способ определения зараженности собак dirofilaria immitis

Формула изобретения

Способ определения зараженности собак Dirofilaria immitis, заключающийся в получении комплекса антигенов гельминта путем приготовления экстракта из выделенных от погибших собак самцов Dirofilaria immitis и взрослых самок Dirofilaria immitis с микрофилариями, доведения концентрации белка в экстракте до 15 г/л методом диализа и постановке реакции преципитации в агаровом геле между комплексом антигенов гельминта и исследуемой сывороткой животного.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано, в частности, для диагностики дирофиляриоза у собак.

В практической ветеринарии известно всего несколько лабораторных способов определения наличия филярий в организме животного. В частности, микроскопический метод, основанный на обнаружении микрофилярий в мазке крови, при этом дифференциальная диагностика между D.immitis и D.repens, а также личинок Dipetalonema reconditum, обнаруживаемых под кожей у собак, не представляется возможным. Более точная дифференциация возможна только при исследовании гистохимических мазков на кислотно-фосфатазную активность. (Г.М.Уркхарт, Дж Эрмур, Дж.Дункан и др. Ветеринарная паразитология. / Пер. с англ. Болдырева Е., Минаева С.М.: «АКВАРИУМ ЛТД», 2000, c.113).

Хотя проблема дирофиляриоза актуальна, прежде всего в странах и регионах с теплым и умеренным климатом, где имеет место большое количество комаров, являющихся промежуточными хозяевами, заболевание получило широкое распространение в последние десять лет и в районах с умеренными среднегодовыми температурами в связи с импортом собак (в нашей стране в настоящее время кроме территории юга России, фиксируются случаи заболевания в Москве и Московской области и других регионах). Эта проблема в Северной Америке в настоящее время настолько актуальна, что созданы специальные клиники для лечения сердечных гельминтозов.

Патогенетическое действие оказывают взрослые гельминты. У большинства собак с паразитированием в их организме небольшого количества особей явных признаков заболевания не проявляется (что резко повышает их эпидемическую опасность) и только при значительной инвазии отмечается нарушение функционирования кровеносной системы, в основном это хроническая застойная правосторонняя сердечная недостаточность. Кроме того, возможны эндокардит сердечных клапанов и пролиферативный легочный эндоартериит. К летальному исходу приводят также легочная эмболия, вызываемая мертвыми или погибающими гельминтами, и синдром полой вены, вызываемый теми же причинами.

Одним из факторов распространения данного заболевания следует считать длительный латентный период (до 5 лет), в течение которого в крови присутствуют циркулирующие микрофилярии. Этот процесс сочетается с повсеместным расселением комаров, являющихся промежуточными хозяевами, их способностью к быстрому увеличению популяции и короткий период развития в них микрофилярии до личинок третьей стадии. Контрольные мероприятия при этом заболевании трудноосуществимы, поэтому профилактика основывается преимущественно на лечении.

В тропических странах препараты назначаются в течение всего года, в странах с более умеренным климатом лечение начинается за месяц до сезона развития комаров и прекращается через 2 месяца после его окончания. Все этот требует значительных финансовых вложений, кроме того, не исключен риск неблагоприятной реакции организма собаки на погибающего паразита и применяемые химиотерапевтические средства.

Все вышеперечисленное делает раннюю и видоспецифическую диагностику дирофиляриоза весьма актуальной.

Близким по своим прогностическим параметрам к предлагаемому нами способу является группа иммунодиагностических тестов ELISA для определения антигенов взрослых гельминтов в сердце, которые позволяют идентифицировать большинство зрелых паразитов и обладают высокой специфичностью (Г.М.Уркхарт, Дж. Эрмур, Дж.Дункан и др. Ветеринарная паразитология. / Пер. с англ. Болдырева Е., Минаева С.М.: «АКВАРИУМ ЛТД», 2000, с.113).

Данный способ имеет следующие недостатки:

Способ не эффективен на ранних стадиях заболевания, когда паразитируют микрофилярии, а не взрослые особи. В то же время очевидно, что именно диагностика на ранних стадиях инвазии приводит в дальнейшем к наибольшему клиническому эффекту и профилактике эпидемической ситуации.

Способ достаточно дорогой (стоимость тест-систем), требует наличия соответствующего оборудования, которое в большинстве ветеринарных клиник отсутствует.

Целью представленного изобретения является увеличение чувствительности, точности, сокращение времени, необходимого для постановки диагноза дирофиляриоза собак при одновременной простоте и доступности предлагаемого способа для широкого применения.

Поставленная цель в изобретении достигается постановкой реакции преципитации в агаровом геле с использованием комплекса антигенов гельминтов.

Предложенный способ успешно апробирован на 100 образцах в практической работе кафедры молекулярной биологии, генетики и биохимии Астраханского государственного университета в течение 2006-2007 гг.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1

Приготовление комплекса антигенов гельминтов и проверка его специфичности включало несколько этапов. На первом этапе готовили экстракт из D.immitis (самцы, взрослые самки с микрофиляриями), выделенные от 50 погибших собак. Концентрацию белка в экстракте доводили до 15 г/л методом диализа. На втором этапе для проверки антигенной специфичности иммунизировали 5 кроликов полученным экстрактом по стандартной схеме для получения антисыворотки. Через 10 дней после окончания иммунизации из краевой вены уха проводили забор крови и отделяли сыворотку (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., перер. и доп. - М.: Медицина, 1982. - С.163-168). На следующем этапе методом двойной диффузии по Ухтерлони показано наличие четких преципитатов в агаре между сывороткой кролика и комплексом антигенов гельминтов, а также доказана специфичность данной реакции, так как отсутствуют перекрестные иммунологические реакции полученной нами сыворотки с экстрактами тканей внутренних органов и сывороткой крови собак (Ройт А. Основы иммунологии. Пер. с англ. - М.: Мир, 1991. - С.85-87).

Определяли инфицированность собаки D.immitis с помощью комплекса антигенов гельминтов.

Для этого осуществляли постановку реакции преципитации в агаровом геле комплекса антигенов гельминтов с сывороткой крови, взятой на вскрытии у восточноевропейской овчарки, из правых отделов сердца которой были выделены филярии. В этом примере нами установлено наличие преципитатов между реагентами, что говорит об инфицированности животного D.immitis (см. таблицу).

Пример 2

Проводили профилактическое обследование восточноевропейской овчарки из питомника способом, описанным в примере 1. Отсутствие преципитатов в агаре свидетельствует об отсутствии инфекции (см. таблицу).

Пример 3

Проводили профилактическое обследование сывороткой крови, взятой у кавказской овчарки из питомника. Наличие преципитатов между реагентами говорит об инфицированности животного D.Immitis (см. таблицу).

Воспроизводимость результатов определения зараженности собак D.immitis предлагаемым способом
Пример	Наличие положительной реакции при постановке реакции преципитации в агаровом геле	Интерпретация результатов
1	имеется	собака инфицирована D.immitis
2	отсутствует	собака не инфицирована
3	имеется	собака инфицирована D.immitis

Предлагаемым способом достигается положительный эффект:

увеличение чувствительности, точности сокращение времени, необходимого для постановки диагноза дирофиляриоза собак при одновременной простоте и доступности предлагаемого способа для широкого применения за счет использования комплекса антигенов гельминтов. Проведение этого исследования расширит возможности установления этиологии инфекционного процесса различной локализации.

Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической ветеринарии для определения инфицированности животных D.immitis.