доставка гетероциклических антибиотиков к раковым клеткам с помощью нанонуклеотидных фармакосом

Формула изобретения

Способ эффективной доставки к опухолевым клеткам гетероциклического антибиотика с помощью малых частиц, содержащих кофеин, отличающийся тем, что способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина в соотношениях близких к эквимолярным, и последующее быстрое впрыскивание полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего хлорид натрия, с образованием одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - с очень малыми размерами, от 1 до 100 нм, обеспечивающими защиту антибиотика от сорбции на стенках кровеносных капилляров и при этом увеличивающими его проникновение в опухолевые клетки и их ядерную ДНК.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к нанобиотехнологиям для медицины, а именно к способам приготовления биологических наноструктур, способных доставлять лекарственные вещества к опухолевым клеткам с целью проведения успешной противораковой терапии, например при лечении сарком, лимфом и меланом.

Способ направлен на обеспечение эффективной доставки к раковым клеткам гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, находящихся в составе фармакосом, носителями в которых являются нуклеотидные наноструктуры - одноцепочечные олигонуклеотиды и кластеры пуринов. Способ реализуется за счет использования защиты гетероциклических антибиотиков от сорбции на стенках сосудов и капилляров одноцепочечными олигонуклеотидами, в частности шпилечными олигонуклеотидами длиной 10-100 оснований, внутрь которых встраивается антибиотик, и за счет лучшего проникновения антибиотика внутрь делящейся клетки в составе фармакосомы, содержащей для этого также кластеры пуринов, в частности кофеина и аденина. Способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов гетероциклического антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пуринов в соотношениях, близких к эквимолярным, последующее быстрое впрыскивание малого объема полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего для поддержания ионной силы хлорид натрия, в результате чего происходит образование одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - размерами от 1 до 100 нанометров, которые способны, легко проходя по кровеносным капиллярам, доставлять антибиотик к ДНК делящихся опухолевых клеток, успешно проникая через их плазматическую и ядерную мембраны. Использование данного способа позволяет во много раз снизить концентрацию антибиотика, что обуславливает возможность устранить его токсическое неспецифическое действие на организм, но при этом позволяет резко увеличить его проникновение в опухолевые клетки, что дает возможность проводить их эффективную элиминацию.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к биомедицинским нанотехнологиям, прежде всего - к способам доставки гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, к ДНК делящихся раковых клеток.

Способ заключается в эффективной доставке к опухолевым клеткам гетероциклического антибиотика с помощью малых частиц, содержащих кофеин, отличающийся тем, что способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина в соотношениях, близких к эквимолярным, и последующее быстрое впрыскивание полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего хлорид натрия, с образованием одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - с очень малыми размерами, от 1 до 100 нанометров, обеспечивающими защиту антибиотика от сорбции на стенках кровеносных капилляров и при этом увеличивающими его проникновение в опухолевые клетки и их ядерную ДНК.

В настоящее время практически нет мощных антибиотиков, не вызывающих при своем применении сопутствующих токсических последствий в организме. Чтобы снизить эти последствия и чтобы увеличить эффективность доставки антибиотиков в делящиеся раковые клетки, необходимо заключить антибиотик в некоторую защитную оболочку, препятствующую его сорбции на стенки кровеносных сосудов и капилляров, но увеличивающую его проникновение в опухолевые клетки к их ядерной ДНК, чтобы заблокировать там работу РНК-полимеразы. Для доставки гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, к ДНК раковых клеток заявляемый способ предполагает использование фармакосом - наночастиц диаметром 1-100 нанометров, состоящих из антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пуринового кластера.

Актиномицины являются одними из самых эффективных противоопухолевых лекарств (Егоров Н.С. и др. Антибиотики-полипептиды. М.: МГУ, 1987; Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики. М.: Медицина, 1987). Особенно широко они используются при химиотерапии сарком, лимфом и меланом (Clementz G.L., Dailey J.W. // Am. Fam. Physician. 1988. V.37. P.167; Traganos F. et al. // Cancer Res. 1991. V.51. P.3682. Farber S.J. // J. Am. Med. Assoc. 1996. V.198. P.826). Типичный их представитель актиномицин Д (АМД) состоит из феноксазонового хромофора и двух пептидо-лактонных колец. Биологическая активность АМД обусловлена его встраиванием в ДНК, ведущим к ингибированию РНК-полимеразной реакции, синтеза белка и клеточного деления (Rill R.L., Hecker K.H. // Biochemistry. 1996. V.35. P.3525. Jeeninga R.E. el al. // Nucleic Acids Research. 1998. V.26. № 23. P.5472).

В отличие от кристаллов и сухих пленок ДНК, где актиномицины интеркалируют по стэкинговому типу в двойную спираль, в растворах ДНК они, как оказалось, с наибольшим сродством встраиваются в расплетенные участки, причем без стэкинга (Vekshin N. et al. // J. Phys. Chem.: B. 2001. V.105. P.8461. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Мол. биол. 2002. Т.36. № 4. С.725. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Прикл. биох. и микробиол. 2004. Т.40. № 4. С.421).

Известно, что АМД проявляет цитотоксичность к раковым клеткам при очень низких концентрациях и его клиническое использование лимитируется побочными токсическими эффектами, например, в отношении сердечной мышцы (Takusagawa F. et al. // Bioorg. Med. Chem. 2001. V.9. P.719). Побочное токсическое действие АМД связывают с его действием на мембраны через образование опасного супероксида. Большая неспецифическая токсичность актиномицинов и плохое проникновение в клетки значительно ограничивают их применение.

Недавно на примере 7-амино-актиномицина D (7ААМД - флуоресцирующий аналог АМД, который можно детектировать в микромолярных концентрациях) было показано, что использование специальных переносчиков вроде синтетических шпилечных олигонуклеотидов позволяет снизить нежелательно высокую концентрацию антибиотика, но при этом - усилить действие в отношении раковых клеток (Векшин Н.Л., Савинцев И.В. // Биофизика, 2008. Т.53, в печати).

Шпилечные олигонуклеотиды, внутри которых связывается антибиотик, способны облегчать его транспорт через плазматическую мембрану внутрь раковых клеток. В пользу этого свидетельствует обнаруженный недавно факт резкого усиления проникновения АМД из комплекса с олигонуклеотидной шпилькой d(5 -AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3 ), называемой НР1, внутрь клеток асцитной карциномы Эрлиха по сравнению со свободным АМД (Векшин Н.Л., Савинцев И.В. // Биофизика, 2008. Т.53, в печати). Причем АМД проникает при этом в ядро и окрашивает там ДНК. Как было показано в модельных опытах (Vekshin N.L., Kovalev A.E. // J. Biochem. 2006. V.140. P.185), олигонуклеотидные шпильки не препятствуют перераспределению антибиотика к ДНК.

Время формирования комплекса между 7ААМД (или АМД) и шпилькой НР1 при 26°С составляет всего 0,29 с (детектировалось на «stopped-flow» флуориметре). АМД и 7ААМД конкурируют за место связывания внутри НР1: добавление избытка АМД приводит к мгновенному падению флуоресценции комплекса 7ААМД/НР1. Молекула 7ААМД способна за 0,31 с замениться в шпильке на АМД. Сходная, но гораздо менее выраженная, конкуренция между 7ААМД и АМД наблюдается при их связывании с ДНК. В отличие от НР1, где есть лишь одно место связывания, в ДНК имеется много таких мест (см. таблицу).

Хромофоры 7ААМД и АМД локализуются в ДНК (и в шпильке НР1) в малополярном окружении, сходном по физико-химическим свойствам с таким растворителем, как пиридин (Vekshin N., et al. // J. Phys. Chem.: B.2001. V.105. P.8461). Встраивание актиномицинов происходит не на поверхности, а в динамической "полости" между двумя цепочками нуклеотидов, но без стэкинга с ними (Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Прикл. биох. и микроб., 2004, т.40, № 4, с.421). Именно поэтому актиномицины не являются канцерогенами (в отличие от этидиум бромида, интеркалирующего между основаниями ДНК по стэкинговому типу), а служат противоопухолевыми препаратами.

Кинетика встраивания 7ААМД или АМД в ДНК имеет бифазный характер: 4,6 с и 40 с. Быстрая компонента имеет втрое большую амплитуду. Она соответствует связыванию 7ААМД внутри «разрыхленных» мест или петель, а медленная - встраиванию в двойную спираль. Длительность первой компоненты в случае ДНК во много раз больше, чем в случае НР1, т.к. расплетенные участки и петли ДНК имеют жесткую структуру, а шпилька НP1 - гибкая, "рыхлая", со свободными концами.

В работе (Vekshin N.L., Kovalev A.E. // J. Biochem. 2006. V.140. P.185) обнаружено «переползание» 7ААМД с синтетической шпильки НР1 на ДНК. Поскольку флуоресценция 7ААМД возрастает при связывании с НР1 гораздо сильнее, чем с ДНК (Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Мол. биол. 2002. Т.36. С.725), то это позволяет наблюдать перераспределение 7ААМД из комплекса с НР1 на ДНК после добавления избытка ДНК (фиг.1). "Переползание" состоит из быстрой фазы - 4,5 с и медленной - 101 с. Две компоненты соответствуют двум типам участков ДНК. Первый - это петли и расплетения, а второй - двойная спираль. Увеличение ионной силы приводит к уменьшению амплитуды быстрой компоненты, т.к. при высокой ионной силе ДНК имеет менее "рыхлую" структуру.

Другим переносчиком гетероциклических антибиотиков могут служить кластеры пуринов: аденина и кофеина (1,3,7-триметилксантина). Такие кластеры спонтанно возникают в водных растворах при миллимолярных концентрациях (Origlia-Luster M.L. et. al. // J. Chem. Thermodynamics. 2002. V.34. P.1909). Особенно устойчивы и малы по размеру кластеры кофеина.

Кофеин и его кластеры образуют стабильные нанокомплексы со многими гетероароматическими молекулами (Davies D.B. et al. // Eur. Biophys. J. 2001. V.30. P.354. Веселков Д.А. и др. // Биофизика. 2000. Т.45. № 2. С.197). С помощью ЯМР (Веселков Д.А. и др. // Биофизика. 2000. Т.45. № 2. С.197) было проведено изучение гетероассоциации АМД с кофеином при миллимолярных концентрациях и найдены константы связывания и другие термодинамические параметры. Однако при миллимолярных концентрациях АМД сильно димеризован и агрегирован (Веселков А.Н. и др. // Биофизика. 2005. Т.50. № 1. С.20; Ковалев А.Э., Яковенко А.А., Векшин Н.Л. // Биофизика. 2004. Т.49. № 6. С.1030), что может снижать его взаимодействие с кофеиновыми кластерами. Кроме того, в случае применения АМД для терапии в миллимолярных концентрациях он даст большие токсические последствия, т.е такие концентрации не физиологичны.

Кофеин обладает множественными эффектами на клеточном уровне. Он относится к классу мягких психомоторных стимуляторов. Отмечалось (Davies D.B. et al. // Eur. Biophys. J. 2001. V.30. P.354), что кофеин уменьшает канцерогенное действие бромистого этидия, вероятно, за счет образования между ними прочного комплекса.

Безопасная разовая доза кофеина может достигать 100 мг. Кофеин хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте и долго удерживается в крови, а актиномицины нет (Досон Р. и др. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, с.210,270). Следует ожидать усиления лечебного действия АМД в присутствии кофеина.

Ранее предполагалось (Веселков А.Н. и др. // Биофизика. 2005. Т.50. № 1. С.20. Шестопалова А.В. // Биофизика. 2006. Т.51. № 3. С.389), что кофеин будет снижать действие антиопухолевых препаратов, уменьшая их эффективную концентрацию в крови. Однако при этом кофеин будет препятствовать «размазыванию» лекарства по стенкам кровеносных сосудов и капилляров. Кроме того, во многих случаях важна не столько концентрация лекарственного вещества в крови как таковая, сколько его способность проникать к молекулярно-биологическим «мишеням» в раковых клетках. Кофеин легко проникает в клетки, а АМД плохо. Действие актиномицинов в нанокомплексах с кофеином на опухолевые клетки является поэтому более сильным, чем актиномицинов отдельно.

Кофеин хорошо растворяется в воде и спирте; он обладает выраженными амфифильными свойствами. При концентрации порядка 1 мМ в воде он спонтанно формирует небольшие упорядоченные агрегаты - кластеры. Это сопровождается гипохромизмом - снижением коэффициента экстинкции ( ). В максимуме при 273 нм кофеина составляет 9740 М^-1 см^-1 . При полной кластеризации кофеина (>2 мМ) уменьшается на 27% и не изменяется при дальнейшем увеличении концентрации до 8 мМ. Зависимость коэффициента экстинкции кофеина (при 273 нм) от его концентрации показана на фиг.2.

При формировании кофеиновых кластеров раствор остается абсолютно прозрачным, светорассеяние отсутствует. Возникновение гипохромизма в кластерах кофеина не сопровождается появлением дополнительных полос поглощения. Это означает, что нет заметного перераспределения электронной плотности, т.е. взаимодействия между молекулами кофеина в кластере невелики. Такой гипохромизм может быть описан в рамках экранировочной модели (Vekshin N.L. // J. Biol. Physics. 1999. V.25. P.339), предусматривающей конкуренцию за фотон между хромофорами в пределах стопкообразного кластера, охватываемого одной световой волной. В каждом кофеиновом кластере число молекул, вычисленное по экранировочной модели, составляет в среднем не меньше 8, но не превышает 12 (Битехтина М.А., Векшин Н.Л. // Биоорг. химия. 2008, т.34, № 2, с.1-6). Эти цифры хорошо согласуются с объемом среднего кофеинового кластера ~250 ³, измеренного другими авторами (Origlia-Luster M.L. et al. // J. Chem. Thermodynamics. 2002. V.34. P.1909) денситометрическим методом.

Флуоресценция растворенного 7ААМД в воде частично затушена. При добавлении к 7ААМД кофеиновых кластеров наблюдается увеличение интенсивности его флуоресценции, что свидетельствует о переходе антибиотика из полярной водной фазы в менее полярную - на поверхность кофеиновых кластеров. Константа связывания 7ААМД с кластерами кофеин достигает 10⁶ М^-1 (получено путем концентрационного титрования). При связывании возникает заметный длинноволновый сдвиг спектра возбуждения (фиг.3), что говорит о перераспределении электронной плотности в антибиотике, о существенной энергии его взаимодействия с кофеином.

Интересно, однако, что сдвига спектра излучения не возникает (фиг.4): 7ААМД в присутствии кластеров кофеина излучает практически из микроокружения той же полярности, как в их отсутствие. Это однозначно говорит именно о поверхностном связывании антибиотика.

Феноксазоновый хромофор 7ААМД, сильно взаимодействующий с поверхностью кофеинового кластера, контактирует с водой. При фотовозбуждении дипольный момент 7ААМД резко возрастает, а также происходит релаксационный «разогрев» микроокружения (за счет разницы энергий поглощенного и излученного квантов), в результате чего 7ААМД десорбируется с поверхности кластера в водную фазу, откуда и излучает квант света. Именно поэтому степень поляризации флуоресценции 1 мкМ 7ААМД в присутствии кластеров 8 мМ кофеина составляет (при возбуждении 560 нм) почти столько же, сколько свободного 7ААМД в воде - 0,28 и 0,29 соответственно. Об этом же говорит то, что время жизни возбужденного состояния в обоих случаях составляет около 1 нс (Битехтина М.А., Векшин Н.Л., // Биоорг. химия. 2008, т.34, № 2, с.1-6).

Одним из наиболее подробных флуоресцентных исследований взаимодействия 7ААМД с ДНК является работа (Wadkins R., Jovin T. // Biochemistry. 1991. V.30. P.9469), в которой было показано, что при связывании 7ААМД с ДНК его время жизни возрастает примерно вдвое, а спектр излучения сдвигается в коротковолновую область. При комплексообразовании 7ААМД с ДНК наблюдается многократное увеличение квантового выхода излучения, так как феноксазоновый хромофор антибиотика в гидрофобном окружении нуклеотидов ДНК подвергается гораздо меньшему тушению, чем в водной фазе. При этом спектр возбуждения 7ААМД претерпевает сильный длинноволновый сдвиг (до 570 нм), в то время как спектр излучения претерпевает коротковолновый сдвиг (до 630 нм). Именно поэтому при добавлении к раствору комплексов 7ААМД с кофеиновыми кластерами аликвот раствора ДНК возникает дополнительный длинноволновый сдвиг спектра возбуждения (фиг.3) и увеличивается интенсивность флуоресценции, причем, спектр излучения сдвигается в коротковолновую область (фиг.4). Это отражает перераспределение антибиотика с поверхности кофеиновых кластеров в гидрофобные области внутри ДНК. Конечная интенсивность флуоресценции 7ААМД в присутствии 200 мкМ нуклеотидов ДНК в буфере без кофеина лишь на 20% выше, чем в присутствии кофеиновых кластеров (фиг.5).

Это говорит о том, что кофеин мало препятствует формированию комплексов антибиотика с ДНК и может служить эффективным переносчиком антибиотика к ДНК. Причем перераспределение антибиотика к ДНК в ходе диссоциации комплексов АМД/кофеин обусловлено как большей прочностью комплексов АМД/ДНК, так и наличием в ДНК гораздо большего количества мест связывания (Битехтина М.А., Векшин Н.Л. // Биоорг. химия. 2008, т.34, № 2, с.1-6).

Все вышеперечисленные опыты позволили заключить, что актиномицины смогут хорошо проникать к ядерной ДНК опухолевых клеток, предварительно связавшись со шпилечными олигонуклеотидами и пуринами, например с кофеином.

С помощью люминесцентной микроскопии были исследованы места локализации антибиотика в клеточных структурах после инкубации клеток асцитной карциномы Эрлиха со свободным актиномицином и его комплексом со шпилечным олигонуклеотидом НР1 (Векшин Н.Л., Савинцев И.В. // Биофизика, 2008. Т.53, в печати). Комплекс АМД/НР1 или 7ААМД/НР1 в мольном соотношении 1:1 (в водном растворе) добавлялся при перемешивании в клеточную среду до конечной концентрации 10 мкМ. Клетки инкубировались в такой среде в течение суток при 37°С. Смертность клеток определялась на микроскопе "ЛЮМАМ" в проходящем свете при окрашивании трепановым синим (10 мкМ). Прокрашивание антибиотиком ядерных структур клеток и анализ локализации 7ААМД в клетках проводили на "ЛЮМАМ" при 900-кратном увеличении; флуоресценция 7ААМД регистрировалась в диапазоне 600-700 нм.

Было показано, что свободный 7ААМД и свободный АМД аккумулируются в плазматической мембране клеток. В случае же применения комплекса 7ААМД/НР1 или АМД/НР1 наблюдается также окрашивание ядер. Это означает, что нанокомплекс легко проникает и через плазматическую, и через ядерную мембраны опухолевых клеток. Добавка свободных молекул АМД или 7ААМД в питательную среду вызывала лишь небольшое увеличение гибели клеток карциномы по сравнению с контролем (без АМД или 7ААМД). Это связано с тем, что актиномицины плохо проникают внутрь клеток. При инкубации в присутствии комплекса АМД/НР1 гибель клеток возрастала в несколько раз. При этом цитотоксичность самого НР1 в отношении карциномы была низка и сравнима с цитотоксичностью свободного АМД, не превышая 6%. Шпилька НР1 существенно потенцировала действие АМД. Это можно объяснить не только способностью НР1 переносить актиномицины к ДНК, но также высокой плотностью упаковки олигонуклеотида в комплексе с антибиотиком, что создает условия для эффективного переноса через мембраны (фиг.6).

При введении нанокомплексов (состоящих из АМД, НР1 и кофеина) мышкам с саркомой продолжительность жизни животных увеличивалась с 10-12 дней до 20-25 дней, в то время как введение антибиотика отдельно увеличивало срок жизни всего на 1-2 дня, а введение шпильки или кофеина вообще не влияло.

Таким образом, фармакосомные наноструктуры, в которых носителями являются шпилечные олигонуклеотиды и пурины, могут служить эффективными переносчиками («доставщиками») гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, к ядерной ДНК опухолевых клеток и вызывать гибель этих клеток.

В отношении доставки антибиотиков в опухолевые клетки с помощью различных молекулярных носителей (полипептидов, антител, нуклеиновых кислот, синтетических полимеров, фосфолипидных липосом, поверхностно-активных веществ и др.) известны, например, такие авторские свидетельства и патенты:

№ 2005100840/04 от 2003.06.16. ФТОРСИЛОКСАНОВЫЕ МАТРИКСНЫЕ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ С РЕГУЛИРУЕМОЙ ДИФФУЗИЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ. САЛАМОН Джозеф С. и др. (US). Изобретение относится к сополимерам, используемым при изготовлении матриксных систем доставки лекарств с регулируемой диффузией, содержащая силоксановый сополимер, содержащий фторированную боковую цепь, полученный сополимеризацией фторсилоксанового мономера , и одного или более сополимеризуемых мономеров

№ 2004116475 от 2002.11.01. АНТИТЕЛО, СЕЛЕКТИВНОЕ В ОТНОШЕНИИ РЕЦЕПТОРА ЛИГАНДА, ИНДУЦИРУЮЩЕГО АПОПТОЗ И СВЯЗАННОГО С ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ. Ю ЭЙ БИ РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН (US) ЧЖОУ Тун (US). Очищенное антитело, которое специфично связывается с TRAIL-рецептором DR4, где указанное антитело в растворимой форме обладает апоптоз-индуцирующей активностью Терапевтическое средство выбирают из группы, включающей блеомицин даунорубицин, актиномицин Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту и регуляторный элемент, оперативно связанный с указанной нуклеиновой кислотой Очищенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность иммуноглобулиновой тяжелой цепи антитела, способного связывать TRAIL-рецептор DR4 и способного вызывать апоптоз клетки

№ 2004120785 от 2002.12.03. КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОИЗВОДНОЕ АРИЛМОЧЕВИНЫ В КОМБИНАЦИИ С ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ИЛИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ АГЕНТОМ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК. Байер Фамэсьютиклс Копэрейшн (US). ВИНСЕНТ Патрик У. (US) и др. Композиция, содержащая N-(4-хлор-3-(трифторметил)фенил-N -(4-(2-(N-метилкарбамоил)-4-пиридилокси)фенил)мочевину, которая является ингибитором киназы raf, и цитотоксический агент или цитостатический агент, или фармацевтически приемлемую соль цитотоксического агента, или фармацевтически приемлемую соль цитостатического агента Композиция по любому из пп.1-3, в которой цитотоксическим агентом является иринотекан, актиномицин D

№ 98101364 от 1998.01.29. ПРИМЕНЕНИЕ АЛКАЛОИДОВ КОАССА ЛАМЕЛЛАРИНА В СПОСОБАХ ЛЕЧЕНИЯ. Форма Map, C.A. (ES). Хосе Луис Фернандес Нуэнтес (ES) и др. Способ лечения опухолей, устойчивых к действию большого количества лекарств у млекопитающих, включающий введение пациенту эффективного МЛР-ингибирующего количества анти-МЛР производного ламелларина Фармацевтическая композиция, где противоопухолевое лекарственное средство, вызывающее МЛР, выбрано из группы включающей винбластин, доксарубицин и актиномицин D.

№ 96107922/14 от 1996.04.29. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА. Гусев C.A. и др. Способ получения препарата для направленной доставки лекарственного средства, включающий обработку сыворотки крови человека и совмещение протеина с лекарственным средством, отличающийся тем, что сыворотку крови человека обрабатывают гепарином и хлоридом металла, выбранным из хлорида кальция и хлорида марганца, с выделением липопротеина в виде водного раствора концентрацией (10) мг/мл, для совмещения с липопротеином используют лекарственное средство, выбранное из группы, включающей антибиотик, витамин, противоопухолевое средство и гормон, совмещение липопротеина с указанным лекарственным средством осуществляют при их массовом соотношении 2-50:1 в течение 6-18 ч добавляют к препарату липопротеин в количестве, необходимом для восстановления исходного массового соотношения компонентов 2-50:1 с последующей стерилизацией и консервацией препарата . Для совмещения с липопротеином используют антибиотик, выбранный из группы, включающей циклоспорин, тетрациклин, актиномицин-Д

№ 2005100777/13 от 2003.06.16. МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО РАМ4 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. ИММУНОМЕДИКС, ИНК. (US). ГОЛД Дэвид В. и др. (US). Антитело или его фрагмент, который связывает домен, находящийся между N-концом и началом домена повторов MUC 1, где указанное антитело получено путем иммунизации муцином и/или селекции с его использованием Направленный на раковую клетку диагностический или терапевтический конъюгат, содержащий антительный компонент, который включает в себя антитело или его фрагмент по п.1, который связывается с указанной клеткой, где указанный антительный компонент связан по меньшей мере с одним средством диагностики/детекции и/или по меньшей мере с одним терапевтическим средством . Терапевтический конъюгат , где указанное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из радионуклида, иммуномодулятора, гормона, антагониста гормона, фермента, ингибитора фермента, олигонуклеотида, светочувствительного терапевтического средства, цитотоксического средства, антитела, ингибитора ангиогенеза и их комбинации Терапевтический конъюгат , где указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловой олигонуклеотид . Способ , где указанное средство усиления ультразвукового изображения представляет собой липосому, которая содержит химеризованное антитело РАМ4 или его фрагмент Терапевтический конъюгат по п.80, где указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловой олигонуклеотид против онкогена

№ 2006106173/14 от 2004.07.30. УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ. ДРАГ ДЕЛИВЕРИ СОЛЮШНЗ ЛИМИТЕД (GB). ЧАРМАН Уилльям (AU) и др. Предназначенная для перорального приема система доставки лекарств, включающая в себя бижидкостную пену, содержащую от 1 до 20% по массе непрерывной гидрофильной фазы, от 70 до 98% по массе фармацевтически приемлемого масла, образующего дискретную фазу, причем в указанном фармацевтически приемлемом масле растворено или диспергировано малорастворимое в воде лекарственное средство в количестве от 0,1 до 20% по массе, где малорастворимое лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, которое растворяется в воде в количестве, не превышающем 1% по массе, и бижидкостную пену, включающую в себя ПАВ в количестве от 0,5 до 10% по массе, для формирования стабильной бижидкостной пены, где все количества указаны в процентах от общей массы единичной лекарственной формы Предназначенная для перорального приема система доставки лекарств , где ПАВ содержит простой эфир алкилполигликоля, сложный эфир алкилполигликоля, этоксилированный спирт, сложный полиоксиэтиленсорбитановый эфир жирной кислоты, сложный полиоксиэтиленовый эфир жирной кислоты, ионное или неионное ПАВ, аддукт гидрогенизированного касторового масла/полиоксиэтиленгликоля, содержащий от 25 до 60 этоксигрупп, аддукт касторового масла/полиоксиэтиленгликоля, содержащий от 25 до 45 этоксигрупп, либо их смеси Предназначенная для перорального приема система доставки лекарств , где соэмульгатор представляет собой фосфоглицерид или фосфолипид

№ 2003132694/15 от 2002.04.10. СИСТЕМА ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ ДЛЯ ГИДРОФОБНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ. Авторы: БОК Рональд Э. (СА) и др. Изобретение относится к области фармации. Сущность его заключается в разработке композиций, включающих микроагрегаты, содержащие гидрофобные лекарственные препараты, а также способы их производства. Такие микроагрегаты включают мицеллярные структуры или их комбинацию с микросомами, составляющие эффективный носитель доставки для гидрофобного агента. Способы производства микроагрегатов включают использование предпочтительных липидных соединений и условий обработки, способствующих улучшенной фильтрационной стерилизации. Технический результат - повышение эффективности доставки лекарственного средства, усиления фильтрационной стерилизации.

№ 2005131950 от 2004.04.14. КОВАЛЕНТНОЕ И НЕКОВАЛЕНТНОЕ СШИВАНИЕ ГИДРОФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ И АДГЕЗИВНЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ПОЛУЧЕННЫЕ С НИМИ. КОРИУМ ИНТЕРНЭШНЛ (US) и ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ИМ. А.В.ТОПЧИЕВА РАН (RU). Авторы: ФЕЛЬДШТЕЙН М.М. и др. Водонерастворимый сшитый гидрофильный адгезивный полимер, полученный полимеризацией композиции, состоящей, по существу, из гидрофильного мономера и мономера с двойной функциональностью, который как (а) подвергается полимеризации с гидрофильным мономером, так и (b) обеспечивает ковалентные сшивки в полимере Жидкая пленкообразующая композиция, состоящая, по существу, из водонерастворимого пленкообразующего полимера и полимера Композиция , в которой водонерастворимый пленкообразующий полимер выбран из акрилатсодержащих полимеров и сополимеров, поливинилацетата, сополимеров этилена-винилацетата, алкилцеллюлозы, нитроцеллюлозы и полисилоксанов Композиция , в которой активный агент выбран из бактериостатических и бактерицидных средств, антибиотиков Водонерастворимая гидрофильная адгезивная полимерная смесь, которая не содержит ковалентных сшивок, состоящая из по меньшей мере одного гидрофильного длинноцепочечного полимера и, по меньшей мере, одного амфифильного сшивающего агента

№ 2002122745/15 от 2001.03.06. НОВАЯ САМОЭМУЛЬГИРУЮЩАЯСЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ. ХОЛЬМБЕРГ Кристина (SE) и СЬЕКМАНН Бритта (SE). Стабильный безводный лекарственный препарат, содержащий, по меньшей мере, одно лекарственное средство, и безводный однофазный носитель, который содержит, по меньшей мере, один полимер и, по меньшей мере, один растворитель, данный носитель является растворимым в воде, где данное лекарственное средство не растворяется в одном или более из компонентов носителя, и данный лекарственный препарат является стабильным при 37°С, по меньшей мере, в течение двух месяцев Стабильный безводный лекарственный препарат , где лекарственное средство содержит вещество в виде частиц Стабильный безводный лекарственный препарат , где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из окситоцина, рибозимов и антисмысловых олигонуклеотидов

№ 2005133427/15 от 2004.03.31. БЕЗВОДНЫЕ ОДНОФАЗНЫЕ НОСИТЕЛИ И ПРЕПАРАТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТАКИХ НОСИТЕЛЕЙ. АЛЗА КОРПОРЕЙШН (US). ФЕРЕЙРА Пимела (US) и др . Наряду с одним или более чем одним неионогенным поверхностно-активным веществом; при этом указанная композиция образует in situ эмульсию типа масло-в-воде при контакте с водными средами, такими как желудочно-кишечные жидкости Полученная композиция обладает высокой биодоступностью активного начала и превосходными самоэмульгирующими свойствами, без дополнительного добавления масляного компонента и в присутствии только небольших количеств поверхностно-активного вещества.

№ 2005121571 от 2003.12.15. ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ СИСТЕМА, СИНТЕЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА. УОЛКЕР КЭНСЕР РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ, ИНК. (US). УОЛКЕР Эван Харрис (US) и др. Комбинация, характеризующаяся биологически инертным протолекарством и биологически инертным активационным лекарственным средством, где протолекарство представляет собой дифференциально концентрирующий фрагмент, токсический фрагмент и покрывающий фрагмент, связанные вместе таким образом, чтобы само протолекарство было, по существу, инертным Способ избирательной доставки цитотоксического соединения к опухолевой ткани, характеризующийся использованием протолекарства и активирующего количества фтористой соли как активационного лекарственного средства для получения фармацевтической композиции, где протолекарство доставляет цитотоксическое соединение к опухолевой ткани таким образом, чтобы предотвратить значительное повреждение нормальных тканей путем сохранения покрывающего фрагмента на протолекарстве до тех пор, пока протолекарство не сконцентрируется дифференциально в опухолевой ткани в течение периода отсрочки, и после такого периода отсрочки протолекарство продуцирует цитотоксическое соединение при воздействии фтористой соли.

№ 2004109228/15 от 2002.08.30. СОЕДИНЕНИЕ. ПКИ БИОТЕК АС (NO). РИМИНГТОН К. и др. Фотосенсибилизирующий агент, который содержит сульфированный мезотетрафенилхлорин или его фармацевтически приемлемую соль. Способ введения доставляемой молекулы в цитозоль клетки Фармацевтическая композиция , в которой доставляемую молекулу выбирают из группы, включающей органические соединения, белки, фрагменты белков и нуклеиновые кислоты Применение фотосенсибилизирующего агента и доставляемой молекулы, которую выбирают из группы, включающей ген, кодирующий терапевтический белок, десенсибилизирующую молекулу ДНК или РНК триплекс-образующий олигонуклеотид, пептид нуклеиновой кислоты, фактор транскрипции ДНК-"ловушки" и химерный олигонуклеотид, для получения лекарства для использования в методе генной терапии, в частности в методе лечения рака

Хотя вышеперечисленные способы позволяют в целом улучшить доставку антибиотиков и других лекарственных соединений к опухолевым клеткам, но они обладают некоторыми общими недостатками: а) сложностью и трудоемкостью приготовления комплексов; б) преобладанием в комплексах не природных биологических веществ, а синтетической «химии», чуждой организму человека; в) слипанием частиц друг с другом, ведущим к снижению активности и повышению риска закупорки мелких кровеносных капилляров; г) налипанием комплексов на стенки кровеносных сосудов и капилляров, ведущим к снижению эффективности и к появлению неспецифической токсичности; д) плохим проникновением комплексов в опухолевые клетки; е) плохим проникновением комплексов в клеточное ядро; ж) низким сродством комплексов к ядерной ДНК; з) слишком медленным высвобождением антибиотика из комплекса.

Наиболее близким аналогом (прототипом) может являться способ, описанный в патенте № 2004122919 от 2002.12.27. ТОНКОИЗМЕЛЬЧЕННОЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИЛИ НУТРИЦЕВТИЧЕСКОЕ ПОРОШКООБРАЗНОЕ СРЕДСТВО С НЕМЕДЛЕННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ. БЕЗЕНС ИНТЕРНЭШНЛ БЕЛЬЖИК (BE) и ГАЛЕНИКС ИННОВАСЬОН (FR). БЕСС Жером (FR) и БЕСС Лоранс (FR). Фармацевтическое или нутрицевтическое тонкоизмельченное порошкообразное средство с немедленным высвобождением, имеющее размер частиц не более 100 мкм и включающее сочетание, по меньшей мере, одного активного вещества, по меньшей мере, одного смачивающего средства и, по меньшей мере, одного наполнителя Порошкообразное средство , характеризующееся тем, что оно имеет размер частиц не более 10 мкм Порошкообразное средство , в котором активное вещество является, по меньшей мере, одним членом, выбранным из группы, включающей никотин , кофеин

Удачным решением в данном способе является: а) применение относительно небольших частиц размерами до 10-100 микрон, что повышает эффективность действия активного вещества, б) трехкомпонентность частиц, где один компонент является активным веществом, второй - смачивающим адгезивным веществом, а третий - наполнителем; в) использование в составе частиц кофеина, который не только обеспечивает удержание лекарственного вещества в крови, но и его легкое высвобождение в опухолевые клетки.

Недостатками данного способа являются:

1. Недостаточно маленький размер частиц. Как известно, диаметр капилляров, по которым эритроциты проходят к тканям, составляет порядка 10 микрон. Поэтому жесткие частицы такого размера могут повреждать капилляры и даже закупоривать их.

2. Порошкообразные частицы склонны к слипанию. Это может снижать эффективность активного вещества, а также увеличивать риск закупорки капилляров.

3. Активное вещество не защищено плотной молекулярной «оболочкой», вследствие чего происходит слишком быстрое, немедленное, высвобождение активного вещества. В результате лекарство мало достигает опухолевых клеток, в значительной степени «размазываясь» по кровеносным капиллярам.

В отличие от указанного прототипа и вышеописанных аналогов, предлагаемый в настоящем изобретении способ позволяет устранить перечисленные недостатки и получить гораздо более эффективное средство доставки гетероциклических антибиотиков к ядерной ДНК раковых клеток. Действительно, данный способ:

A) Не сложен и не трудоемок; для приготовления фармакосомных нанокомплексов хватает элементарных лабораторных принадлежностей (шприц, игла, магнитная мешалка, спирт, вода) и трех вполне доступных компонентов, для приготовления фармакосом из которых достаточно 5 минут.

Б) Фармакосомные наночастицы состоят из природных веществ, не чуждых организму человека.

B) Фармакосомы не слипаются друг с другом и не налипают на стенки кровеносных сосудов и капилляров.

Г) Антибиотик защищен снаружи олигонуклеотидной шпилькой и пуриновым кластером.

Д) Частицы имеют чрезвычайно малый размер - до 100 нм, что позволяет повысить эффективность действия, а также надежно уйти от риска закупорки капилляров.

Е) Нанокомплексы хорошо проникают через плазматическую и ядерную мембраны клетки.

Ж) Нанокомплексы имеют высокое сродство к ядерной ДНК.

3) Антибиотик начинает высвобождаться из нанокомплекса только после проникновения в клетку; время перераспределения к ДНК составляет порядка 1 мин.

Способ реализуется следующим образом. Приготавливают отдельные концентрированные спиртовые растворы гетероциклического антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина. Затем растворы смешивают в некотором соотношении, не слишком сильно отличающимся от эквимолярного. После этого осуществляют быстрое впрыскивание малого объема полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего для поддержания ионной силы хлорид натрия. В результате спонтанно образуются одиночные не слипающиеся нанокомплексы - фармакосомы - размерами от 1 до 100 нанометров, которые способны доставлять антибиотик к ДНК делящихся опухолевых клеток. Фармакосомы принимаются пациентом перорально или вводятся ему внутривенно.

Пример

1. Приготовить спиртовой раствор актиномицина Д в концентрации 1 мг/мл.

2. Приготовить спиртовой раствор шпилечного олигонуклеотида HP1 в концентрации 5 мг/мл.

3. Приготовить спиртовой раствор кофеина в концентрации 2 мг/мл.

4. Смешать растворы в соотношении 1:1:1.

5. Набрать полученный раствор в шприц.

6. Приготовить 20-кратно больший объем водного раствора, содержащего 150 мМ хлористого натрия.

7. Подвергнуть этот водный раствор интенсивному перемешиванию на магнитной мешалке.

8. Быстро, под давлением, впрыснуть раствор из шприца в быстро перемешивающийся водный раствор.

9. Образовавшиеся фармакосомы, характеризующиеся появлением релеевского светорассеяния в виде опалесценции, хранить на холоду (при 6°С - до 3 месяцев) и вводить пациенту внутривенно или перорально.

Таблица
Быстрая и медленная компоненты связывания 7ААМД и АМД с НР1 и ДНК
	t1 (с)	t2 (с)	a2/a1
7ААМД + НР1	0,29	-	-
7ААМД/НР1 + АМД	0,31	-	-
7ААМД + ДНК	4,6	40	0,3
7ААМД/НР1 + ДНК	4,5	101	1,7
7ААМД/НР1 + NaCl + ДНК	4,9	147	3,5
Примечание: Концентрация 7ААМД - 1 µM, HP1 - 2,4 µМ (0,021 мг/мл), ДНК - 0,014 мг/мл, NaCl - 50 мМ. Буфер - 20 мМ трис-HCl с 1 мМ ЭДТА (pH 7,5). Возбуждение 570 нм, эмиссия 610 нм. В ряде опытов «stopped-flow» концентрация 7ААМД была 2 µM, HP1 - 10 µM, АМД - 10 µM; возбуждение 550 нм, эмиссия >570 нм.