способ получения культур молочнокислых бактерий и стартовая культура молочнокислых бактерий

Формула изобретения

1. Способ получения культур молочнокислых бактерий с повышенным выходом, ферментированных при аэрации и в условиях высокой оптической плотности, где упомянутый способ включает стадии:

i) культивирования молочнокислых бактерий в культуральной среде в условиях, которые позволяют ферментации проходить при оптической плотности, измеренной на 600 нм (ОD₆₀₀), выше 10, в которой указанная культуральная среда включает, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, выбранный из группы, содержащей пуриновое основание, пиримидиновое основание, нуклеозид, нуклеотид и их производные, в концентрации, которая обеспечивает содержание в культуральной среде, по меньшей мере, 1 мкМ указанного, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход, при завершении ферментации; и

ii) сбор указанных молочнокислых бактерий для получения культуры молочнокислых бактерий.

2. Способ по п.1, в котором указанная культуральная среда исходно содержит, по меньшей мере, 1 мМ, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход.

3. Способ по п.1, в котором указанная культуральная среда представляет собой комплексную среду ферментации, к которой добавлено, по меньшей мере, 0,2 г на 1 л, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход.

4. Способ по п.1, в котором указанный, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, добавляется в ходе ферментации.

5. Способ по п.1, в котором указанные условия высокой оптической плотности характеризуются OD₆₀₀ выше 15 при завершении ферментации.

6. Способ по п.1, в котором ферментацию микробной культуры выполняют при аэрации и в питательной среде, в которой присутствует или добавлено, по меньшей мере, одно порфириновое соединение.

7. Способ по п.1, в котором указанный агент, повышающий выход, выбран из группы, содержащей пуриновое основание, пиримидиновое основание, нуклеозид, нуклеотид и их производные.

8. Способ по п.7, в котором указанный агент, повышающий выход, представляет собой пуриновое основание и пуриновое основание предпочтительно выбрано из группы, содержащей аденин, гуанин, ксантин и гипоксантин.

9. Способ по п.7, в котором указанный агент, повышающий выход, представляет собой пиримидиновое основание.

10. Способ по п.9, в котором указанное пиримидиновое основание выбрано из группы, содержащей цитозин, тимин и урацил.

11. Способ по п.1, в котором указанный агент, повышающий выход, представляет собой нуклеозид.

12. Способ по п.11, в котором указанный нуклеозид выбран из группы, содержащей аденозин, гуанозин, уридин, цитидин, инозин, дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезокситимидин, дезоксицитидин и дезоксиинозин.

13. Способ по п.12, в котором указанный нуклеозид выбран из группы, содержащей аденозин, гуанозин, уридин, цитидин и инозин.

14. Способ по п.13, в котором указанный нуклеозид представляет собой инозин.

15. Способ по п.1, в котором указанный агент, повышающий выход, представляет собой нуклеотид.

16. Способ по п.15, в котором указанный нуклеотид выбран из группы, содержащей аденилат (АМФ), гуанилат (ГМФ), уридилат (УМФ), цитидилат (ЦМФ), ксантилат (КМФ), инозинат (ИМФ), дезоксиаденилат (дАМФ), дезоксигуанилат (дГМФ), дезокситимидилат (дТМФ), дезоксицитидилат (дЦМФ), дезоксиксантилат (дКМФ) и дезоксиинозинат (дИМФ).

17. Способ по п.16, в котором указанный нуклеотид выбран из группы, содержащей АМФ, ГМФ, УМФ, ЦМФ, КМФ и ИМФ.

18. Способ по п.17, в котором указанный нуклеотид представляет собой ИМФ.

19. Способ по п.1, в котором указанная культуральная среда содержит, по меньшей мере, два агента, повышающих выход, выбранных из группы, содержащей пуриновое основание, пиримидиновое основание, нуклеозид, нуклеотид и их производные.

20. Способ по п.19, в котором указанная культуральная среда содержит, по меньшей мере, два агента, повышающих выход, выбранных из группы, содержащей нуклеозид и нуклеотид.

21. Способ по п.20, в котором указанный нуклеозид представляет собой инозин, а упомянутый нуклеотид представляет собой ИМФ.

22. Способ по п.1, в котором указанная культуральная среда исходно содержит от 1 до 70 мМ каждого из агентов, повышающих выход.

23. Способ по п.22, в котором указанная культуральная среда исходно содержит от 1 до 60 мМ каждого из агентов, повышающих выход, в частности от 1,3 до 60 мМ, например, от 1,5 до 50 мМ, предпочтительно от 2 до 40 мМ, в частности от 2,5 до 30 мМ, например от 3 до 20 мМ, более предпочтительно от 3 до 15 мМ, в частности от 4 до 10 мМ, например около 7 мМ.

24. Способ по п.1, в котором OD₆₀₀ культуральной среды достигает OD от OD₆₀₀ =10

до OD₆₀₀=200, более предпочтительно OD от OD₆₀₀=15 до OD₆₀₀=100, а наиболее предпочтительно OD от OD₆₀₀=20 до OD₆₀₀=80.

25. Способ по п.1, в котором культивирование включает в себя контроль температуры и/или рН.

26. Способ по п.1, в котором культура содержит один или более организмов, выбранных из группы, содержащей Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., включая в себя Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactobacillus spp., включая в себя Lactobacillus acidophilus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp. и Oenococcus spp.

27. Способ по п.1, в котором культура содержит один или более мезофильных организмов, имеющих температурный оптимум роста при более чем 30°С.

28. Способ по п.1, в котором культура содержит один или более мезофильных организмов, избранных из группы, содержащей Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Lactobacillus casei подвид casei и Lactobacillus paracasei подвид paracasei.

29. Способ по п.1, в котором культура содержит один или более термофильных организмов, имеющих температурный оптимум роста при от около 40 до около 45°С.

30. Способ по п.1, в котором культура содержит один или более термофильных организмов, избранных из группы, содержащей Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbmeckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbmeckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.

31. Способ по п.1, в котором культура представляет собой LD-культуру, которая содержит один или более организмов, избранных из группы, содержащей Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris.

32. Способ по п.1, в котором культура представляет собой О-культуру, которая содержит один или более организмов, избранных из группы, содержащей Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris.

33. Способ по п.1, в котором культура представляет собой культуру, содержащую Lactococcus lactis.

34. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает

iii) замораживание указанного собранного микроорганизма для получения замороженных микробных клеток.

35. Способ по п.34, где указанный способ дополнительно включает

iv) сублимацию воды из указанных клеток для получения замороженных-высушенных клеток.

36. Способ по п.34 или 35, где указанный способ дополнительно включает

v) упаковку указанных клеток, полученных на стадии iii) или iv).

37. Способ по п.33, в котором к собранным микроорганизмам добавлен, по меньшей мере, один криопротектор.

38. Стартовая культура молочнокислых бактерий, полученная способом по любому из пп.1-37.

39. Стартовая культура по п.38, где стартовая культура представляет собой концентрат стартовой культуры.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области микробных стартовых культур. Более конкретно, данное изобретение представляет способ приготовления стартовых культур молочнокислых бактерий (LAB), в котором молочнокислые бактерии инокулируются в культуральную среду, содержащую, по меньшей мере, один агент, увеличивающий выход, избранный из группы, содержащей одно или более соединение (соединений), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот, или одно или более производное (производных) какого-либо из таких соединений. Такие стартовые культуры применимы в производстве пищевых, кормовых и фармацевтических продуктов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микробные культуры широко используются в пищевой, кормовой и фармацевтической промышленности в производстве ферментированных продуктов, включающих в себя большинство молочных продуктов, таких как сыр, йогурт и масло, но также и мясные, хлебобулочные, винные и овощные продукты. Кроме того, микробные культуры также применяют для получения белков, включающих в себя ферменты и различные виды полезных соединений. Такие микробные культуры обычно обозначаются как стартовые культуры и производятся на фабриках по промышленному размножению и распространяются в ферментационной промышленности, такой как молочные фабрики, где стартовая культура используется в соответствующих производственных процессах. В частности, культуры молочнокислых бактерий широко используются как стартовые культуры.

Так, как это используется в данном документе, термин «молочнокислая бактерия» (LAB) обозначает грам-позитивную, микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с образованием кислот, включающих в себя молочную кислоту (как главным образом образующуюся кислоту), уксусную кислоту и пропионовую кислоту. Наиболее используемые в промышленности молочнокислые бактерии включают в себя Lactococcus species (spp.), Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp, Pediococcus spp., Brevibacterium spp, Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Дополнительно, бактерии, продуцирующие молочную кислоту и принадлежащие к группе строго анаэробных бактерий, bifidobacteria, т.е. Bifidobacterium spp., которые часто используются как стартовые культуры по отдельности или в комбинации с молочнокислыми бактериями, в целом включаются в группу молочнокислых бактерий. Даже определенные бактерии видов Staphylococcus (например: S. carnosus, S. equorum, S. sciuri, S. vitulinus и S. xylosus) относятся к LAB (Mogensen et al. (2002) Bulletin of the IDF No. 377, 10-19).

Производство стартовых культур LAB вовлекает инокуляцию клеток LAB в специфическую ферментационную среду с соответствующим числом клеток, которые размножаются при соответствующих условиях ферментации. В промышленных установках большие усилия прилагаются к тому, чтобы добиться высокой концентрации размножающихся клеток до окончания процесса ферментации. Это делает затруднительными требования к условиям ферментации и среде ферментации, которые должны поддерживать рост клеток с целью получить желаемый высокий выход биомассы.

Оптическая плотность жидкой среды при 600 нм (OD₆₀₀) является точным средством оценки плотности бактериальных клеток в образце культуры. Термином «условия высокой оптической плотности» обозначаются ферментации, которые характеризуются достаточно высокой концентрацией размножающихся клеток, дающей OD₆₀₀ , равный 10 или более в конце процесса ферментации.

Чтобы поддерживать низкую стоимость, промышленные ферментации обычно производятся с использованием комплексных сред ферментации нестрого определенного состава. Основными компонентами таких сред могут быть экстракт дрожжей, кукурузный крахмал, сывороточный белок или другие среды, основанные на молоке, которые все имеют сложный состав. Для некоторых ферментаций используют среды химически определенного состава, которые часто изготовляют из химически чистых веществ. Химически чистые вещества, такие как специфические источники энергии или источники углерода, также часто добавляют в комплексные среды ферментации для специфических целей. В любом случае, композиция среды ферментации может быть оптимальной для жизнеспособности микробных клеток, но не оптимальной для получения большого выхода биомассы микроорганизмов.

Большинство соединений, которые требуются для клеточного роста, для своей продукции требуют энергии. Часто требуется, чтобы экспрессировались гены, кодирующие соответствующие биосинтетические ферменты. Синтез таких ферментов требуется и для энергии аминокислот. Это налагает на клетку «белковое бремя», поскольку она должна синтезировать относительно большое количество ферментов для того, чтобы иметь возможность роста. Предшественники, требующиеся для образования клеточных компонентов, кроме того, должны браться из других путей, что опять-таки ведет к дополнительной нагрузке на клетку.

Было обнаружено, что определенные соединения, вовлеченные в биосинтез нуклеиновых кислот, действуют как так называемые криопротекторные агенты и уменьшают повреждающие эффекты на жизнеспособность живых клеток при процедурах замораживания и оттаивания. WO 00/39281 описывает использование инозината (ИМФ) и других соединений, вовлеченных в биосинтез ДНК, для стабилизации метаболической активности жидкой стартовой культуры при хранении.

Хорошо известно, что LAB имеет сложные требования к факторам роста и что соединения, вовлеченные в биосинтез ДНК и/или РНК, стимулируют рост LAB в химически определенных средах. Однако некоторые сообщения показывают, что хотя добавление таких соединений приводит к укорочению лаг-фазы или более высокой первоначальной скорости роста, добавление не приводит к повышению выхода или приводит к лишь слабому повышению выхода (Klistrup (2005) FEMS Microbiol Rev. 29, 555-590; Nygaard (1951) J Bad 61, 497-505; Weinman (1964) J Bact 87, 263-269). Добавление соединений, вовлеченных в биосинтез ДНК, могут даже ингибировать выход (Weinman (1964) J Bact 87, 263-269).

Как проиллюстрировано в Примерах 3 и 4, добавление дополнительных соединений, вовлеченных в биосинтез ДНК, также не увеличивает выход биомассы после ферментации, выполненной в условиях высокой оптической плотности.

Соответственно, существует необходимость получения новых подходов к повышению выхода микробной биомассы при ферментации в условиях высокой оптической плотности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема, которую должно решить данное изобретение, состоит в получении способа приготовления микробной культуры LAB для получения повышенного выхода в условиях высокой оптической плотности.

В 1936 г. Richardson (Biochem J. 30, 2186) сообщил, что урацил является существенным для анаэробного Staphylococcus, но не для аэробного роста того же самого организма. Таким образом, было удивительно обнаружить, что возможно увеличить выход биомассы при аэробном культивировании или продукции стартовой культуры LAB путем добавления соединения, вовлеченного в биосинтез нуклеиновых кислот, к комплексной среде ферментации.

Соответственно, первый аспект данного изобретения относится к способу получения повышенного выхода культуры молочнокислых бактерий, ферментированной при аэрации и в условиях высокой оптической плотности, где упомянутый способ включает стадии:

i) культивирования молочнокислых бактерий в культуральной среде и в условиях, которые позволяют протекать ферментации при измеренной на 600 нм (OD₆₀₀) оптической плотности выше 10, где указанная культуральная среда включает, по меньшей мере, один агент, увеличивающий выход, избранный из группы, состоящей из пуринового основания, пиримидинового основания, нуклеозида, нуклеотида и их производных в концентрации, которая обеспечивает то, что культуральная среда содержит, по меньшей мере, 1 мкМ указанного, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход, при завершении ферментации; и

ii) сбор указанных молочнокислых бактерий для получения культуры молочнокислых бактерий,

где агент, повышающий выход, приводит к повышению выхода собранных молочнокислых бактерий по сравнению с культивированием микроорганизма при идентичных условиях и в сходной среде, которая содержит менее чем 1 мкМ каждого агента, повышающего выход, при завершении ферментации.

Предпочтительно, указанная культуральная среда содержит, по меньшей мере, 5 мкМ, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход, в частности, по меньшей мере, 10 мкМ, например, по меньшей мере, 50 мкМ, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход. В частности, указанная культуральная среда содержит, по меньшей мере, 5 мкМ агента (агентов), которые выбраны из группы ИМФ, ГМФ, инозина и гуанина.

Предпочтительно, указанная сходная среда содержит менее чем 5 мкМ каждого агента, повышающего выход, в частности, менее чем 1 мкм, например, менее чем 0,5 мкМ каждого агента, повышающего выход. В частности, упомянутая сходная среда содержит менее чем 5 мкМ агента (агентов), который (которые) избраны из группы ИМФ, ГМФ, инозина и гуанина.

Второй аспект данного изобретения относится к стартовой культуре, которая может быть получена способом в соответствии с первым аспектом данного изобретения и вариантами его реализации, как описано в данном документе.

Третий аспект данного изобретения относится к культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, избранный из группы, содержащей пуриновое основание, пиримидиновое основание, нуклеозид, нуклеотид и их производные.

Четвертый аспект данного изобретения относится к способу изготовления пищевого продукта, кормового продукта, фармацевтического продукта, продукта с молочным вкусом и продукта со вкусом сыра, где указанный способ включает добавление эффективного количества микробной стартовой культуры в соответствии со вторым аспектом данного изобретения и вариантами его реализации, как описано в данном документе, в исходный материал пищевых, кормовых и фармацевтических продуктов и поддержании таким образом инокулированного исходного материала в условиях, в которых микроорганизм является метаболически активным.

Пятый аспект данного изобретения относится к ферментированным пищевым, кормовым или фармацевтическим продуктам, которые могут быть получены способом по четвертому аспекту данного изобретения и вариантам его реализации, как описано в данном документе.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед обсуждением подробных вариантов реализации данного изобретения предоставлены следующие определения специфических терминов, использованных в данном документе.

В данном документе термин «пуриновое основание» предназначен охватывать циклические азотсодержащие основания, имеющие основную структуру пурина. Таким образом, в данном контексте термин «пуриновое основание» предназначен обозначать возможно замещенный пурин. Конкретные примеры пуриновых оснований включают в себя аденин, гуанин, ксантин и гипоксантин.

Аналогичным образом, термин «пиримидиновое основание» предназначено охватывать циклические азотсодержащие основания, имеющие основную структуру пиримидина. Таким образом, в данном контексте термин «пиримидиновое основание» предназначен означать возможно замещенный пиримидин. Конкретные примеры пиримидиновых оснований включают в себя цитозин, тимин и урацил.

В данном контексте термин «нуклеотид» означает мономер 2-дезоксирибозы (в ДНК) или мономер рибозы (в РНК), который связан через свой атом углерода в первом положении с пуриновым основанием, таким как аденин, гуанин, ксантин или гипоксантин, или который связан через свой атом углерода в первом положении с пиримидиновым основанием, таким как цитозин, тимин или урацил. Далее, мономер ДНК или РНК связан через свой атом углерода в пятом положении с фосфатной группой. Конкретные примеры нуклеотидов включают в себя аденозин монофосфат (АМФ), гуанозин монофосфат (ГМФ), уридин монофосфат (УМФ), цитидин монофосфат (ЦМФ), ксантин монофосфат (КМФ), инозин монофосфат (ИМФ), дезоксиаденозин монофосфат (дАМФ), дезоксигуанозин монофосфат (дГМФ), тимидин монофосфат (дТМФ), дезоксицитидин монофосфат (дЦМФ), дезоксиксантин монофосфат (дКМФ) и дезоксиинозин монофосфат (дИМФ). ИМФ является особенно предпочтительным.

Использование в данном документе термина «нуклеозид» предназначено означать мономер 2-дезоксирибозы (в ДНК) или мономер рибозы (в РНК), который связан через свой атом углерода в первом положении с пуриновым основанием, таким как аденин, гуанин, ксантин или гипоксантин, или который связан через свой атом углерода в первом положении с пиримидиновым основанием, таким как цитозин, тимин или урацил. Конкретные примеры нуклеозидов включают в себя аденозин, гуанозин, уридин, цитидин, инозин, дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезокситимидин, дезоксицитидин и дезоксиинозин. Инозин является особенно предпочтительным.

Из вышеприведенных определений терминов «нуклеозид» и «нуклеотид» понятно, что нуклеотид можно рассматривать как нуклеозид, содержащий фосфатную группу, связанную через атом углерода в пятом положении остатка сахара. Соответственно, нуклеотиды, описанные в данном документе, также могут упоминаться как «нуклеозид»-5'-монофосфат. Например, инозинат (ИМФ) может упоминаться как инозин-5'-монофосфат, дезоксиинозинат (дИМФ) может упоминаться как дезоксиинозин-5'-монофосфат и т.д.

В данном контексте термин «производное», когда он используется в связи с терминами «нуклеотид» или «нуклеозид», предназначен означать, что рассматриваемый нуклеотид или нуклеозид модифицирован в своем сахарном остатке (т.е. 2-дезоксирибозе или рибозе), или что рассматриваемый нуклеотид или нуклеозид модифицирован в своем циклическом азотсодержащем основании, или что рассматриваемый нуклеотид или нуклеозид модифицирован и в сахарном остатке, и в своем циклическом азотсодержащем основании. Например, 2'-H группа дезоксирибозного остатка или 2'-OH группа рибозного остатка могут быть модифицированы, например, путем включения в себя 2'-F группы, 2'-О-метильной группы и им подобных. Аналогично, циклическое азотсодержащее основание может содержать один или более заместителей, обычно не присутствующих в аденине, гуанине, ксантине, гипоксантине, цитозине, тимине и урациле. Конкретные примеры включают в себя 5-метилцитозин (^MeC), изоцитозин, псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6-фторурацил, 5-метилтиазолурацил, 6-аминопурин, 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7-деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин.

Так, как он используется в данном документе, термин «ферментация» относится к процессу размножения или культивирования микробных клеток в аэробных или анаэробных условиях.

Термин «стартовая культура» относится к препаратам, содержащим микробные клетки, которые предназначены для инокуляции в среду, которую надлежит ферментировать.

В данном контексте термин «выход» относится к количеству биомассы, продуцируемой при ферментации данного объема. Выход может быть измерен множеством способов; здесь выход измерен двумя различными путями: 1) как биомасса на единицу объема, измеренная (за вычетом фона) по оптической плотности на 600 нм (OD₆₀₀) при световом пути 1 см в среде ферментации в конце ферментации, или 2) в кг культуры F-DVS с «закисляющей активностью» 4,8-5,1 в соответствии с тестом Пирса, описанным в Примере 2: аналитическая процедура QAm-043 в конце ферментации.

Термин «F-DVS» относится к так называемой замороженной культуре Direct Vat Set, как описано в Примере 1.

Термин «порфириновое соединение» относится к циклическим тетрапиррольным производным, чья структура происходит от таковой порфирина путем замещения атомов углерода, расположенных на вершинах пиррольного скелета, различными функциональными группами. Он также относится к комплексам упомянутых производных с атомом металла, который образует координационную связь с двумя из четырех атомов азота порфиринового кольца. Это определение охватывает, но не ограничивается ими: уропорфирины, копропорфирины, протопорфирины и гематопорфирины, так же как их соли и эфиры, и их комплексы с атомами металла. Особенно предпочтительными порфириновыми соединениями являются протопорфирин IX и его комплексы с атомом железа, в частности, гем и гемин, и производные хлорофилла, такие как хлорофиллины.

В данном контексте выражение «молочнокислые бактерии» (LAB) обозначает группу грам-позитивных, каталаза-негативных, неподвижных, микроаэрофильных или анаэробных бактерий, которые ферментируют сахар с образованием кислот, включающих в себя молочную кислоту как кислоту, образующуюся главным образом, уксусную кислоту, муравьиную кислоту и пропионовую кислоту. Наиболее пригодные в промышленности молочнокислые бактерии обнаруживаются среди Lactococcus species (spp.), Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp, Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Кроме того, бактерии, продуцирующие молочную кислоту, принадлежат к группе строго анаэробных бактерий, bifidobacteria, т.е. Bifidobacterium spp., которые часто используются как пищевые стартовые культуры по отдельности или в комбинации с молочнокислыми бактериями, в целом включены в группу молочнокислых бактерий. Даже определенные бактерии видов Staphylococcus (например: S. carnosus, S. equorum, S. sciuri, S. vitulinus и S. xylosus) отнесены к LAB (Mogensen et al. (2002) Bulletin of the IDF No. 377, 10-19).

Обычно используемые в стартовых культурах штаммы молочнокислых бактерий, в целом, подразделяются на мезофильные организмы, имеющие температурный оптимум роста около 30°С, и термофильные организмы, имеющие температурный оптимум роста в диапазоне около 40 - около 45°С. Обычные организмы, принадлежащие к мезофильной группе, включают в себя Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Lactobacillus casei подвид casei и Lactobacillus paracasei подвид paracasei. Виды термофильных молочнокислых бактерий включают в себя в качестве примеров Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.

Вследствие того факта, что количество и, следовательно, концентрация агента, повышающего выход, в среде может меняться с течением времени, например, вследствие включения в микробные клетки, необходимо упомянуть конкретный момент времени, когда концентрация агента, повышающего выход, должна быть измерена или определена. Следовательно, термин «исходно», когда он используется в связи с концентрацией агента, повышающего выход, в среде, относится к концентрации агента, повышающего выход, представленной в среде непосредственно перед добавлением культивируемых микробных клеток в среду или, в качестве альтернативы, к концентрации агента, повышающего выход, представленной в среде непосредственно после того, как культивируемые микробные клетки были добавлены в среду.

Значительным применением стартовой культуры в соответствии с данным изобретением является так называемая протобиотика. В данном контексте термин «протобиотический» следует понимать как микробные культуры, которые, будучи поглощенными в форме жизнеспособных клеток, человеком или животными, приносят улучшение состояния здоровья, например, путем подавления вредоносных микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте, за счет укрепления иммунной системы или улучшения переваривания питательных веществ. Типичным примером такого протобиотически активного продукта является «сладкий ацидофилин».

Варианты реализации данного изобретения описаны ниже только посредством примеров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с данным изобретением решение проблемы разработки способа приготовления микробной культуры LAB с получением повышенного выхода в условиях высокой оптической плотности состоит в ферментировании культуры в аэробных условиях в среде, которая содержит, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, избранный из группы, состоящей из одного или более соединения (соединений), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот, или одного или более производного (производных) любого такого соединения.

Не ограничиваясь конкретной теорией, предполагается, что повышенный выход связан с ситуацией, в которой, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, постоянно появляется в среде ферментации в течение всей ферментации. Наблюдается, что истощение агентов, повышающих выход, в среде приводит к запуску различных ферментных систем синтеза de novo (смотри пример 6), и предполагается, что такой требующий расхода энергии синтез de novo приводит к уменьшению выхода.

Ситуация, в которой, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, постоянно появляется в среде ферментации в ходе всей ферментации, может быть получена путем культивирования LAB в среде, которая исходно содержит достаточное количество агента, повышающего выход, чтобы обеспечить сохранение в среде, по меньшей мере, одного такого агента в ходе всей ферментации. Одной из таких сред является культуральная среда, исходно содержащая, по меньшей мере, 1 мМ, предпочтительно, по меньшей мере, 3 мМ, и даже более предпочтительно - по меньшей мере, 3 мМ, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход, избранного из группы, состоящей из одного или более соединения (соединений), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот или одного или более производного (производных) какого-либо из таких соединений.

Такая среда может быть получена путем приготовления среды с использованием компонентов, которые особенно богаты агентами, повышающими выход, избранными из группы, состоящей из одного или более соединения (соединений), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот, или одного или более производного (производных) какого-либо из таких соединений. Одним из таких компонентов может быть экстракт дрожжей, в частности так называемые препараты «обогащенного» или «усиленного» экстракта дрожжей, которые особенно богаты пуринами и/или пиримидинами.

Вместо приготовления среды с использованием препаратов, которые особенно богаты агентами, повышающими выход, очищенные агенты могут быть добавлены в формы стандартных в других отношениях сред. Например, культуральной средой может быть комплексная среда ферментации, к которой добавлено (на л), по меньшей мере, 0,2 г, предпочтительно, по меньшей мере, 0,8 г и даже более предпочтительно, по меньшей мере, 2 г, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход.

Также возможно обеспечить, чтобы, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, оставался в среде в ходе всей ферментации путем одного или более добавлений упомянутого, по меньшей мере, одного агента, повышающего выход, при ферментации.

Данное изобретение особенно полезно в условиях высокой оптической плотности, которая требуется для многих промышленных установок. В избранном варианте реализации данного изобретения, упомянутые условия высокой оптической плотности характеризуются OD₆₀₀ выше 15, предпочтительно - выше 20, более предпочтительно - выше 30, еще более предпочтительно - более 40, а наиболее предпочтительно - более 50 при завершении ферментации.

В предпочтительном варианте реализации, в котором упомянутый повышенный выход собранных микроорганизмов по способу по первому аспекту данного изобретения повышен, по меньшей мере, в 1,2 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 1,3 раза, более предпочтительно, по меньшей мере, в 1,4 раза, еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 1,5 раза, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 1,6 раза.

В соответствии с данным изобретением микроорганизм ферментируется в аэробных условиях. Предпочтительно, ферментация микробной культуры выполняется при аэрации и в питательной среде, в которой присутствует или добавлено, по меньшей мере, одно порфириновое соединение. В предпочтительном варианте реализации LAB культивируются при аэрации в порфирин-содержащей питательной среде, как описано в WO 00/0542, в которой указанная среда также содержит, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, избранный из группы, состоящей из одного или более соединения (соединений), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот или одного или более производного (производных) какого-либо из таких соединений. WO 00/0542, таким образом, включена по ссылке. Аэрация может быть достигнута каким-либо средством, известным специалистам в данной области техники, например, путем встряхивания или перемешивания культуральной среды или пропускания газовой смеси, содержащей кислород, например, воздуха через культуральную среду.

В предпочтительном варианте реализации указанный агент, повышающий выход, выбран из группы, состоящей из пуринового основания, пиримидинового основания, нуклеозида, нуклеотида и их производных.

Указанный агент, повышающий выход, может быть пуриновым основанием, предпочтительно, пуриновое основание выбрано из группы, состоящей из аденина, гуанина, ксантина и гипоксантина.

Указанный агент, повышающий выход, может быть пиримидиновым основанием, предпочтительно пиримидиновое основание выбрано из группы, состоящей из цитозина, тимина и урацила.

Указанный агент, повышающий выход, может быть нуклеозидом, предпочтительно, указанный нуклеозид выбран из группы, состоящей из аденозина, гуанозина, уридина, цитидина, инозина, дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина, дезоксицитидина и дезоксиинозина.

В предпочтительном варианте реализации указанный нуклеозид выбран из группы, состоящей из аденозина, гуанозина, уридина, цитидина, тимидина и инозина. Наиболее предпочтительным из указанных нуклеозидов является инозин.

Указанный агент, повышающий выход, может быть нуклеотидом, предпочтительно указанный нуклеотид выбран из группы, состоящей из аденозин монофосфата (АМФ), гуанозин монофосфата (ГМФ), уридин монофосфата (УМФ), цитидин монофосфата (ЦМФ), ксантин монофосфата (КМФ), инозин монофосфата (ИМФ), дезоксиаденозин монофосфата (дАМФ), дезоксигуанозин монофосфата (дГМФ), тимидин монофосфата (дТМФ), дезоксицитидин монофосфата (дЦМФ), дезоксиксантин монофосфата (дКМФ) и дезоксиинозин монофосфата (дИМФ).

В предпочтительном варианте реализации указанный нуклеотид выбран из группы, состоящей из АМФ, ГМФ, УМФ, ЦМФ, КМФ и ИМФ. Наиболее предпочтительно, когда указанный нуклеотид является ИМФ.

Предпочтительным вариантом реализации является такой, в котором указанная культуральная среда содержит, по меньшей мере, два агента, повышающих выход, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из пуринового основания, пиримидинового основания, нуклеозида, нуклеотида и их производных.

Предпочтительно, указанная культуральная среда содержит, по меньшей мере, два агента, повышающих выход, выбранных из группы, состоящей из нуклеозида и нуклеотида. Наиболее предпочтительно, когда указанный нуклеозид представляет собой инозин, а указанный нуклеотид представляет собой ИМФ.

Предпочтительным вариантом реализации является такой, в котором указанная культуральная среда исходно содержит от 1 до 70 мМ каждого их агентов, повышающих выход.

Более предпочтительно, когда указанная культуральная среда исходно содержит от 1 до 60 мМ каждого агента, повышающего выход, в частности, от 1,3 до 60 мМ, например, от 1,5 до 50 мМ, предпочтительно - от 2 до 40 мМ, в частности, от 2,5 до 30 мМ, например, от 3 до 20 мМ, более предпочтительно - от 3 до 15 мМ, в частности, от 4 до 10 мМ, например, около 7 мМ.

К удивлению, способом по данному изобретению неожиданно оказалось возможным получить культуры LAB, которые достаточно концентрированы, чтобы быть использованными для производства F-DVS без концентрирования культуры. Однако, даже когда применяется данный способ, большинство культур нуждается в концентрировании, чтобы получить стартовые культуры, представляющие коммерческий интерес. Такие культуры предпочтительно могут быть собраны и концентрированы с помощью центрифугирования или ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте реализации культивирование микроорганизма проводится в условиях, в существенных чертах отвечающих промышленным, в условиях высокой оптической плотности.

Соответственно, предпочтительный вариант реализации, в котором оптическая плотность (OD) культуры на 600 нм и длине светового пути 1 см в среде достигает OD от OD₆₀₀=10 до OD₆₀₀=200, более предпочтительно - OD от OD₆₀₀=15 до OD₆₀₀=100, еще более предпочтительно - OD от OD₆₀₀=20 до OD₆₀₀ =90, а наиболее предпочтительно - OD от OD₆₀₀=25 до OD₆₀₀=80.

Далее, предпочтительный вариант реализации - это такой, в котором культивирование проводится в ферментере большого объема, содержащем от 5 л до 100000 л культуральной среды, предпочтительно - от 300 л до 20000 л культуральной среды.

Предпочтительный вариант реализации - это такой, в котором культивирование включает в себя контроль температуры и/или pH.

Предпочтительно культура содержит один или более организмов, избранных из группы, состоящей из Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., включая в себя Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactobacillus spp., включая в себя Lactobacillus acidophilus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp. и Oenococcus spp.

Культура может содержать один или более мезофильных организмов, имеющих оптимальную температуру роста около 30°С, предпочтительно один или более мезофильных организмов избраны из группы, состоящей из Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Lactobacillus casei подвид casei и Lactobacillus paracasei подвид paracasei.

Культура может содержать один или более термофильных организмов, имеющих температурные оптимумы роста выше 40°С до около 45°С, предпочтительно один или более термофильных организмов избраны из группы, состоящей из Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.

Предпочтительно культура является LAB-культурой, которая содержит один или более организмов, избранных из группы, состоящей из Lactococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp. и Bifidobacterium spp.

Культура может быть LD-культурой, которая содержит один или более организмов, избранных из группы, состоящей из Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris.

Культура может быть O-культурой, которая содержит один или более организмов, избранных из группы, состоящей из Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris.

В предпочтительном варианте реализации культура является культурой, содержащей Lactococcus lactis.

Коммерческие стартовые культуры могут обычно поставляться в виде замороженных культур. При низких температурах, при которых обычно содержат такие замороженные культуры, метаболическая активность в клетках в основном прекращается, а клетки могут содержаться в таком заторможенном, но жизнеспособном, состоянии в течение продолжительных периодов времени.

Концентрированные замороженные культуры представляют большой коммерческий интерес, поскольку такие культуры могут быть инокулированы непосредственно в производственный контейнер. Путем использования таких концентрированных замороженных культур потребитель устраняет необходимые в ином случае, требующие времени промежуточные стадии ферментации, в ходе которых стартовая культура амплифицируется, и потребитель, к тому же, уменьшает риск опасной контаминации. Такие концентрированные культуры могут быть обозначены как культуры DVS - direct vat set .

Как альтернатива концентрированным замороженным культурам могут быть приготовлены концентрированные замораживанием-высушиванием культуры direct vat set , FD-DVS . Такие культуры имеют дополнительное преимущество, состоящее в том, что они могут поставляться без охлаждения.

Таким образом, в предпочтительном варианте реализации, способ изготовления микробной культуры с повышенным выходом, как описано в данном документе, дополнительно включает:

iii) замораживание упомянутых собранных микроорганизмов с получением замороженных микробных клеток.

Упомянутый способ может также включать:

iv) сублимацию воды из упомянутых замороженных клеток, чтобы получить замороженные-высушенные клетки.

Иными словами, собранная культура микроорганизмов преобразуется в замороженную-высушенную культуру.

Способ может также включать:

v) упаковку клеток, полученных на стадии iii) или iv).

Часто наблюдаются повреждающие эффекты замораживания и оттаивания на жизнеспособность живых клеток. В целом, они приписываются обезвоживанию клетки и образованию кристаллов льда в цитозоле при замораживании.

Однако, обнаружено множество криопротекторных агентов, обеспечивающих, чтобы замораживание проходило контролируемым и минимально повреждающим образом, например, обеспечением того, что кристаллизация льда в цитозоле при замораживании предотвращается или минимизируется.

Предпочтительно к собранным микроорганизмам добавляют, по меньшей мере, один криопротектор.

Предпочтительно, криопротекторный агент (агенты) избраны из группы, содержащей одно или более вещество (веществ), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот, или одно или более производное (производных) какого-либо из этих соединений. Примеры предпочтительного криопротекторного агента (агентов), подходящих для добавления к собранным микроорганизмам, в основном соответствуют предпочтительному агенту (агентам), повышающим выход, как описано в данном документе. Добавление такого криопротекторного агента (агентов) к собранным микроорганизмам описано в ранее поданной патентной заявке номер PCT/DK2004/000477. Предпочтительный криопротекторный агент (агенты), описанные в PCT/DK2004/000477, также являются предпочтительным криопротекторным агентом (агентами) по данному изобретению. Полное описание PCT/DK2004/000477 включено в данный документ в виде ссылки.

Альтернативным вариантом реализации данного изобретения является способ изготовления микробных культур с повышенными выходами, как описано в данном документе, и который также содержит стадию высушивания собранных микроорганизмов путем высушивания распылением, вакуумного высушивания, сушки воздухом или какого-либо процесса высушивания, который пригоден для высушивания бактериальных культур.

Предпочтительно, стартовая культура по второму предмету данного изобретения готовится как концентрат стартовой культуры, поскольку содержит, по меньшей мере, 10⁸ колониеобразующих единиц (CFU) организмов стартовой культуры.

Третий аспект по изобретению относится к культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, выбранный из группы, состоящей из пуринового основания, пиримидинового основания, нуклеозида, нуклеотида и их производных. Несмотря на то, что большое количество агента, повышающего выход, расходуется в ходе ферментации, по-видимому, большое количество его остается в супернатанте культуры, что обеспечивает возможность идентифицировать, что концентрированная культура является продуктом среды по данному способу (смотри пример 5 или 6).

Предпочтительно, пищевой продукт по четвертому аспекту данного изобретения представляет собой таковой, выбранный из группы, содержащей продукт, основанный на молоке, овощной продукт, мясной продукт, напиток, фруктовый сок, вино и хлебобулочный продукт.

Предпочтительно, продукт, основанный на молоке, представляет собой таковой, выбранный из группы, содержащей сыр, йогурт, масло, инокулированное свежее молоко и жидкий ферментированный молочный продукт.

В отдельном аспекте данного изобретения предоставляется способ получения повышенного выхода (выходов) микробно продуцированного соединения (соединений), где указанный способ включает стадии:

i) культивирования микроорганизма в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, один агент, повышающий выход, избранный из группы, состоящей из одного или более соединения (соединений), вовлеченных в биосинтез нуклеиновых кислот или одного или более производного (производных) какого-либо из таких соединений; и

ii) получения упомянутого микробно продуцируемого соединения (соединений),

в котором агент, повышающий выход, приводит к повышенному выходу микробно продуцируемого соединения (соединений) по сравнению с культивированием микроорганизма в идентичной среде без определимых количеств агента, повышающего выход.

Соединения, продуцируемые микробными организмами, как описано, включают, но не ограничиваются ими, ферменты, белки, метаболиты, гликолипиды, антибиотики, бактериоцины, аминокислоты, вкусовые вещества, летучие вещества. Такие соединения могут продуцироваться с помощью технологии рекомбинантной ДНК или общепринятыми средствами.

Данное изобретение далее проиллюстрировано нижеследующими не ограничивающими примерами и чертежами, в которых:

Фиг. 1 показывает выходы трех ферментаций S. Thermophilus, выполненных в анаэробных условиях. График показывает биомассу, измеренную как OD₆₀₀, неконцентрированных образцов среды ферментации в ферментере как функции времени (часы). Заполненные треугольники обозначают добавление 0,2% вес./вес. ИМФ, заполненные кружки обозначают добавление 0,2% вес./вес. инозина, а заполненные квадраты обозначают, что никаких агентов, повышающих выход, не было добавлено. 0,2% вес./вес. инозина приблизительно составляет 7 мМ инозина.

Фиг. 2 - уровень различных нуклеосоединений и оптическая плотность в ходе ферментации в обогащенной комплексной среде, содержащей сравнительно высокие количества пуринов. Кратко, Lactococcus lactis (штамм CHCC2862) выращивали аэробно в комплексной среде, содержащей экстракт дрожжей и другие комплексные компоненты. Концентрация в мкМ (левая ось ординат) и OD₆₀₀ (правая ось ординат) нанесены относительно времени. Сокращения: G, гуанин; A, аденин; Hx, гипоксантин; X, ксантин; IR, инозин; GR, гуанозин; GdR, дезоксигуанозин; AR, аденозин.

Фиг. 3 - уровень пуриновых соединений в ходе ферментации с 2 г/л инозина, добавленного в среду. Кратко, Lactococcus lactis (штамм CHCC2862) выращивали аэробно в такой же комплексной среде, как использованная на Фиг. 2, за исключением того, что добавлено 2 г инозина на л среды. Концентрация в мкМ (левая ось ординат) и OD₆₀₀ x 100 (правая ось ординат) нанесены относительно времени. Следует отметить, что уровень инозина обозначен правой осью ординат. Сокращения: G, гуанин; A, аденин; Hx, гипоксантин; X, ксантин; IR, инозин; GR, гуанозин; GdR, дезоксигуанозин; AR, аденозин и IR, инозин (отметить разные оси для инозина).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Выход ферментаций, выполненных в трех различных типах культуральных сред

Чтобы проиллюстрировать эффект добавления дополнительных пуринсодержащих соединений к уже обогащенным и оптимизированным средам трех различных типов культур промышленного масштаба, их сравнивали.

Все три типа культур вели при аэрации и в питательной среде, в которой присутствует или добавлено, по меньшей мере, одно порфириновое соединение, как описано в международной патентной заявке WO 00/05342 (процедура EMIL), и во всех случаях это была так называемая «O-культура», содержащая Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris. O-культуры обычно используют для изготовления сыра без отверстий (чеддер, чешир, фета). Конкретная культура коммерчески доступна под наименованием R 604 фирмы Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Дания (каталожный № 200113).

Три среды описаны в Таблице 1.

Таблица 1
Обозначения культур	Основная культуральная среда	Добавлен экстракт дрожжей	Другие добавки
Old EMIL	BD-5-ex3*	1,7% вес./вес. стандартный экстракт дрожжей**
New EMIL	BD-5-ex3*	1,7% вес./вес. новый экстракт дрожжей**
Super EMIL	BD-5-ex3*	1,7% вес./вес. новый экстракт дрожжей**	0,2% вес./вес. ИМФ*** 0,2% вес./вес. инозин00
*BD-5-ex3 является оптимизированной порфиринсодержащей культуральной средой в соответствии с WO 00/05342 и WO 01/52668. ** стандартный экстракт дрожжей и новый дрожжевой экстракт представляют собой два коммерчески доступных экстракта дрожжей. *** ИМФ - это инозин-5'-монофосфат (ИМФ (фирма Alsiano A/S, Birkeroed, Дания). 00 инозин - это инозин (фирма Alsiano A/S, Birkeroed, Дания).

Культивирование выполняли в 550 л или 10000 л промышленных ферментационных емкостях при 30°С с использованием 0,5 % (вес./вес.) культуры, упомянутой выше как инокулят. Ферментации проходили в аэробных условиях, как описано в WO 00/05342. Культурам позволяли закисление до pH 6,2. pH затем поддерживали на уровне 6,2 путем контролируемого добавления 13,4 N NH₄OH.

Когда потребление основания переставало обнаруживаться, соответствующую культуру охлаждали до около 10°С.

После охлаждения, бактерии в культуральной среде концентрировали 6-18 раз путем центрифугирования и последующего замораживания в виде осадка в жидком азоте при давлении в одну атмосферу для получения так называемой замороженной культуры Direct Vat Set (F-DVS). Осадки F-DVS хранили при -50°С до дальнейшего анализа.

Выходы ферментаций определяли двумя различными путями: 1) по измерению оптической плотности полученной биомассы на 600 нм (OD600), 2) по кг культуры F-DVS с «закисляющей активностью» 4,8-5,1 по соответствующему тесту Пирса, описанному в Примере 2: Аналитическая процедура QAm-043.

Результаты показаны в Таблице 2.

Таблица 2 Выходы ферментаций, измеренные как OD600
Обозначение культуры	Усиливающий агент	Биомасса (OD 600)	Выход в кг F-DVS на 100 л среды*
Old EMIL		32	5,56
New EMIL		45	8,33
Super EMIL	0,2% вес./вес. ИМФ 0,2% вес./вес. инозин	76	16,67
* закисляющая активность F-DVS составляет 4,8-5,1 по тесту Пирса

Заключение:

Из этих результатов ясно, что добавление усиливающего агента, состоящего из 0,2% вес./вес. ИМФ и 0,2% вес./вес. инозина, которые добавлены к культуральной среде перед началом аэробной ферментации, приводит к повышению выходов.

Пример 2: Аналитическая процедура QAm-043, закисляющая активность - «Программируемый температурный профиль» Chr. Hansen A/S (Дания).

ПРИМЕНИМОСТЬ

Этот способ использован для определения закисляющей активности в соответствии с тестом Пирса. Тест Пирса включен по стандарту IDF (международный стандарт молочной промышленности).

ПРИНЦИП

Закисление выполняли в соответствии с температурным профилем, отражающим изменения, которые обычно претерпевает культура при использовании в молочной промышленности для производства данного молочного продукта.

Для теста Пирса - это температура изготовления сыра при производстве чеддера.

pH измеряли в фиксированное время. Для культур, в которые не добавляли сычуг в ходе анализа, могли применять непрерывное измерение pH.

ПАРАМЕТРЫ АНАЛИЗА

Параметры анализа, которые зависят от продукта, даны в LIMS. Определение температурного профиля (для продуктов, где тест Пирса не используется).

Должны быть использованы контрольные стандарты.

Тип измерения pH.

Процент инокуляции на образец и контрольные стандарты.

Разведение молока: 206,9 г холодного (4°С) LAB-молока (т.е. UHT-стерилизованного восстановленного стерилизованного снятого молока (RSM), содержащего 9,5% (вес./вес.) твердого вещества и нагретого до 99°С в течение 30 минут).

Активность молока: 200 г холодного (4°С) низкопастеризованного цельного молока с жирностью 3,5%.

Сычуг: Naturen® standard 190, разбавленный 1:40 водой.

ПРИБОРЫ И РЕАГЕНТЫ

pH-метр/pH-метр для полунепрерывного измерения pH, модель Radiometer® PHM92. pH-электрод Radiometer® PFC2401.

Буферы: pH 7,00±0,01 и pH 4,01±0,01.

Водяная баня с термостатом, запрограммированным на нагревание в соответствии с предварительно определенным температурным профилем ±0,2°С.

Сенсор температуры.

Весы с точностью 0,01 г, минимум с двумя десятичными разрядами.

Часы.

Магнитная мешалка.

Магниты.

Бюксы, 50 мл.

Маленькие пластиковые чашки.

Ротационный аппарат.

ПРОЦЕДУРА

Подготовка анализа

Все бутылки должны быть из одной партии, т.е. с одной и той же датой.

Водяная баня (бани) доведены до исходной температуры используемого температурного профиля.

Бутылки для разбавления (= первое дозирование) и для активности (второе дозирование) содержали при 4°С непосредственно до использования.

Буферы pH 4,01 и pH 7,00 помещали в водяную баню при конкретной температуре измерения ±0,2°С, по меньшей мере, за 30 мин до калибровки pH-метра.

Приготовление образцов перед анализом.

Замороженные культуры:

Замороженные образцы/контрольные стандарты перед первым дозированием помещали в испарительную камеру с сухим льдом и содержали там до окончания всех дозирований.

Замороженные культуры, которые оттаиваются перед использованием:

В случае замороженных продуктов, когда используется вся упаковка, продукт оттаивают в соответствии с действующими инструкциями.

После оттаивания образец можно содержать при 4°С в течение максимум 30 минут перед использованием.

Замороженные-высушенные культуры:

Замороженные-высушенные образцы и контрольные стандарты акклиматизировали при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 15 мин перед началом анализа.

При условии, что образец намереваются использовать для повторного теста на следующий день, его можно хранить при +8°С.

Процедура инокуляции:

Дозирование продукта/контрольного стандарта выполняют непосредственно в молоке.

Фактическое количество инокулята (1-е дозирование) вводится с точностью в два десятичных разряда.

Замороженные и оттаянные продукты осторожно переворачивали около 4 раз, после чего бутылки ставили на приблизительно 50 сек.

Для замороженных-высушенных продуктов должен быть использован ротационный аппарат. Он должен двигаться с большой скоростью в течение 5 минут или до тех пор, пока продукт не растворится полностью. Это контролируется путем оставления бутылки на столе на небольшое время и затем проверки раствора путем осмотра дна бутылки.

Отметить:

Если для рабочих операций удобен холод, первое дозирование может оставаться при комнатной температуре максимум в течение 15 минут перед вторым дозированием.

2-е дозирование:

Бутылки разведения переворачивали перед проведением 2-го дозирования.

Фактическое количество инокулята (2-е дозирование) делается, по меньшей мере, с точностью в два десятичных разряда.

Бутылки «для активности» переворачивали и процедуру инокуляции повторяли для образцов/контрольных стандартов.

Бутылки «для активности», которые инокулируются из того же 1-го дозирования, инокулируются последовательно.

2 мл сычуга добавляли в каждую бутылку до или после 2-го дозирования. После этого бутылки переворачивали так, чтобы сычуг распределился.

Бутылки затем инкубировали одновременно, как описано в 6.

В завершение дважды инокулированные бутылки с молоком помещали в водяную баню; одну - для измерения температуры водяной бани и одну - для измерения pH упакованного молока.

ИНКУБАЦИЯ

Отметить: Если требуется больше водяных бань, контрольные стандарты должны инкубироваться в той же самой бане с соответствующими образцами.

Все бутылки для активности инкубировали одновременно в предварительно нагретой водяной бане при определенной по температурному профилю исходной температуре.

Температурный профиль запускается в то же самое время, когда бутылки помещают в водяную баню.

Затем температура инкубации контролируется термостатом, запрограммированным на последующий температурный профиль. Тест Пирса см. в Таблице 3.

Уровень воды в водяной бане должен быть минимум на 2 см выше, чем поверхность молока.

Таблица 3 Температурная программа для профиля Пирса (в соответствии с IDF)
Время, минуты	Температура, °С	Отклонение
0	31,0	±0,2°C
50	31,0	±0,2°C
54	31,7	±0,5°C
58	32,2	±0,5°C
62	32,8	±0,5°C
66	33,3	±0,5°C
70	33,9	±0,5°C
73	34,4	±0,5°C
76	35,0	±0,5°C
79	35,6	±0,5°C
82	36,1	±0,5°C
85	36,7	±0,5°C
87,5	37,2	±0,5°C
90	37,8	±0,2°C
360	37,8	±0,2°C

КАЛИБРОВКА pH ЭЛЕКТРОДА

Калибровку проводили при исходной температуре в соответствии с действующими инструкциями, касающимися калибровки электрода и его содержания.

ИЗМЕРЕНИЕ pH

После инкубации бутылки основательно встряхивали и измеряли pH.

Измерение pH выполняли в бутылке или в образце, который сливали в 50 мл лабораторный стакан с магнитным перемешиванием.

pH определяли, по меньшей мере, до 2 десятичных разрядов.

Вводили возможные замечания при измерении.

Процедуру измерения продолжали до тех пор, пока все образцы, контрольные стандарты и инокулированное молоко не будут измерены.

Наконец, измеряли и регистрировали pH буферов.

Непрерывное измерение pH

Значения pH снимали с момента начала температурного профиля. После завершения инкубации регистрировали измеренные значения pH в обоих буферах при исходной температуре.

Пример 3: Выход ферментаций Lactococcus lactis, выполненных при стандартных анаэробных условиях высокой OD

Чтобы проиллюстрировать эффект добавления соединений, содержащих дополнительный пурин, к уже обогащенным и оптимизированным средам, сравнивали два различных типа ферментации промышленного масштаба, один - с добавлением 0,3 % вес./вес. инозина, один - без добавления.

Культура:

Данный эксперимент выполняли с использованием коммерчески доступной культуры R 604, которая доступна на фирме Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Дания (каталожный № 200113).

Среда ферментации:

Культуры культивировали в среде, имеющей следующую композицию: гидролизат казеина (фирма Oxoid, Basingstoke, Великобритания, код продукта L41), 30 г/л; Primatone RL (фирма Quest, Naarden, Нидерланды, код продукта 5X59051), 30 г/л; соевый пептон (фирма Oxoid, Basingstoke, Великобритания, код продукта L44), 30 г/л; экстракт дрожжей (фирма Oxoid, Basingstoke, Великобритания, код продукта L21), 15 г/л; MgSО₄, 1,5 г/л; аскорбат Na, 3 г/л и лактозу 50 г/л.

Среду стерилизовали обработкой сверхвысокой температурой (UHT) (143°С в течение 8 сек). Полученная среда имела pH 6,5.

Условия ферментации культур:

Ферментацию проводили в 550 л промышленной ферментационной емкости без аэрации при 30°С с использованием 1% (вес./вес.) культуры, упомянутой выше как инокулят. В условиях высокой OD ферментация, в целом, является анаэробной. Культуре позволяли закисляться до pH 6,0. Затем pH поддерживали на уровне 6,0 контролируемым добавлением 13,4 N NH₄ОH.

Когда перестает обнаруживаться дальнейшее потребление основания, соответствующую культуру охлаждали до около 10°С.

После охлаждения бактерии в культуральной среде концентрировали 6-18 раз путем центрифугирования и последующего замораживания осадка в жидком азоте при давлении в одну атмосферу с получением так называемой замороженной культуры Direct Vat Set (F-DVS). Осадки F-DVS хранили при -50°С до дальнейшего анализа.

Выходы ферментаций определяли двумя различными путями:

1) по полученной биомассе, измеренной как оптическая плотность на 600 нм (OD₆₀₀), или

2) по кг культуры F-DVS на 100 л среды ферментации, в которой культура F-DVS имеет «закисляющую активность» 4,8-5,1 в соответствии с тестом Пирса, описанным в Примере 2: Аналитическая процедура QAm-043.

Результаты показаны в Таблице 4.

Таблица 4
Обозначение культуры	Дополнительная добавка к среде ферментации	Выход по OD600	Выход по Пирсу
PP11145	Нет	25,1	4,95
PP11146	0,3% вес./вес. инозина @	25,2	4,98
@инозин - это инозин (фирма Alsiano A/S, Birkeroed, Дания). §Смотри пример 2

Заключение:

Из этих результатов ясно, что добавление усиливающего агента, состоящего из 0,3% вес./вес. инозина, который добавляли к анаэробной культуральной среде перед началом ферментации, не приводило к повышению выходов.

Пример 4: Выход ферментации Streptococcus thermophilus, проведенной при стандартных анаэробных условиях при высокой OD

Этот эксперимент выполняли с целью исследовать эффект добавления соединений, содержащих дополнительный пурин, к уже обогащенным и оптимизированным средам при использовании для анаэробной ферментации в условиях высокой OD. В данном эксперименте приготавливали три культуры Streptococcus thermophilus , в одну добавляли 0,2% вес./вес. инозина, в другую добавляли 0,2% вес./вес. ИМФ, а в среду третьей культуры соединений, содержащих дополнительный пурин, не добавляли.

Культура:

Данный эксперимент выполняли с использованием коммерчески доступной культуры Streptococcus thermophilus CHQ-18, которая доступна на фирме Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Дания.

Среда ферментации:

Культуры культивировали в обогащенной среде, основанной на комплексных компонентах среды, экстракте дрожжей BioSpringer 207, порошке снятого молока Arla (Milex 240) и лактозе.

Среду стерилизовали обработкой UHT (143°С в течение 8 сек). Получившаяся среда имела pH 6,0.

Условия ферментации культур:

Ферментацию выполняли в 3 л перемешиваемой ферментационной емкости при 40°С с использованием 0,1% (вес./вес.) упомянутой выше в качестве инокулята культуры. pH поддерживали на уровне 6,0 путем добавления 13,4 N NH₄ОH. Анаэробные условия обеспечивали путем подачи азота в свободное пространство над продуктом (1,5 л/мин). Перемешивание проводили при 300 об/мин.

Выходы ферментаций определяли по полученной биомассе, измеренной по оптической плотности неконцентрированных образцов на 600 нм (OD₆₀₀), взятых в ходе ферментации.

Результаты трех ферментаций показаны на Фиг. 1.

Заключение: Из этих результатов вытекает, что добавление усиливающего агента, состоящего из либо 0,2% вес./вес. инозина, либо 0,2% вес./вес. ИМФ, не приводит к повышению выходов.

Пример 5: Использование химического анализа для обнаружения присутствия избытка нуклеосоединения при ферментации

Несмотря на то, что молочнокислые бактерии, в целом, являются прототрофными в отношении пуринов и пиримидинов и, таким образом, могут синтезировать эти соединения, клетки при ферментации утилизируют доступные источники экзогенного пурина и пиримидина. Конкретно, все обычные пуриновые нуклеосоединения могут быть полностью истощены уже при OD около 15 (см. Фиг. 2). Интересно, что накопление биомассы продолжается при OD около 45, несмотря на то, что пуриновое соединение истощено. Сходный результат получен для пиримидиновых соединений (данные не показаны). Это означает, что бульон ферментации (т.е. среда ферментации без клеток) в конце роста лишен пуриновых и пиримидиновых соединений.

Если, с другой стороны, например, к среде роста добавлен инозин в избытке, это соединение и/или соответствующее нуклеооснование гипоксантин (присутствующий вследствие гидролиза инозина), он будет присутствовать в ферментационном бульоне в конце роста (см. Фиг. 3). Такой избыток нуклеосоединения легко может быть обнаружен в ферментационном бульоне.

Для производства, например, F-DVS, клетки в среде ферментации концентрируют в несколько раз. Хотя клетки в F-DVS присутствуют в несколько раз большем количестве, чем в среде ферментации, существенные количества ферментационного бульона все еще присутствуют в F-DVS. Этот чистый бульон ферментации может быть получен путем дальнейшего центрифугирования клеток. Пригодными способами выделения бульона могут быть размораживание F-DVS, а затем использование фильтра или применение высоких ускорений при центрифугировании при производстве F-DVS.

При таких малых доступных количествах чистого бульона можно проверить, присутствуют ли какие-либо нуклеосоединения в среде ферментации и, таким образом, были ли такие соединения добавлены к среде ферментации в избытке. Таким способом обнаружения может быть общепринятая хроматография высокого разрешения (HPLC) (см., например, ), где обычные нуклеотидные основания и нуклеозиды (цитозин, цитидин, урацил, дезоксицитидин, гуанин, аденин , гипоксантин, уридин, ксантин, тимин, инозин, гуанозин, дезоксиинозин, дезоксигуанозин, ксантозин, тимидин, аденозин и дезоксиаденозин) могут быть легко обнаружены. Могут быть использованы и другие доступные способы для обнаружения соответствующих нуклеотидов. Присутствие любого из таких соединений в бульоне четко показывает, что ферментация была выполнена в соответствии с данным изобретением.

Пример 6: Использование протеомики для обнаружения присутствия избытка нуклеосоединений при ферментации

В ходе роста клеткам требуется непрерывный поток пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов для синтеза РНК и ДНК. Эти нуклеотиды могут быть получены или как экзогенные из среды (захватом) или синтезированы de novo из более простых соединений. Для синтеза de novo должны экспрессироваться специфические гены синтеза de novo. Напротив, гены не должны экспрессироваться, когда присутствует экзогенный источник.

В случае синтеза пурина de novo вовлекается около 10 генных продуктов. Ранее было обнаружено, что оперон purDEK, вовлеченный в пуриновый синтез de novo в L. lactis , регулируется приблизительно в 35 раз в зависимости от присутствия/отсутствия экзогенного источника пурина (Nilsson & Kilstrup 1998). Также, в присутствии/отсутствии нескольких белков синтеза пурина синтез de novo на двумерном белковом геле обнаруживается в зависимости от доступности экзогенных пуринов (Gitton et al. 2005).

Для установления специфического способа обнаружения присутствия/отсутствия экзогенных пуринов в среде авторы инокулировали L. lactis подвид lactis CHCC2862 в определенную среду SA с 1% глюкозы. Эта среда не содержит нуклеосоединений (Jensen & Hammer 1993). Культуру содержали при 30°С с 0,2% инозина и без него и инкубировали в течение ночи. Затем экспоненциально растущие клетки инокулировали в свежую среду при OD₆₀₀ около 0,1. При OD 0,8 (экспоненциальный рост) и в стационарной фазе клетки собирали и получали двумерный белковый гель.

В целом можно было обнаружить около 3-400 белковых пятен на геле при диапазоне pH 4-7. При OD 0,8 было менее чем 10 пятен в материале из культуры без инозина, и они отсутствовали (или были очень слабыми) из культуры с инозином. Тип набора этих пятен в присутствии/отсутствии экзогенного пурина показывает, что соответствующие белки присутствуют только, когда отсутствует экзогенный источник пуринов. Четыре из наиболее выраженных пятен, которые присутствуют только на геле, полученном из культуры без пуринов, подвергались перевариванию в геле и масс-спектрометрической идентификации. Белки были идентифицированы как: purH (бифункциональный белок биосинтеза пурина), purM (фосфорибозиламиноимидазолсинтаза), yphF (фосфорибозилформилглицинамидинсинтаза PurS) и fhs (формилтетрагидрофолат синтаза). Генные продукты трех генов purH, purM и yphF (purS) непосредственно вовлечены в пуриновый биосинтез de novo, тогда как fhs вовлечен в формирование одноуглеродных единиц, которые используются в синтезе пурина de novo. Для клеток, находящихся в стационарной фазе, которая сходна с ситуацией, обнаруженной в F-DVS, получен сходный тип набора пятен в отсутствие/присутствии пурина. В целом, это показывает, что присутствие избытка нуклеосоединения в среде может быть обнаружено с использованием протеомики.

При том, что данные примеры иллюстрируют обнаружение пуринов, усиливающих выход, сходное обнаружение присутствия избытка пиримидинов может быть проведено без затруднений. Таким образом, протеомика может быть использована для получения очень четких показаний того, что ферментация была выполнена в соответствии с данным изобретением.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Способы, описанные ниже, основываются на стандартных способах, опубликованных ранее (Fey at al. 1998; Vido et al. 2004; Gitton et al. 2005).

Приготовление бесклеточного экстракта. Клетки собирали центрифугированием и дважды отмывали в ледяном 10 мМ Tris-HCl, pH 7, 0,25 M сахарозы. Клетки переносили в 2 мл пробирки Eppendorf, содержащие приблизительно 1,0 г стеклянных шариков (0,25-0,50 мм), и встряхивали в мельнице типа миксера два раза по 6 мин. Затем экстракты центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 мин, и 250-300 мкл супернатанта переносили в новую пробирку Eppendorf. Супернатант центрифугировали еще один раз при 15 000 об/мин в течение 5 мин, и содержимое за исключением 10-20 мкл у дна пробирки переносили в еще одну новую пробирку Eppendorf. DTT (дитиотреитол) добавляли из 1 M маточного раствора до конечной концентрации 10 мМ, а лизат хранили замороженным при -20°С.

Двумерный гель-электрофорез (изоэлектрофокусирование и гель-электрофорез). Для каждого геля с помощью хлороформ/метанольной процедуры преципитировали между 75 и до 300 мкг белка и ресуспендировали в 190 мкл регидрирующего буфера (8 M мочевина, 50 мМ DTT, 4% CHAPS, 0,2% амфолитов-носителей). Первое измерение проводили на 11 см полосках IPG pH 4-7 и pH 4,7-5,9 фирмы Bio-Rad при активной регидрации в течение 12 часов, после чего следовали стандартной программе для 11 см полосок в ячейке изоэлектрофокусирования (IEF) Protean фирмы Bio-Rad. На полоски pH 3,9-5,1 белки загружали через воронку после того, как полоски регидрировались. После IEF электрофореза полоски либо хранили замороженными при -20°С или непосредственно готовили к электрофорезу во втором измерении.

Полоски уравновешивали в SDS-буфере перед электрофорезом в полиакриламидном геле (PAGE) второго измерения в течение 2×15 мин, первый раз в присутствии DTT, второй - в избытке IAA. После этого полоски прикрепляли к 10-20% и 12,5% полиакриламидным гелям (Criterion Tris-HCl фирмы Bio-Rad) агарозным клеем, и запускали второе измерение при 200 В на один час в Criterion Dodeca Cell. Гели окрашивали с помощью BioSafe Coomassie и сканировали на денситометре GS-800 фирмы Bio-Rad.

Идентификация белков. Идентичность белков в избранных пятнах определяли перевариванием в геле и анализом пептидного профиля, а также содержания аминокислот с помощью масс-спектрометрии. Полученные данные затем использовали для поиска в общедоступных базах данных белков со сходными свойствами (Alphalyse A/S, Оденсе, Дания).

ЛИТЕРАТУРА

Fey, S. J., A. Nawrocki, M. R. Larsen, A. Gorg, P. Roepstorff, G. N. Skews, R. Williams, and P. M. Larsen. 1997. Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae: a methodological outline. Electrophoresis 18:1361-1372.

Gitton, C, M. Meyrand, J. Wang, C. Caron, A. Trubuil, A. Guillot, and M. Y. Mistou. 2005. Proteomic signature of Lactococcus lactis NCD0763 cultivated in milk. Appl Environ Microbiol 71:7152-7163.

Jensen, P. R. and Hammer, K. 1993. Minimal requirements for exponential growth of Lactococcus lactis. Appl. and Env. Microbiol. 59:4363-4366.

Nilsson D. and Kilstrup M. 1998. Cloning and expression of the Lactococcus lactis purDEK genes, required for growth in milk. Appl Environ Microbiol. 64:4321-4327.

Vido, K., D. Le Bars, M. Y. Mistou, P. Anglade, A. Gruss, and P. Gaudu. 2004. Proteome analyses of heme-dependent respiration in Lactococcus lactis: involvement of the proteolytic system. J Bacteriol 186:1648-1657.