способ получения 9-( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина

Формула изобретения

Способ получения 9-( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="/images/patents/95/2368034/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)-2-фтораденина, включающий взаимодействие 2-фтораденозина и 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="/images/patents/95/2368034/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила при их мольном соотношении 1:2 соответственно в калий-фосфатном буфере при нейтральном значении рН, температуре 48-52°С в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы в количестве 62.5 ед. акт. на 1 ммоль 2-фтораденозина и уридинфосфорилазы в количестве 62.5 ед. акт. на 1 ммоль 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="/images/patents/95/2368034/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству противоопухолевых соединений, и может быть использовано при получении противоопухолевого препарата нуклеозидной природы - 9-( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина).

Флударабин является предшественником фармацевтического препарата 5'-фосфата флударабина, широко используемого в медицине противоопухолевого препарата, применяющегося в терапии В-клеточного хронического лимфолейкоза и неходжкинских лимфом низкой степени злокачественности (Fludarabine-induced apoptosis in CD19+/CD5+B-CLL cells is a direct and nurse-like-cell independent effect. Martinez-Lostao L., Briones J., Martinez-Gallo M. et al. Leukemia & lymphoma. 2004, V.45, no 11, p.2307-14).

По химической структуре флударабин представляет собой модифицированный нуклеозид - фторированный аналог 9- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозиладенина (фиг.1).

Наиболее эффективным в настоящее время признан биотехнологический способ получения модифицированных нуклеозидов с использованием генно-инженерных ферментов нуклеозидфосфорилаз (НФ) - реакция ферментативного трансгликозилирования, - в процессе которой происходит перенос сахарного остатка от природного пуринового или пиримидинового нуклеозида на модифицированное гетероциклическое основание (Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Pharmacology & Therapeutics. - 2000. - V.88. P. - 349-425). Принципиальная схема процесса представлена на фиг.2.

Известен способ ферментативного синтеза флударабина по реакции трансгликозилирования исходного гетероциклического основания 2-фтораденина 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацилом при температуре 60°С в присутствии суспензии клеток Enterobacter aerogenes при 60°С (патент ЕР № 1464708, МПК⁷ кл. С12Р 19/32, опублик. 03.04.2003). К недостаткам этого метода, можно отнести следующие:

1) процесс проводят в буферных растворах с добавлением в реакционную смесь диметилсульфоксида (до 40% об), что сказывается на частичной потере активности ферментных препаратов и затрудняет выделение продукта из реакционной смеси,

2) флударабин продуцируется в культуральной среде, содержащей пролиферирующие микроорганизмы в процессе роста микроорганизмов,

3) ферменты клетки продуцируют не только флударабин, но и весь спектр природных нуклеозидов, их метаболитов, что усложняет процесс выделения целевого продукта.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения флударабина по реакции трансгликозилирования исходного основания 2-фтораденина 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацилом с использованием ферментов пуриннуклеозидфосфорилазы (КФ 2.4.2.1.) и уридинфосфорилазы (КФ 2.4.2.3.) из суспензии клеток Enterobacter aerogenes, предварительно выделенных и иммобилизованных на полимерных носителях (патент ЕР № 1439220, МПК⁷ кл. C12N 19/10, опублик. 16.01.2003). К недостаткам данного метода можно отнести следующее:

1) исходный 2-фтораденин плохо растворим в воде, вследствие чего процесс проводят в буферных растворах с добавлением в реакционную смесь диметилсульфоксида (до 40% об.) или этилового спирта (10% объемн.), что сказывается на частичной потере активности ферментных препаратов,

2) по окончании процесса продукт кристаллизуется совместно с исходным основанием в силу его низкой растворимости, что приводит к необходимости дополнительной перекристаллизации флударабина.

Изобретение решает задачу упрощения технологии получения флударабина и повышения его выхода.

Поставленная задача решается за счет того, что флударабин получают путем взаимодействия 2-фтораденозина и 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила при их мольном соотношении - 1:2 соответственно, в калий-фосфатном буфере при нейтральном значении рН, температуре 48-52°С в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы в количестве 62.5 ед. акт. на 1 ммоль 2-фтораденозина и уридинфосфорилазы в количестве 62.5 ед. акт. на 1 ммоль 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила.

Использование 2-фтораденозина позволяет проводить процесс получения флударабина при высоких концентрациях исходных нуклеозидов без добавления в реакционную смесь диметилсульфоксида, что упрощает процесс выделения целевого продукта из реакционной смеси и приводит к значительному увеличению его выхода.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Исходный 2-фтораденозин получают обработкой аммиаком в метаноле 2',3',5'-три-О-ацетил-2-фтораденозина (патент РФ № 2325395, 05.02.2007). Схема синтеза представлена на фиг.3.

Параллельно осуществляют синтез второго исходного нуклеозида 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила (соединение VI, фиг.4), способ получения которого основан на реакции кислотно-катализируемого ацетилирования уридина с образованием 2,2'-ангидро-1-(3',5'-ди-О-ацетил- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)урацила (Kondo К. and Inoue I.J.Org. Chem. 1977. V.42. N.17. P.2809-2812), омыление которого водной щелочью при комнатной температуре и приводит к образованию 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила.

В качестве генно-инженерных ферментов используют пуриннуклеозидфосфорилазу (ПНФ, КФ 2.4.2.1) и уридинфосфорилазу (УФ, КФ 2.4.2.3).

Синтез флударабина (I, фиг.5) из 2-фтораденозина проводят по реакции трансгликозилирования при мольном соотношении 2-фтораденозина к 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацилу - 1:2 при 48-52°С до содержания исходного 2-фтораденозина 0,5-1%. При данной температуре флударабин постепенно кристаллизуется, смещая равновесие ферментативной реакции в сторону образования продукта. Контроль процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. По окончании реакции смесь выдерживают при 8-15°С в течение 20-24 ч, выпавший в осадок флударабин отфильтровывают. Проведение процесса получения флударабина описанным способом позволяет получить продукт с выходом 92% и чистотой не менее 99%. Данные, подтверждающие достижение технического результата, представлены в таблице.

Таблица.
-d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">	Предлагаемый способ	ЕР 1439220
Температура (°С)	50±2	60
Соотношение компонентов	1:2	1:1.5
Время реакции, ч	110-120	4
Наличие ДМСО в реакционной смеси, %	-	40
Источник фермента	Очищенные генно-инженерные ферменты из Е.coli	Иммобилизованные ферменты из Enterobacter aerogenes
Необходимость в дополнительной кристаллизации продукта	-	+
Выход флударабина, %	92	70

Изобретение иллюстрируют чертежи:

Фиг.1. - структурная формула флударабина (9-( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)-2-фтораденина).

Фиг.2 - принципиальная схема реакции трансгликозилирования.

Фиг.3 - схема синтеза 2-фтораденозина.

Фиг.4 - схема синтеза 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила.

Фиг.5. - схема ферментативного синтеза 9-( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина).

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Получение 2-фтораденозина (соединение III, фиг.3).

Суспензию 33.35 г (117 ммоль) 2',3',5'-три-О-ацетил-2-фтораденозина в 1.25 л метанола перемешивают и насыщают осушенным аммиаком при 0-2°С в течение 6 ч, образовавшийся раствор выдерживают в закрытой колбе при указанной температуре 5 суток, а затем 4 ч при 20°С. Выпавший осадок отфильтровывают и получают 11.96 г 2-фтораденозина т. пл. 249-251°С. Масс-спектр: m/z 308(M+Na) ⁺, 286(М+Н)⁺, 154(В+Н)⁺, м.в. 285.237. Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆), ( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> м.д.): 8.38 (с, 1Н, 8-Н), 7.9 (с, 2Н, NH₂), 5.81(д, 1Н, J₁=5.1 Hz, 1'-H), 4.54 (м, 1Н, 2'-Н), 4.15 (м, 1Н, 3'-Н), 3.96 (м, 1Н, 4'-Н), 3.50-3.75 (м, 2Н, 5'-Н₂).

Маточный раствор концентрируют в вакууме (15 мм рт.ст.), остаток кипятят 15 мин в 300 мл метанола, содержащего 5% аммиака, реакционную смесь охлаждают до 20°С и выдерживают при этой температуре 2 ч, выпавший осадок отфильтровывают и получают дополнительно 9.21 г 2-фтораденозина (соединение III, фиг.3), 98%-ной чистоты, т. пл. 244-246°С. Общий выход 2-фтораденозина составляет 21.17 г (91.56%).

Пример 2.

Получение 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила (соединение VI, фиг.4). Раствор уксусного ангидрида (210 г, 200 мл) добавляют по каплям к перемешиваемой кипящей суспензии уридина (соединение IV, рисунок 4) (100 г, 0.4 моль) с эфиратом трехфтористого бора (160 мл, 1.28 моль) в 1 л смеси толуол-ацетонитрил, 1:1. Через 2 часа реакционную смесь охлаждают льдом и нейтрализуют карбонатом натрия

(Na₂СО₃) до рН 8-8.5. Осадок удаляют, промывают ацетонитрилом. Супернатант концентрируют в вакууме. Остаток уксусной кислоты удаляют соупариванием с толуолом. Остаток растворяют в этаноле, продукт высаживают из раствора добавлением толуола. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают этанолом (2×100 мл), сушат в вакууме (15 мм рт.ст.). Выход 2-2'-ангидро-1-(3',5'-ди-О-ацетил- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)урацила (соединение V, фиг.4) 72.8 г. (58.5%); т. пл. 185°С; -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> _max, нм: 246.2; m/z: 311.3 [М]⁺, 333.4 [M+Na]⁺.

2-2'-Ангидро-1-(3',5'-ди-О-ацетил- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозил)урацил (соединение V, фиг.4) (72.8 г) растворяют в 1 л Н₂О, добавляют 140 мл 5М КОН до рН 12. Через 5 ч реакционную смесь нейтрализуют катионитом Dowex 50 (Н⁺) до рН 7. Смолу отфильтровывают, промывают водой (3×100 мл). Растворитель удаляют в вакууме (15 мм рт.ст.). Целевой продукт кристаллизуют из 600 мл этанола, промывают охлажденным этанолом (2×100 мл). Выход 30.4 г (30%); т. пл. 238°С; -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> _max, нм: 262.6; m/z: 245.3 [М+Н]⁺ , 267.2 [M+Na]⁺. ¹Н-ЯМР (D₂О) ( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , ppm): 7.83 (1Н, д, J_6,5 8.09, Н₆ ), 6.15 (1Н, д, J_1',2' 4.98, Н_1' ), 5.85 (1Н, д, J_5,6 8.09, Н₅), 4.43 (1Н, т, J_{2', 1'}. 4.8, Н₂),4.11 (1Н, т, J_{3', 2'} 5.14, Н_3'), 3.97 (1Н, м, Н_4'), 3.9 (1Н, дд, J_{5'a, 5'b} 12.45, J_{5'а, 4'} 3.11, Н_5'а ), 3.81 (1Н, дд, J_{5'b, 5'a} 12.45, J_{5'b, 4'} 5.61, H_5'b).

Пример 3.

Получение флударабина (соединение I, фиг.5).

Смесь 17.116 г (0.06 моль) 2-фтораденозина (соединение III, фиг.5) и 29.3 г (0.12 моль) 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила (соединение VI, фиг.5) в 2 л 60 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 120 часов при 50±2°С в присутствии 15 мл ферментного препарата ПНФ (10 мг/мл, 25 ед. акт./мг белка или 62.5 ед. акт. на 1 ммоль 2-фтораденозина) и 15 мл ферментного препарата УФ (10 мг/мл, 50 ед. акт./мг белка или 62.5 ед. акт. на 1 ммоль 1- -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного 2-фтораденозина (соединение III, фиг.5) в реакционной смеси составляет 1%.

Реакционную смесь охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×20 мл) и этиловым спиртом (1×20 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 15.75 г (92%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.4%. Т. пл. 260-262°С. -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> _max, нм ( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , М^-1 см^-1): 262(14800). Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆), ( -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> м. д.): 8.17 (с, 1Н, Н-8), 7.76 (с, 2Н, NH₂ ), 6.11 (д, 1Н, Н_1'), 5.61(д, ОН_{2 -d-арабинофуранозил)-2-фтораденина, патент № 2368662" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">} ), 5.51 (д, ОН_5'), 5.05 (т, ОН _3'), 4.14 (м, 1Н, Н_2'), 3.77 (м, 1Н, Н_3'), 3.65 (м, 1Н, Н_4'), 3.35 (с, 2Н, Н_5')