способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур

Формула изобретения

1. Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции, предусматривающий культивирование штамма лактобактерий Lactobacillus fermentum, получение супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что осуществляют отбор колоний штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573) по признаку агглютинации с 0,1%-ного раствора конА на стекле в концентрации не ниже 1,75×10^-3, культивирование их на жидкой среде МРС-1 при постоянном перемешивании в атмосфере с содержанием 4-6% углекислого газа при температуре (37±0,05)°С в течение 15-17 ч и отделение клеток центрифугированием, затем полученный супернатант культуральной жидкости с молекулярной массой более 20 кДа концентрируют над мембраной, полученный концентрат культуральной жидкости инкубируют с конА-сефарозой, удаляют надосадок и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование проводят при скорости вращения ротора 3000 об./мин в течение 14-16 мин при температуре (20±0,05)°С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе при температуре (20±0,05)°С в течение 24-48 ч.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают колонии микроорганизмов, агглютинирующие с раствором конА в течение первых 4-6 с.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что супернатант культуральной жидкости при концентрировании трехкратно отмывают дистиллированной водой до рН 6,0±0,05 в атмосфере азота под давлением 20-25 атм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что надосадок концентрата культуральной жидкости удаляют по истечении 24-48 ч, а конА-сефарозу трехкратно отмывают фосфатным буфером рН 8,2, а затем к отмытой конА-сефарозе добавляют физиологический раствор с рН 3,0 и инкубируют 2-4 ч при температуре (20±0,05)°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для лечения дисбактериозов.

Известно, что положительный эффект от пробиотиков опосредован прямой или непрямой модуляцией эндогенной флоры и иммунной системы. В этом случае необходимым условием является непосредственный контакт пробиотической культуры с активными эпителиоцитами терминальной ниши макроорганизма.

Описано для использования в гинекологической практике средство для лечения дисбактериозов. Из штамма Lactobacillus fermentum 90-TS-4 - продуцента эубиотического препарата лактобактерина отобран вариант, агглютинирующийся в присутствии конканавалина-А (конА) и обладающий высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию (RU 2133272 C1, 20.07.1999). Однако эффективность такой композиции невысока вследствие недостаточной концентрации и чистоты лектинсвязывающих структур. Известны препараты для уменьшения и/или блокирования адгезии патогенных веществ и организмов на основе антиадгезивных углеводов со структурным звеном уроновой кислоты на одном из его концов (RU 2267324 С2, 10.01.2006), которые расширяют арсенал антипатогенных средств для эукариотических клеток, однако они сложны в приготовлении и не являются пробиотиками.

Наиболее близким к патентуемому способу является способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции, состоящий в культивировании штамма лактобактерий с получением супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта (Henriksson A., Szewzyk R. Characteristics of the adhesive determinants of Lactbacillus fermentum 104 // App. and Environmental Microbiol. - 1991 - p.499-502).

Задачей изобретения является получение антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур из культуральной жидкости штамма L. fermentum 90-TS-4 (21), с целью его использования в производстве многокомпонентных пробиотических препаратов.

Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции предусматривает культивирование штамма лактобактерий Lactobacillus fermentum, получение супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта.

Способ отличается тем, что осуществляют отбор колоний штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573) по признаку агглютинации с 0,1% раствора конА на стекле в концентрации не ниже 1,75×10 ^-3, культивирование их на жидкой среде МРС-1 при постоянном перемешивании в атмосфере с содержанием 4-6% углекислого газа при температуре 37(±0,05)°С в течение 15-17 ч и отделение клеток центрифугированием, затем полученный супернатант культуральной жидкости с молекулярной массой более 20 кДа концентрируют над мембраной, полученный концентрат культуральной жидкости инкубируют с конА-сефарозой, удаляют надосадок, и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе.

Способ может характеризоваться тем, что центрифугирование проводят при скорости вращения ротора 3000 об/мин в течение 14-16 мин при температуре 20(±0,05)°С.

Способ может характеризоваться и тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе при температуре 20(±0,05)°С в течение 24-48 ч, а также тем, что отбирают колонии микроорганизмов, агглютинирующие с раствором конА в течение первых 4-6 с.

Способ может характеризоваться также тем, что супернатант культуральной жидкости при концентрировании трехкратно отмывают дистиллированной водой до рН 6,0(±0,05) в атмосфере азота под давлением 20-25 атм.

Способ может характеризоваться, кроме того, тем, что надосадок концентрата культуральной жидкости удаляют по истечении 24-48 ч, а конА-сефарозу трехкратно отмывают фосфатным буфером рН 8,2, а затем к отмытой конА-сефарозе добавляют физиологический раствор с рН 3,0 и инкубируют 2-4 ч при температуре 20 (±0,05)°С.

Технический результат изобретения - повышение модулирующей активности субстанции в отношении высокоадгезивных штаммов дрожжеподобных грибов вида C.albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида E.coli и стабильности свойств субстанции.

В основе патентуемого способа получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур лежат следующие положения. В результате собственных экспериментов авторами показано, что наилучшую композицию пробиотического препарата может дать комбинация штаммов-продуцентов, в которой будут присутствовать как микроорганизмы, несущие на своей поверхности слущивающиеся с поверхности лактобактерии специфические адгезины, так и культуры, адгезивную активность которых определяют лектино-подобные структуры, плотно связанные с бактериальной стенкой. Выделение слущивающихся поверхностных адгезинов позволит микрокапсулировать эти структуры, и создать условия, в которых пробиотический препарат при отсутствии биотопозависимости будет способен экранировать сайты связывания на клетках-мишенях от представителей болезнетворной флоры (см., "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины" стр.192-195, № 2, том 145, 2008; "Вестник РУДН" стр.10-13, № 2, серия медицина, 2007).

Нами впервые показано, что для лактобактерии характерна вариабельность экспрессии лектинсвязывающего компонента на поверхность клетки: это свойство наибольшим образом выражено для L.fermentum штамм 90 TS-4 (производственный) и L.fructosum штамм 20349. Агглютинация конА лактобациллами обоих штаммов при 8-ом порядке разведения составляет не менее 3,5·10^-3 мг/мл. Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов существуют варианты с выраженной экспрессией таких структур и варианты их не экспрессирующие.

При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выявлено, что лектинсвязывающая субстанция диссоциирует на субединицы с молекулярной массой в пределах от 25 до 30 кДа. Известно, что за фиксацию на муцине клеток-мишеней ответственен белковый термостабильный компонент с молекулярной массой 29,0 кДа (см. упомянутый выше ближайший аналог). С помощью меченных коллоидальным золотом антител к этому компоненту удалось показать, что последний на поверхности лактобактерии присутствует в виде микрокапсулы, интегрирует в цитоплазматический слой и уходит в среду культивирования [Granato D., Bergonzelli G.E., Pridmore R.D., Marvin L., Rouvet M. Cell Surface-associated Elongation Factor Tu Mediates the Attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (Lal) to Human Intestinal Cells and Mucins. // J. Infec. and Immun. - 2004 - p.2160-2169].

Пример осуществления. После рассева штамма L. fermentum 90-TS-4 (21) (штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7573) проводился отбор колоний по признаку агглютинации с конА на стекле в концентрации не ниже 1,75·10^-3 мг/мл.

Получение лектинсвязывающей субстанции от данного продуцента осуществлялось в следующем процессе.

1. Отобранный вариант штамма L. fermentum 90-TS-4 (21) культивировали на жидкой среде МРС-1 в объеме 1000 мл в CO₂-условиях, в течение 15-17 часов при температуре 37(±0,05)°С и постоянном перемешивании.

2. Через 15-17 часов культуру клеток с помощью центрифугирования (14-16 мин, 3000 об/мин (g=9859,6 м/сек²)) отделяли от культуральной жидкости.

3.Супернатант культуральной жидкости переносили на ячейки фирмы AMICON (США) (2000 мл) и освобождали от низкомолекулярных компонентов и остаточного количества бактериальных клеток с помощью стерилизующих мембран марки «Милипор» с диаметром пор 0,02 мкм.

4. Очищенную культуральную жидкость концентрировали на ячейки фирмы AMICON (США) (2000 мл) с использованием мембран «Диафло» марки UM-20 до объема 100 мл. Одновременно супернатант культуральной жидкости трехкратно отмывали дистиллированной водой от молочной кислоты, доводя рН до значения 6,0±0,05.

5. Полученный концентрат культуральной жидкости штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) инкубировали 24 часа при комнатной температуре с конА-сефарозой. По истечении суток надосадок удаляли, а конА-сефарозу трехкратно отмывали фосфатным буфером (рН=8,2). Далее добавляли физиологический раствор (рН=3,0) и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. Собирали надосадок и доводили его до рН=7,2 с помощью 0,1М NaOH. Наличие лектинсвязывающей субстанции контролировали с помощью 0,1% раствора конА в реакции кольцепреципитации.

Целевой продукт - антиадгезивный компонент на основе лектинсвязывающих структур штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) более технологичен, чем полученный из штамма L.fermentum RC-14 в упомянутой работе Henriksson А. и Szewzyk R., и имеет следующие характеристики:

компонент, содержащий 150,0 мкг/мл белка, агрегативно не устойчив при значениях рН выше 6,0;

молекулярная масса, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, составляет от 25 до 30 кДа;

свойства лектинсвязывающей субстанции стабильны и не меняются при хранении и в процессе лиофилизации.

При изучении динамики накопления показано, что максимальная концентрация лектинсвязывающей субстанции в культуральной жидкости определяется на 15-17 час культивировании, в СО₂-условиях и постоянном перемешивании, что является более выгодными условиями, чем при выращивании культуры в течение 24-48 часов, как это описано в патенте RU 2133272.

Фореграмма очищенной лектинсвязывающей субстанции, выделенной из культуральной жидкости штамма L.fermentum 90 TS-4 представлена на фигуре.

Лектинсвязывающая субстанция оказывает модулирующее действие на адгезивную активность тест-культур дрожжеподобных грибов вида C.albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида Е.соli к эпителиоцитам влагалища клинически здоровых женщин. Данное утверждение иллюстрируют следующие результаты.

Модулирующее свойство фракции, лишенной способности реагировать с конА и фракции, способной реагировать с конА концентрата культуральной жидкости (КЖ) L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) в тесте торможения адгезии тест-культур на эпителиоцитах влагалища дало результаты (см. Таблицу), которые свидетельствуют о том что хроматографически очищенная фракция лектинсвязывающей субстанции активно ингибирует адгезию вагинального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans штамм 04.703 Б на эпителиоцитах влагалища и в меньшей степени влияет на адгезию орального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans. На адгезию E.coli штамм К 12 фракция не оказывает никакого эффекта, но значительно блокирует адгезию E.coli штамм 89-1449 на эпителиоцитах влагалища. В тоже время при удалении лектинсвязывающего компонента из КЖ L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) усиливается адгезивная активность части тест-культур E.coli к эпителиоцитам влагалища. Адгезия вагинального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans штамм 04.703, в этой модельной системе достоверно уменьшается.

ТАБЛИЦА Модулирующее действие фракций концентрата культуральной жидкости (КЖ) штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) на тест-культуры при адгезии на эпителиоцитах влагалища
Вид и штамм микроорганизмов	Концентрат (UM-20) КЖ L.fermentum 90-TS-4 (21) (Сбелка =150 мкг/мл)
Фракция, способная реагировать с конА	Фракция, лишенная способности реагировать с конА
М±m	M±m
контроль	опыт	контроль	опыт
C.albicans 04-703 Б (вагинальный изолят)	4,33±0,4	1,20±0,2 *)	1,26±0,2	0,64±0,12*)
C.albicans (оральный изолят)	13,04±1,8	8,62±1,12 *)	2,74±0,5	4,76±1,02
Е.соli К-12	12,35±0,84	12,12±1,34	12,35±0,84	20,94±1,51
Е.соli 89-1449 (кишечный изолят)	33,92±2,2	19,92±1,42 *)	13,76±1,6	23,64±2,9
*) - достоверное снижение адгезии тест-культур на эпителиоцитах влагалища