичности, мономерный белок, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, что приводит к лизису инфицированных клеток. Показано достоверное повышение количества перфорин-позитивных клеток, что служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения инфицированных клеток (табл.3).

Таблица 3
Уровень экспрессии внутриклеточного белка перфорина мононуклеарными клетками больных хроническим вирусным гепатитом В, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=8).
Группы	Спонтанная экспрессия перфорина (% позитивных клеток)	ESAT-6-стимулированная экспрессия перфорина (% позитивных клеток)
МНК	9,09±1,69	12,93±2,05
МНК+рчИЛ-18	10,81±1,49	12,89±1,82
МНК+ДК (без антигена)	14,68±2,80**	13,97±1,74
МНК+ДК (с антигеном)	14,26±2,31	16,82±2,57
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18	15,37±2,53**	18,98±2,99*(#)(##)
Примечание:	МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
	МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18
	МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся, антиген вируса гепатита В НВсAg
	МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg
	МНК+ДК (с антигеном) + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg с добавлением рчИЛ-18
** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
* - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+IL-18
# - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК
## - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК (без антигена)

Совместное культивирование ДК и МНК больных хроническим вирусным гепатитом В является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИФН- и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин в ответ на специфический антиген HBV. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитокинпродуцирующий и цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации антиген-специфических противовирусных цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-18 in vitro. Такой способ генерации противовирусных цитотоксических клеток значительно повышает их противовирусный потенциал и позволит в дальнейшем найти применение в лечении гепатита В. Способ экономичен, что также существенно в условиях лечебных учреждений.