способ получения иммуноглобулинового препарата

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата, предусматривающий последовательную обработку спиртового осадка Б (III фракции по Кону) десятикратным объемом 0,9%-ного раствора хлорида натрия, хлороформом в конечной концентрации 0,1-3,0%, центрифугирование, добавление к центрифугату при рН 6-8 сульфата меди, удаление осадка центрифугированием с последующим выделением целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений, его стабилизации, осветляющей и стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что сульфат меди используют в концентрации 0,003-0,03%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, выделяемых экстракцией из осадка Б (III фракции по Кону).

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения, включающий экстракцию спиртового осадка Б ((III фракции Кона) хлороформом в концентрации 10% в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия с последующим осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 12% (RU, патент 2084229 C1, A61K 35/14, 20.07.1997).

Основным недостатком этого изобретения является то, что длительная обработка хлороформом приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, их полимеризации и снижению титра антител в продукте.

Наиболее близким по своей сути к заявляемому является способ получения иммуноглобулинового препарата, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором ЭДТА в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией (RU, патент 2189833 С2, A61K 39/395, 35/16, 27.09.2002).

Основным недостатком прототипа является использование избыточных концентраций сульфата меди для осаждения липопротеидов и примесных белков, что приводит к снижению содержания выделяемых из осадка Б иммуноглобулинов, в частности фракции IgA.

В основу заявляемого изобретения положена задача повышения содержания выделяемой фракции иммуноглобулина А и соответствующее повышение качества продукта.

Задача решена тем, что в процессе последовательной обработки экстракта сульфат меди используют в концентрации 0,003-0,03%.

В результате проведенных исследований нами впервые показано, что использование сульфата меди даже в таких незначительных количествах, как в прототипе, приводит к потере фракции IgA с примесными белками. Поскольку ионов меди присутствует в растворе больше, чем требуется для удаления балластных примесных белков, они начинают взаимодействовать с иммуноглобулином А, связывают его и выводят в осадок. В результате происходит перераспределение фракций иммуноглобулинов и за счет потерь фракции IgA увеличивается содержание фракции IgM. Именно этим и объясняется повышенный выход фракции IgM в прототипе.

Согласно изобретению повышение содержания выделяемой фракции иммуноглобулина А и соответствующее повышение качества продукта обеспечивается тем, что в процессе последовательной обработки экстракта сульфат меди используют в концентрации 0,003-0,03%.

Заявляемый способ получения иммуноглобулинового препарата является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение содержания выделяемой фракции иммуноглобулина А и соответствующее повышение качества продукта.

Преимущества предлагаемого способа получения иммуноглобулинового препарата доказаны экспериментальными исследованиями. Содержание иммуноглобулинов определяли в реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии по методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. с соавт., 1984. Определение титра антител против сальмонелл и шигелл осуществляли методом РПГА согласно ФС 422-3347-97. Гравитационное осаждение примесей осуществляли в центрифугах MLW T24D. Ультафильтрацию - на установке с полыми волокнами или фильтрационной установке Millipore.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих повышение содержания выделяемой фракции иммуноглобулина А и соответствующее повышение качества продукта.

Пример 1. К осадку Б добавляли в соотношении 1:10 раствор хлорида натрия в концентрации 0,9% при постоянном перемешивании. После разведения к суспензии добавляли хлороформ до конечной концентрации 1,0% в суспензии, смесь перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали. Центрифугат титровали до рН 6,0-8,0 и при комнатной температуре добавляли к нему сульфат меди до конечной концентрации 0,015% в смеси. Осадок липопротеидов и примесных белков отделяли центрифугированием. Затем вводили ЭДТА до конечной концентрации в растворе 0,5% и концентрировали иммуноглобулиновую фракцию до содержания белка 6,0%. К концентрату добавляли стабилизаторы и подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации на мембранах Millipore с диаметром пор 0,8-0,45-0,22 нм. При необходимости препарат высушивали методом сублимационного или распылительного обезвоживания.

Концентрация белка в препарате составляла 6,1%. Содержание иммуноглобулинов: IgG - 56,0%, IgM - 22,0%, IgA - 22,0% (по прототипу: IgG - 56,0%, IgM - 27,0%, IgA - 17,0%). Титр антител к сальмонеллам и шигеллам - 1:1280 (по прототипу - 1:1280).

Пример 2. К осадку Б добавляли в соотношении 1:10 раствор хлорида натрия в концентрации 0,9% при постоянном перемешивании. После разведения к суспензии добавляли хлороформ до конечной концентрации 0,1% в суспензии, смесь перемешивали в течение 15 мин. Устанавливали рН суспензии 7,5, при комнатной температуре добавляли сульфат меди 0,03% при постоянном перемешивании в течение 10 мин и центрифугированием выделяли иммуноглобулиновую фракцию. Обрабатывали ее раствором ЭДТА с конечной концентрацией 1,0% в смеси, затем подвергали ультрафильтрации и концентрировали. Концентрат стабилизировали, осветляли, стерилизовали и, при необходимости, высушивали.

Концентрация белка в препарате составляла 6,5%. Содержание иммуноглобулинов: IgG - 58,2%, IgM - 20,5%, IgA - 21,3% (по прототипу: IgG - 55,0%, IgM - 28,0%, IgA - 17,0%). Титр антител к сальмонеллам и шигеллам - 1:1280 (по прототипу - 1:1280).

Пример 3. К осадку Б добавляли в соотношении 1:10 раствор хлорида натрия в концентрации 0,9% при постоянном перемешивании. После разведения к суспензии добавляли хлороформ до конечной концентрации 3,0% в суспензии, смесь перемешивали в течении 10-15 мин и центрифугировали. Центрифугат титровали до рН 6,5 и при комнатной температуре добавляли к нему сульфат меди до конечной концентрации 0,003% в смеси. Балластные примеси отделяли центрифугированием. Затем вводили ЭДТА до конечной концентрации в растворе 1%, подвергали ультрафильтрации и концентрированию. К концентрату добавляли стабилизаторы, подвергали осветлению и стерилизации и, при необходимости, высушивали.

Концентрация белка в препарате составляла 5,8%. Содержание иммуноглобулинов: IgG - 60,3%, IgM - 15,7%, IgA - 24,0% (по прототипу: IgG - 52,0%, IgM - 30,0%, IgA - 18,0%). Титр антител к сальмонеллам и шигеллам - 1:1280 (по прототипу - 1:1280).

Таким образом, предлагаемый способ, основанный на сочетании последовательного действия хлороформа в концентрации 0,1-3,0% и сульфата меди в концентрации 0,003-0,03%, позволяет повысить содержание выделяемых иммуноглобулинов А. Кроме того, повышается содержание иммуноглобулинов G. Все указанное приводит к повышению качества продукта при одинаковой производительности с прототипом.