прямой ингибитор тромбина, обладающий антипролиферативным действием

Формула изобретения

Прямой ингибитор тромбина, выделенный путем трехстадийной жидкостной хроматографии из яда египетской кобры Naja haje, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой (14350±14) Да, определенной с помощью MALDI масс-спектрометрии, имеющий семь внутримолекулярных дисульфидных связей, N-концевую аминокислотную последовательность NVYQXRKMLQCAMPNGGPF, где X - Y или W, и обладающий антипролиферативным действием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, в частности к прямому ингибитору тромбина, и может быть использовано как в лабораторной диагностике, так и для получения лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с гиперактивацией тромбина и/или гиперпролиферацией.

Тромбин (ЕС 3.4.21.5), сериновая протеаза - ключевой фермент свертывающей системы крови, который превращает фибриноген в фибрин - основу тромба, участвует в регуляции многих физиологических и патофизиологических процессов, таких как свертывание крови и противосвертывающие механизмы, тромбообразование и фибринолиз, регуляция сосудистого тонуса, и в регуляции процессов развития организма, а также в процессах воспаления, репарации тканей, атерогенеза, канцерогенеза и развития болезни Альцгеймера.

Несвоевременная активация свертывающей системы крови в артериальном русле может приводить к внезапной остановке сердца, острым коронарным синдромам (инфаркту миокарда и др.), тромбоэмболии периферических сосудов и инсульту; в венозном русле это может привести к тромбозу глубоких вен и к тромбоэмболии легочной артерии. Гиперпродукция активного тромбина является также ведущим патогенетическим звеном синдрома внутрисосудистого свертывания крови. Поскольку как внешний, так и внутренний пути свертывания крови имеют общую завершающую стадию - активацию тромбина, обусловливающую как формирование фибринового сгустка, так и тромбоцитарного тромба, ингибирование тромбина представляется весьма логичным в терапии или профилактике подобных состояний.

Препараты антитромбинового действия классифицируются как прямые ингибиторы тромбина (ПИТ) (действующие непосредственно на молекулу тромбина - гирудин и его рекомбинантные производные, а также аргатробан, мелагатран), непрямые ингибиторы тромбина (гепарины, фондапаринукс), ингибиторы генерации тромбина (ингибитор фактора Ха), сборная группа рекомбинантных аналогов эндогенных антикоагулянтов (антитромбин, активированный протеин С, кофактор II гепарина). Существующие данные доказывают, что ПИТ имеют по целому ряду причин, преимущество перед другими ингибиторами тромбина при лечении указанных состояний, а также при кардиохирургических вмешательствах.

Однако применение разработанных эффективных ПИТ часто ограничивается их отдельными недостатками. Так, гирудин и его рекомбинантые аналоги имеют короткое время полужизни, а также такие побочные эффекты, как склонность к кровотечению и анафилактические реакции; большинство недостатков гирудина отсутствует у Гирулога-1, синтетического аналога гирудина, однако он сам легко гидролизуются тромбином. Мелагатран (в форме пролекарства ксимелагатран), низкомолекулярный ПИТ, является высокоактивным ингибитором тромбина и практически лишен большинства недостатков других ПИТ, однако оказалось, что он оказывает гепатотоксическое действие [Schwienhorst A. Direct thrombin inhibitors - a survey of recent developments // Cell Mol. Life Sci. - 2006. - V.63. - P.2773-2791].

Несмотря на огромный выбор низкомолекулярных эффекторов системы свертывания крови, в целях тонкой биохимической характеристики состояния гемостаза широко используют препараты и диагностикумы на основе белков из ядов змей. В частности, в обычной лабораторной практике для определения наличия патологических ингибиторов полимеризации фибрина применяют тромбиноподобный фермент (ТПФ) Рептилаза из яда гремучей змеи Bothrops atrox. Для диагностики волчаночных коагулянтов используются фракции ядов гадюки Рассела Daboja russelli и тайпана Oxyuranus scutellatus, содержащие ферменты, активирующие фактор Х и протромбин соответственно. Для определения активности Протеина С применяют фермент «Протак» из яда щитомордника Agkistrodon contortrix [Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. - М.: Спорт и культура, 1999. - 464 с.]. Анцистроны, ТПФ из яда щитомордника Agkistrodon halys halys, в частности Ancystron-H используют для определения уровня фибриногена в плазме пациентов, получавших гепаринотерапию [Горницкая О.В., Платонова Т.Н., Волков Г.Л. Ферменты змеиных ядов. // Укр. Бioxiм. Журн. - 2003. № 75. Вып.3. - С.22-32]. Кроме того, для более тонкого исследования гемостаза находит применение ряд других компонентов яда змей, прежде всего ферментов и дезинтегринов [Marsh N., Williams V. Practical applications of snake venom toxins in haemostasis // Toxicon. - 2005. - V.45. - P.1171-1181]. Причина такого широкого использования в коагулологии белков змеиных ядов заключается в их высокой селективности по отношению к своим мишеням в свертывающей системе крови, при этом они в отличие от естественных белковых эффекторов зачастую не инактивируются естественными плазменными ингибиторами, что является их дополнительным преимуществом как биохимических инструментов.

Известен тромбиноподобный фермент Анкрод из яда щитомордника Calloselasma rodostoma, являющийся высокоспецифичным белком змеиного яда, который может применяться не только как биохимический инструмент, но и как лекарственный препарат [Samsa G.P., Matchar D.B., Williams G.R., Levy D.E. Costeffectiveness of ancrod treatment of acute ischaemic stroke: results from the Stroke Treatment with Ancrod Trial (STAT) // J. Eval. Clin. Pract. - 2002. - V.8. - P.61-70].

Известны коагулопатические фосфолипазы А2, содержащиеся в ядах змей [Kini R.M. Structure-function relationships and mechanism of anticoagulant phospholipase А2 enzymes from snake venoms // Toxicon. - 2005. - V.45. - P.1147-1161]. Некоторые фосфолипазы А2 способны останавливать пролиферацию опухолевых клеток [Макарова Я.В., Осипов А.В., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. Влияние фосфолипаз А2 из ядов змей на рост нейритов и выживаемость клеточной линии PC 12 феохромоцитомы крысы. // Биохимия. - 2006. № 71. - С.838-846], однако ни одна из известных фосфолипаз не является ингибитором тромбина.

Известен наиболее близкий к заявленному ингибитор тромбина ботроярацин (Bothrojaracin). Это - препарат полипептидной природы, выделенный из яда гремучей змеи, функционально является ПИТ смешанного типа (константа ингибирования 15 нМ). По структурным характеристикам (молекулярная масса, субъединичный состав, N-концевая аминокислотная последовательность) он принадлежит к лектиноподобным белкам С-типа [Zingali R.B., Jandrot-Perrus M., Guillin M.-C., Bon С.Bothrojaracin, a new thrombin inhibitor isolated from Bothrops jararaca venom: characterization and mechanism of thrombin inhibition. // Biochemistry. - 1993. - V.32. - P.10794-10802]; дифференцирующих свойств у него нет.

Упомянутые прямые ингибиторы тромбина полностью не удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к таким веществам, поэтому существует необходимость в разработке и получении других ингибиторов тромбина (в т.ч. ПИТ), имеющих иной механизм действия и/или более высокую селективность. Взаимосвязь онкогенеза и гиперкоагуляции крови диктует необходимость поиска веществ, действующих одновременно на оба этих процесса.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента прямых ингибиторов тромбина.

Поставленная задача решается за счет нового соединения, выделенного путем трехстадийной жидкостной хроматографии из яда египетской кобры Naja haje, состоящего из одной полипептидной цепи, с молекулярной массой 14350±14 Да, имеющего семь внутримолекулярных дисульфидных связей, N-концевую аминокислотную последовательность NVYQXRKMLQCAMPNGGPF, где Х-Y или W, и обладающего антипролиферативным действием.

Впервые выделенное новое вещество специфически ингибирует тромбин и при этом вызывает дифференцировку опухолевых клеток.

Техническим результатом является получение прямого ингибитора тромбина, обладающего антипролиферативным действием.

Установлено, что прямой ингибитор тромбина, выделенный из яда кобры Naja haje, имеющий N-концевую аминокислотную последовательность NVYQYRKMLQCAMPNGGPF, где Х-Y или W, помимо прямого ингибирующего действия в отношении тромбина обладает еще и специфическим, т.е. не связанным с фактом ингибирования тромбина антипролиферативным действием. Это вещество расширяет ряд как биохимических реагентов-антикоагулянтов, так и возможных лекарственных средств.

Полученный прямой ингибитор тромбина может быть использован как биохимический агент при исследовании тромбоза, агрегации тромбоцитов, коагуляции, пролиферации опухолевых клеток, особенно для избирательного изучения функций тромбина в составе системы гемостаза, либо для избирательного подавления активности тромбина при исследовании других компонентов системы свертывания крови. Заболеваниями, которые можно лечить или изучать с помощью прямого ингибитора тромбина по настоящему изобретению, являются: тромбоз, атеросклероз, рестеноз, гипертензия, стенокардия, аритмия, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, гломерулонефрит, тромбоэмболия, заболевания периферических сосудов, другие сердечно-сосудистые заболевания, нарушения мозгового кровообращения, воспалительные нарушения, злокачественные новообразования и другие опухолевые заболевания, а также прочие состояния, в которых активация тромбина (и его рецептора) играют патологическую роль.

Прямой ингибитор тромбина по изобретению состоит из одной полипептидной цепи, имеющей молекулярную массу 14350±14 Да согласно данным MALDI масс-спектрометрии, и семь внутримолекулярных дисульфидных связей. Такой набор структурных свойств (полипептидная природа, молекулярная масса, укладывающаяся в диапазон 13-15 кДа, N-концевая аминокислотная последовательность единой полипептидной цепи, гомологичная приведенной, 7 внутримолекулярных дисульфидных связей) характерен только для фосфолипаз А2 группы I (ЕС 3.1.1.4).

Прямой ингибитор тромбина по изобретению получают путем трехстадийной жидкостной хроматографии яда египетской кобры Naja haje (фиг.1). Первая стадия - гель-фильтрация с использованием носителя с таким размером пор, который позволяет отделить фракцию яда с соединениями 13-15 кДа как от основной токсической фракции яда (6-8 кДа), так и от высокомолекулярных белков. Таким носителем может служить смола Sephadex G-50 superfine («Amersham Biosciences») (пример 1). Вторая стадия - катионообменная хроматография в плавном градиенте концентрации соли с использованием носителя с карбоксиметильными активными группами, посредством чего прямой ингибитор тромбина по изобретению отделяется как от кислых, так и от более основных компонентов фракции, например на колонке для ВЭЖХ Hema Bio CM («Tessek») (пример 2). Третья стадия - обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке с экспонированными гидрофобными группами, например с носителем С 18, для окончательной очистки от компонентов с близкими значениями изоэлектрической точки и молекулярной массой, но имеющих другую степень гидрофобноcти (пример 3).

Пример 1. Проведение гель-фильтрации

800 мг высушенного яда кобры Naja haje растворяют в 1,5 мл деионизированной воды и наносят на колонку для гель-фильтрации (4,5×150 см, носитель Sepadex G-50 superfine, "Amersham Biosciences", Швеция), в 0,1М аммонийно-ацетатном буфере, рН 6,2, при скорости потока 60 мл/ч. Элюат собирают в пробирки фракциями по 15 мл, оптическую плотность фракций детектируют при длине волны 230 нм.

Собранный элюат объединяют, как показано на фиг.1,А, концентрируют и обессоливают методом ультрафильтрации на фильтрах системы VivaScience (полисульфоновые фильтры Vivaspin20, Sartorius AG, Германия) и лиофилизируют.

Пример 2. Проведение ионо-обменной хроматографии

Полученную после гель-фильтрации фракцию V наносят на ионо-обменную колонку (8×250 мм, карбоксиметилцеллюлоза, НЕМА-ВIO, 1000 CM 10µm, Tessek, Чешская Республика). Разделение осуществляют в буфере 5 мМ Tris-HCl, pH 7,5 в градиенте NaCl от 0 до 1М за 100 мин, при скорости потока 1,4 мл/мин. Фракции собирают с помощью коллектора фракций или вручную согласно показаниям детектора при длине волны 280 нм. Полученные фракции концентрируют и обессоливают на фильтрах системы VivaScience (полисульфоновые фильтры VivaSpin2 и VivaSpin6).

Пример 3. Проведение обращенно-фазовой хроматографии

Полученную после ионо-обменной хроматографии фракцию 5 (фиг.1,Б) разделяют на обращенно-фазовой колонке (4,6×250 мм, Jupiter 5u, С-18, 300m, Phenomenex, США) в градиенте ацетонитрила в воде от 15 до 45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 1 мл/мин. Фракции собирают с помощью коллектора фракций или вручную согласно показаниям детектора при длине волны 280 нм. Из полученных фракций растворители удаляют лиофилизацией. Пик целевого вещества указан чертой на фиг.1,В.

Присутствие прямого ингибитора тромбина (ПИТ) по изобретению в одной из фракций яда на каждой стадии очистки устанавливается функционально после обессоливания (ультрафильтрацией) с помощью теста тромбинового времени (наблюдается выраженная пролонгация); другие компоненты, присутствующие во фракциях во время очистки, не мешают определению. Стандартная процедура тестирования описывается в примере 6.

ПИТ, выделенный таким образом, гомогенен и имеет массу около 14350±14 Да, что подтверждается методом MALDI масс-спектрометрии с допустимым разбросом 0.1% для данного диапазона молекулярных масс. Он имеет N-концевую аминокислотную последовательность NVYQXRKMLQCAMPNGGPF, где Х-Y или W, устанавливаемую посредством N-концевой деградации по методу Эдмана на автоматическом белковом секвенаторе или вручную. Полипетидная природа остальной части ПИТ подтверждается с помощью протеолитического расщепления (пример 4). Наличие в полипептидной цепи 14 остатков цистеина, образующих 7 внутримолекулярных дисульфидных связей, подтверждают путем тотального восстановления тиолсодержащим реагентом с последующим алкилированием (пример 5). Основный характер полипептидного соединения подтверждается фактом его удерживания при хроматографии на катионообменной колонке в условиях, описанных в примере 2 (фиг.1,Б).

Пример 4. Проведение протеолитического расщепления трипсином

5 мкг полипептидного соединения с полностью восстановленными и алкилированными, как описано в примере 5, остатками цистеина растворяют в 20 мкл 50 мМ фосфатного буфера, рН 8.0, добавляют раствор трипсина до соотношения фермент/субстрат 1:50 по массе, инкубируют 3 часа при температуре 37°С. После обессоливания смесь наносят на мишень для снятия MALDI масс-спектра. На спектре наблюдают исчезновение пика с исходной молекулярной массой и появление нескольких пиков с массами, не превышающими 3 кДа, что говорит о протеолитическом расщеплении остальной части молекулы.

Пример 5. Тотальное восстановление и алкилирование остатков цистеина

200 мкг полученного вещества растворяют в 200 мкл 50 мМ фосфатном буфера, рН 8.6, содержащем 6 М гуанидина гидрохлорида, добавляют 40 мкл 6% раствора восстанавливающего тиолсодержащего реагента (дитиоэритритола или дитиотреитола, или меркаптоэтанола и т.п.) и инкубируют 12 часов при комнатной температуре. Затем добавляют 12 мкл 4-винилпиридина и инкубируют 3 часа при комнатной температуре. Очистку алкилированного производного, являющегося основным продуктом реакции, осуществляют посредством обращенно-фазовой хроматографии согласно примеру 3. Молекулярная масса производного составляет 15820±16 Да согласно данным MALDI масс-спектрометрии, что говорит о единстве полипептидной цепи в молекуле и о включении в нее 14 остатков пиридилэтила по 14 восстановленным остаткам цистеина. Проводят аналогичный опыт, но без добавления восстанавливающего реагента. Отсутствие изменения в молекулярной массе соединения свидетельствует об отсутствии в исходном веществе свободных сульфгидрильных групп, т.е. все 14 остатков цистеина образуют в нем 7 внутримолекулярных дисульфидных связей.

Для селективного подавления активности тромбина в опытах in vitro можно добавлять в плазму крови ПИТ по изобретению до конечной концентрации 30-150 нм, при этом оно не оказывает влияния на другие сериновые протеиназы плазмы крови.

Основным функциональным признаком ПИТ по изобретению является его способность достоверно в концентрации свыше 7,5 нМ прямо ингибировать фибриногенолитическую активность тромбина в плазме крови, что проверяется в тесте тромбинового времени (пример 6), при этом в концентрациях до 47.5 нМ оно не оказывает существенного влияния на показания тестов протромбинового времени и АЧТВ (разница не превышает 5% по сравнению с контрольными опытами) (примеры 7 и 8), что демонстрирует его селективность в отношении тромбина. При измерении влияния ПИТ по изобретению на амидолитическую активность тромбина на хромогенном субстрате (пример 9) подтверждается прямой характер ингибирования и устанавливается преимущественно неконкурентный тип ингибирования, что отличает его от большинства других ПИТ, известных из уровня техники. Структурно ПИТ по изобретению является белком - представителем фосфолипаз А2, обладает антипролиферативным действием в отношении опухолевых клеток (в частности, клеток феохромоцитомы крысы) и антикоагулянтными свойствами.

ПИТ по изобретению в концентрации 15 нМ пролонгирует тромбиновое время плазмы крови человека в 4 раза, в концентрации 30 нМ - в 8 раз, при этом увеличение протромбинового времени и АЧТВ не превышает 5% по сравнению с показаниями контрольного опыта в отсутствие указанного вещества (Фиг.2). ПИТ по изобретению ингибирует амидолитическую активность тромбина в отношении синтетического хромогенного субстрата N-(p-tosyl)-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide ("Sigma-Aldrich") с константой ингибирования около 70 нМ. Факт ингибирования тромбина в системе, составленной без других компонентов плазмы крови, и отсутствие усиления ингибирования при добавлении малых количеств плазмы (0,8% или 3,3%) говорит о прямом характере ингибирования. Графики ингибирования в координатах Лайнуивера-Бёрка в отсутствие и в присутствии двух концентраций вещества сходятся в одной точке во II четверти координат, что говорит о смешанном типе ингибирования (Фиг.3). В концентрациях свыше 150 нМ (2 мкг/л) степень ингибирования тромбина возрастает менее резко (табл.). В концентрации 1,5 мкМ и выше указанный ПИТ достоверно останавливает пролиферацию и вызывает рост нейритоподобных отростков у опухолевых клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 (пример 10), и при этом в концентрациях до 15 мкМ не вызывает их гибели согласно данным стандартного МТТ-теста (табл.), т.е. не оказывает на них цитотоксического воздействия, что является очень важным фактором при условии его применения in vivo. Цитотоксические свойства ПИТ устанавливают на клетках PC 12 при помощи МТТ-теста по методике, описанной в статье [Макарова Я.В., Осипов А.В., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. Влияние фосфолипаз А2 из ядов змей на рост нейритов и выживаемость клеточной линии PC 12 феохромоцитомы крысы. // Биохимия. - 2006. № 71. - С.838-846]: по истечении 24-часовой инкубации с тестируемым соединением количество выживших клеток определяют с помощью окрашивания 0,05% раствором 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида (МТТ) в течение 1,5 часа. Образующиеся кристаллы формазана растворяют в диметилсульфоксиде, измеряют оптическую плотность на планшетном спектрофотометре (Multiscan) при длине волны 540 нм и сравнивают показания с показаниями контрольного опыта в отсутствие тестируемого соединения. В концентрации до 15 мкМ ПИТ по изобретению не оказывает влияния на активацию системы комплемента сыворотки по классическому или в концентрации 1,5 мкМ по альтернативному пути, что можно определить в стандартных гемолитических тестах, основанных на лизисе эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика, сывороткой морской свинки, или эритроцитов кролика - сывороткой человека соответственно, как описано, например, в [Shoibonov B.B., Osipov A.V., Kryukova E.V., Zinchenko A.A., Lakhtin V.M., Tsetlin V.I., Utkin Yu.N. Oxiagin from the Naja oxiana cobra venom is the first reprolysin inhibiting the classical pathway of complement. // Mol. Immunol. - 2005. - V.42. - P.1141-1153], что также свидетельствует о том, что ПИТ по изобретению не влияет на остальные сериновые протеиназы плазмы крови. При помощи вышеуказанных методов, а также методик, описанных в примерах 6-10, устанавливают селективность ПИТ, отсутствие цитотоксических и наличие антипролиферативного действия.

Соединение - прямой ингибитор тромбина по настоящему изобретению - обладает антикоагулянтной активностью, а также антипролиферативным действием. Оно может быть использовано как биохимический агент при исследовании тромбоза, агрегации тромбоцитов, коагуляции, пролиферации опухолевых клеток. Так, селективный, преимущественно неконкурентный характер прямого ингибирования позволит более избирательно изучать состояние общей стадии каскада свертывания крови, осуществляемой активным тромбином, и оценивать состояние остальных компонентов каскада, например вклад того или иного активатора или ингибитора ранних стадий при селективном ингибировании тромбина соединением по изобретению. При этом изменения активации других стадий каскада соединением по изобретению по сравнению со степенью пролонгации тромбинового времени (и их возможный вклад в нее) будут минимальными (менее 5% при концентрациях, указанных в примерах 6-9).

Пример 6. Влияние на показания теста тромбинового времени

100 мкл нормальной цитратной плазмы инкубируют 5 мин при 37°С с 5 мкл 0,0005% водного раствора ПИТ по изобретению. Затем при комнатной температуре добавляют 20 мкл (1U/мл) раствора тромбина человека и отмечают время образования фибринового сгустка на коагулометре или визуально. В контрольном опыте вместо раствора соединения по изобретению вводят 5 мкл воды. Увеличение времени образования сгустка составляет 800% по сравнению с контрольным опытом. 100 мкл 0,3% раствора фибриногена инкубируют 5 мин при 37°С с 5 мкл 0,0005% водного раствора ПИТ по изобретению. Затем при комнатной температуре добавляют 20 мкл (1U/мл) раствора тромбина человека и отмечают время образования фибринового сгустка на коагулометре или визуально. В контрольном опыте вместо раствора соединения по изобретению вводят 5 мкл воды. Увеличение времени образования сгустка составляет 800% по сравнению с контрольным опытом.

Пример 7. Влияние на показания теста АЧТВ

100 мкл нормальной нитратной плазмы инкубируют 15 мин при 37°С с 20 мкл 0,0005% водного раствора ПИТ по изобретению, затем добавляют 100 мкл реагента АЧТВ на основе эллаговой кислоты и отмечают время образования сгустка. В контрольном опыте вместо раствора соединения по изобретению вводят 20 мкл воды. Увеличение времени образования сгустка составляет 0-5% по сравнению с контрольным опытом.

Пример 8. Влияние на показания теста протромбинового времени

100 мкл нормальной цитратной плазмы инкубируют 5 мин при 37°С с 20 мкл 0,0005% водного раствора ПИТ по изобретению, затем добавляют 100 мкл реагента на основе тромбопластина, и инкубацию продолжают еще 3 мин при 37°С. Реакцию коагуляции инициируют добавлением 100 мкл 20 мМ раствора кальция хлорида и отмечают время образования сгустка. В контрольном опыте вместо раствора ПИТ по изобретению вводят 20 мкл воды. Увеличение времени образования сгустка составляет 0-5% по сравнению с контрольным опытом.

Результаты, полученные в примерах 7 и 8, свидетельствуют о селективности ПИТ по изобретению в отношении тромбина, поскольку он не влияет на активацию внешнего и внутреннего пути свертывания крови и, следовательно, на другие сериновые протеиназы системы свертывания.

Пример 9. Ингибирование амидолитической активности тромбина

К 100 мкл водного раствора хромогенного синтетического субстрата N-Tos-Gly-Pro-Arg-pNA («Сигма-Олдрич») в нескольких разведениях (от 30 мкМ до 3 мМ) в 10 мМ имидазольном буфере, рН 7.4, добавляют 20 мкл 0,15 мкМ и (в параллельном опыте) 0,3 мкМ раствора ПИТ по изобретению, реакцию индуцируют добавлением 20 мкл 0,5 U/мл тромбина. Оптическую плотность реакционной смеси детектируют при длине волны 405 нм каждые 30 сек, пока она не достигнет плато. В контрольном опыте вместо ПИТ по изобретению вводят 20 мкл воды. Строят три графика (соответствующие двум концентрациям ингибитора и контролю) зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в обратных координатах Лайнуивера-Бёрка. Константу и тип ингибирования определяют исходя из величин углов наклона и расположения точки пересечения графиков соответственно.

Поскольку прогресс опухоли и активация системы свертывания взаимосвязаны, ПИТ по настоящему изобретению может быть использован для проведения экспериментов с целью изучения эффекта одновременного подавления обоих процессов - пролиферации опухолевых клеток и гиперкоагуляции.

Пример 10. Влияние ПИТ по изобретению на дифференцировку опухолевых клеток

Клетки феохромоцитомы крысы PC 12 культивируют при 37°С и 5% СО₂ в среде RPMI 1640 (Sigma), содержащей 15% эмбриональной сыворотки теленка (Hyclone) и 2 мМ глутамина. Для исследования действия фосфолипаз клетки рассевают в 96-луночный планшет (Corning & Costar) с плотностью 5-10·10⁴ клеток на лунку (60-70% монослоя) и инкубируют в среде с 1% сывороткой 24 часа. Затем добавляют ПИТ по изобретению в различной концентрации и инкубацию продолжают в тех же условиях. Через 24 часа морфологические изменения, наблюдаемые при росте нейритов, обнаруживают визуально посредством микроскопии и фиксируют на фотоснимках. Дифференцированными считаются клетки, у которых длина нейритов превышает длину тела клетки. Для количественного определения нейритогенной активности рассчитывают процент дифференцированных клеток по отношению к общему количеству видимых клеток (табл.).

Кроме того, ПИТ по изобретению может быть использован для получения фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество прямого ингибитора тромбина в фармацевтически приемлемом носителе, например лиофильно высушенный порошок для инъекций в асептически запаянных ампулах. Препарат легко растворим в воде для инъекций.

Учитывая эффективность ПИТ по изобретению in vitro (в концентрации 30 нМ увеличивает тромбиновое время для цельной плазмы в 8 раз) и объем циркулирующей крови в организме, средней разовой дозой можно считать 33-40 мкг/кг массы тела, а суточная доза для лечения заболевания или состояния, указанных выше, приблизительно от 0,01 до 1 мг/кг массы тела в сутки. Таким образом, для средней массы тела 70 кг уровень дозировки составляет приблизительно от 0,7 до 70 мг лекарственного средства в сутки, в однократной дозе или 2-5 дробных дозах.

Таким образом, изобретение расширяет ассортимент ПИТ. По сравнению с ближайшим аналогом - ботроярацином - заявленный ПИТ сходен с ним по источнику выделения (яд змей), химическому типу (полипептидное соединение) и по антикоагулянтной активности (прямой ингибитор тромбина смешанного типа). Прямой ингибитор тромбина по изобретению отличается от ботроярацина структурно в том, что принадлежит к другому классу белков (фосфолипазам А2), и функционально в том, что способен независимо от своей тромбин-ингибирующей активности останавливать пролиферацию опухолевых клеток, вызывая их дифференцировку.