способ ранней диагностики маститов у коров

Формула изобретения

Способ ранней диагностики маститов у коров, включающий отбор проб молока и их анализ, отличающийся тем, что молоко исследуется на содержание нитрозотиолов и нитрита и при содержании последнего свыше 10% от содержания нитрозотиолов диагностируют мастит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано при диагностике мастита у коров в лактационный период.

Для борьбы с маститом коров и минимизации ущерба, наносимого этим заболеванием, наибольший интерес представляют те методы диагностики, которые позволяют как можно раньше выявить начало заболевания до появления клинических признаков. Самыми чувствительными из применяющихся в настоящее время способов являются способы, основанные на контроле содержания в молоке соматических клеток, нуклеиновых кислот, АТФ [Kitchen, В.J. Dairy Res., 1981, 48, 167-188]. Но они требуют специальной подготовки образца и не всегда могут дать однозначный ответ: есть или нет воспаление, из-за большого фонового разброса показателей этих параметров у различных животных. Предложен способ, основанный на измерении количества продуктов окисления липидов, количество которых возрастает при воспалении из-за интенсификации этого процесса [патент РФ № 2182461]. Он может служить аналогом предлагаемому способу. Но этому способу [патент РФ № 2182461] присущи те же недостатки, что и вышеназванным.

Задачей изобретения является разработка способа ранней диагностики мастита, позволяющего определить начало воспаления до проявления клинических признаков, дающего однозначный ответ вне зависимости от особенностей конкретного животного и позволяющего проводить определение быстро, без предварительной подготовки образца. Предлагаемый способ основан на регистрации в молоке соединения, сопутствующего воспалению - нитрита, продуцируемого в молоке иммунокомпетентными клетками, а также образующегося в результате распада нитрозотиолов под воздействием активных форм кислорода [Trujillo M., Noel Alvarez M., Peluffo G., Freeman В., Radi R. J Biol Chem, 1998, 273, 7828-7834]. Нами установлено, что молоко здоровых коров содержит его в следовых количествах (до 0,1 мкМ). В связи с этим сам факт появления в молоке коровы нитрита можно рассматривать как признак начала воспаления вне зависимости от возраста животного и стадии лактации.

Пример конкретного выполнения

Работа проведена на поголовье (70 дойных коров холмогорской породы) в учебном хозяйстве Всероссийского Аграрного Колледжа Заочного Образования (ВАКЗО), г.Сергиев Посад Московской области.

Пробы молока (10-15 мл) отбирались из каждого сегмента вымени коровы в химически чистую стеклянную посуду. Анализ производился не позднее 1 часа после отбора. В случае невозможности провести анализ в указанное время образцы помещались в бытовой холодильник (+6°С).

В пробах определялось содержание нитрита (NO₂ ^-) и нитрозотиолов (RSNO). Сам метод определения в биологических объектах этих соединений подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2003) Биохимия, 68, 769-776; Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2005) Биохимия, 70, 575-587; Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. (2008) Биохимия, 73, 113-118]. Метод основан на способности нитрозосоединений (нитрита, RSNO, нитрозильных комплексов железа (НКЖ)) ингибировать фермент каталазу в присутствии галоид-анионов. RSNO, в отличие от нитрита, трансформируются в НКЖ в присутствии закисного железа и тиолов. НКЖ, в свою очередь, теряют способность ингибировать фермент в присутствии разрушающего их хелатора железа (в нашем случае - о-фенантролин) и ловушки высвобождающейся NO (в нашем случае - оксигемоглобин). Метод имеет предел чувствительности 50 нМ.

НЕОБХОДИМЫЕ РЕАКТИВЫ

40 мМ р-р КН₂РO₄ (или NaH₂PO₄);

1,5 М маточный раствор NaCl;

25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;

Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;

Перекись водорода (3% р-р).

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА 1.

Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей фосфатный буфер 40 мМ, pH 6,0, NaCl 150 мМ и осмотически гемолизированные эритроциты коровы (100 мкМ гемгрупп гемоглобина), содержащие эндогенную каталазу. Это - контрольный образец.

2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита, строится калибровочная кривая - зависимость активности фермента от концентрации нитрита.

3. Исследуемая проба молока (500 мкл) добавляется в основную среду (см п.1). Определяются активность каталазы в ее присутствии и суммарное содержание (NO ₂ ^-+RSNO) согласно калибровке.

4. Также проводится дополнительный контроль: измерение активности каталазы в присутствии образца и в отсутствии NaCl. В отсутствии прочих ингибиторов каталазы (не содержащих нитрозогруппу) она должна быть аналогична контролю.

5. В среду, содержащую исследуемый образец (п.3), последовательно, с 1 минутными интервалами, добавляются 25 мкМ FeSO₄, 100 мкМ глутатиона и 300 мкМ о-фенантролина. Еще через 1 минуту проводится определение активности каталазы. Содержание RSNO и NO₂ ^- определяют по разнице степени ингибирования фермента в п.3 и в п.5 согласно калибровке. Оставшийся в п.5 ингибирующий эффект принадлежит нитриту. Его содержание также определяют согласно калибровке.

Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ. Предпочтительнее видится разработанный нами ранее калориметрический метод, основанный на контроле кинетики теплопродукции, сопровождающей разложение перекиси [Titov, V.; Petrenko, Yu., Biochemistry (Moscow), 2003, 68, 627-633]. Этот метод не связан с фотометрией, а потому не чувствителен к исходной окрашенности и мутности образца.

Количественное определение состава метаболитов NO в настоящее время является актуальной проблемой, поскольку эти соединения модифицируются при очистке образца и подготовке его к измерению. Так, предварительная очистка молока от липопротеидов привносит значительные изменения в содержание нитрита. Также классический метод определения нитрита по Гриссу может в той или иной мере реагировать и на нитрозотиолы, и на НКЖ, поскольку в требующейся для этого метода кислой среде эти соединения разрушаются с образованием нитрита [Titov, V.; Vanin, A.; Serezhenkov, V.; Petrenko, Yu., Probl. Ecol. Secur. Agric., 2003, d, 50-65]. В связи с этим ферментный (каталазный) тест, не требующий какой-либо модификации исследуемых соединений, видится предпочтительнее.

Согласно нашим данным молоко здоровых коров не содержит нитрит в детектируемом количестве. Эта закономерность наблюдалась на более чем 100 образцах коровьего молока как сборного, так и взятого от отдельных коров различных пород. Однако в случае клинически выраженного мастита наблюдалась противоположная картина. Как видно из таблицы, при воспалительном процессе происходит снижение содержание в молоке нитрозотиолов и появление нитрита. В молоке, взятом из долек вымени с клиническими признаками мастита, нитрозотиолы не фиксировались, но присутствовал нитрит. Причем вначале имели место убыль нитрозотиолов и увеличение концентрации нитрита без изменения их суммарной концентрации. При явных клинических проявлениях мастита содержание нитрита могло значительно превышать изначальную концентрацию нитрозотиолов (таблица, коровы 2, 3), поскольку иммунокомпетентные клетки также продуцируют окись азота, окисляющуюся до нитрита. По мере выздоровления коровы содержание нитрита уменьшалось и появлялся нитрозотиол.

Но главное, нитрит обнаруживался до появления клинических признаков и исчезал уже после их исчезновения вследствие лечения (таблица, коровы 1,2, 4). В норме, как сообщалось выше, нитрит не обнаруживался в молоке в детектируемых количествах (0,1 мкМ).

Примечания:

1/ ЛП и ПП, ЛЗ и П3 - соответственно, левая и правая передние, левая и правая задние доли вымени.

2/ Жирным шрифтом выделены образцы, содержащие нитрит.

Исходя из представленных в таблице данных и учитывая, что величина относительной погрешности измерения находится в пределах 5%, содержание в молоке нитрита свыше 10% от содержания нитрозотиолов можно считать достоверным признаком наличия воспалительного процесса в молочной железе.