производное тромбина и фармацевтическая композиция, содержащая его

Формула изобретения

1. Производное тромбина, включающее цепь А и цепь В, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислоты активного центра серин в положении 205 и гистидин в положении 43 в аминокислотной последовательности цепи В тромбина замещены и где

(1) указанное производное тромбина разлагает субстрат тромбина в количестве 10% или менее при взаимодействии с субстратом тромбина в 50 мМ Трис-НСl (рН 7,4), содержащем 0,1 М NaCl при температуре 37°С в течение 3 ч, и

(2) указанное производное тромбина сохраняет способность связываться с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле.

2. Производное тромбина по п.1, которое дополнительно сохраняет связывающую способность с гепарином.

3. Производное тромбина по п.1, где указанный субстрат тромбина представляет собой фактор свертывания крови 13.

4. Производное тромбина по п.1, где указанный субстрат тромбина представляет собой фибриноген.

5. Производное тромбина по любому из пп.1-4, где гистидин в положении 43 замещен аланином или серином.

6. Производное тромбина по п.1, где серин в положении 205 замещен аланином, треонином или глицином.

7. Производное тромбина по п.1, где серин в положении 205 замещен аланином.

8. Производное тромбина по п.1, где гистидин в положении 43 замещен аланином.

9. Производное тромбина по п.1, где его способность связываться с фактором свертывания крови 8 составляет 10% или более от соответствующего показателя для ангидротромбина.

10. Производное тромбина по п.1, где его способность связываться с фактором свертывания крови 8 составляет 80% или более от соответствующего показателя для ангидротромбина.

11. Производное тромбина по п.1, где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIА) и связывающей способностью с фибриногеном (FA), для производного тромбина в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) для ангидротромбина.

12. Производное тромбина по п.1, где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA), для производного тромбина в 1,2 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) для ангидротромбина.

13. Производное тромбина по п.1, где частичное активированное тромбопластиновое время для производного тромбина в 1,1 раза или более превышает данный показатель для ангидротромбина.

14. Производное тромбина по п.1, где его способность связываться с фибриногеном снижена на 10% и его частичное активированное тромбопластиновое время увеличено в 1,1 раза или более за счет замещений аминокислот в аминокислотах активного центра.

15. Производное тромбина, включающее цепь А и цепь В, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой серин в положении 205 и гистидин в положении 43 в аминокислотной последовательности цепи В тромбина замещены.

16. Производное тромбина по п.15, где гистидин в положении 43 замещен аланином или серином.

17. Производное тромбина по п.15 или 16, где серин в положении 205 замещен аланином, треонином или глицином.

18. Производное тромбина по п.1, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, также замещены.

19. Производное тромбина по п.18, где аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, представляют собой аминокислоты в участке экзосайта I тромбина.

20. Производное тромбина по п.19, где аминокислоты во фрагменте экзосайта I тромбина представляют собой основные аминокислоты.

21. Производное тромбина по п.19, где аминокислоты во фрагменте экзосайта I тромбина представляют собой одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глютамина в положении 24, лизина в положении 65 и лизина в положении 77 в цепи В тромбина.

22. Производное тромбина по любому из пп.18-21, где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA), для производного тромбина в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) для производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

23. Производное тромбина по любому из пп.18-21, где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA), для производного тромбина в 1,5 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) для производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

24. Производное тромбина по любому из пп.18-21, где указанное производное тромбина характеризуется наличием любого эффекта, выбранного из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию активации рецептора тромбина и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированного ристоцетином; и которое характеризуется сниженной связывающей способностью с тромбомодулином в сравнении с соответствующей способностью у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

25. Производное тромбина по любому из пп.18-21, где указанное производное тромбина характеризуется наличием любого эффекта, выбранного из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию активации рецептора тромбина и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином; и которое характеризуется сниженной связывающей способностью с тромбомодулином на 10% или более в сравнении с соответствующей способностью производного у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

26. Производное тромбина по любому из пп.18-21, где VIIIA/TMA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМА), для производного тромбина в 1,1 раза или более превышает VIIIa/TMa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМа) для производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

27. Производное тромбина по любому из пп.18-21, где VIIIA/TMA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМА) для производного тромбина в 1,5 раза или более превышает VIIIa/TMa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМа) для производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

28. Производное тромбина по п.18, где аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, представляют собой аминокислоты, локализованные во фрагменте экзосайта II тромбина и его антитромботическая способность сохраняется, тогда как способность связываться с гепарином снижена.

29. Производное тромбина по п.28, где указанные аминокислоты, локализованные во фрагменте экзосайта II тромбина, представляют собой один или несколько видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина в положении 98, аргинина в положении 245, лизина в положении 248 и лизина в положении 252 в цепи В тромбина.

30. Производное тромбина по п.28 или 29, где связывающая способность с гепарином у производного тромбина составляет 90% или менее от соответствующей способности у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

31. Производное тромбина по п.18, отличающееся тем, что достигается усиление одного или нескольких видов антитромботических эффектов, выбранных из группы, состоящей из эффекта по увеличению частичного активированного тромбопластинового времени, эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной модифицированным тромбином, эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

32. Производное тромбина по п.18, где значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,1 раза или более превышает соответствующий показатель у ангидротромбина.

33. Производное тромбина по п.28 или 29, где значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,5 раза или более превышает соответствующий показатель у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, и его связывающая способность с тромбомодулином снижена до 50% или менее в сравнении с соответствующей способностью у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

34. Производное тромбина по п.1, где аминокислотная последовательность цепи В тромбина представляет собой аминокислотную последовательность цепи В человеческого тромбина дикого типа.

35. Производное тромбина по п.34, где указанная аминокислотная последовательность цепи В человеческого тромбина дикого типа представляет собой аминокислотную последовательность от положения 50 до положения 308 в SEQ ID NO:2.

36. Производное тромбина по п.1, где его карбоксильная группа модифицирована.

37. Производное тромбина по п.36, где указанная карбоксильная группа модифицирована сложным эфиром аминокислоты.

38. Производное тромбина по п.36, где указанная карбоксильная группа модифицирована полиэтиленгликолем.

39. Производное тромбина по п.36, где указанная карбоксильная группа модифицирована полиэтиленгликолем, содержащим аминогруппу.

40. Производное тромбина по п.38 или 39, где указанный полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1000 или меньше.

41. Производное тромбина по п.36, где указанная карбоксильная группа модифицирована карбодиимидом.

42. Производное тромбина по п.36, где по меньшей мере 3 карбоксильных группы на молекулу модифицированы.

43. Производное тромбина по п.36, где 25 или менее карбоксильных групп на молекулу модифицированы.

44. Производное тромбина по п.36, где по меньшей мере карбоксильная группа в глютаминовой кислоте в положении 25 в цепи В модифицирована.

45. Производное тромбина по п.1, обладающее эффектом по ингибированию активации PAR1 и/или эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

46. ДНК, кодирующая производное тромбина по любому из пп.1-35.

47. Фармацевтическая композиция, включающая производное тромбина по любому из пп.1-45.

48. Фармацевтическая композиция по п.47, которая представляет собой антитромботическое средство.

49. Фармацевтическая композиция по п.47, которая представляет собой противовоспалительное средство.

50. Фармацевтическая композиция по п.47, которая представляет собой средство, ингибирующее агрегацию тромбоцитов.

51. Фармацевтическая композиция по п.47, которая представляет собой средство, ингибирующее адгезию тромбоцитов.

52. Фармацевтическая композиция по п.47, которая представляет собой средство, ингибирующее эндогенное свертывание крови.

53. Фармацевтическая композиция по п.47, которая представляет собой средство, ингибирующее активацию рецептора тромбина.

54. Фармацевтическая композиция по п.47, обладающая противосвертывающим действием в отношении крови и антитромбоцитарным действием.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к производному тромбина и к фармацевтической композиции, содержащей его, в частности к антитромботическому агенту или к противовоспалительному средству.

Уровень техники

Тромбин представляет собой трипсиноподобную сериновую протеиназу, которая обладает очень высокой гомологией к трипсину и выполняет определенные функции в реакции по типу агрегации тромбоцитов, воспалительной реакции и т.п. Например, в непатентном документе 1 описывается активация тромбином рецептора тромбина, служащего в качестве субстрата, что вызывает агрегацию тромбоцитов, активацию эндотелиальных клеток сосудов и воспалительную реакцию.

Физиологические действия тромбина описываются следующим образом. В непатентном документе 2 (Japanese Journal of Thrombosis and Hemostasis, vol. 10, 1999, Nos. 2 and 3) указывается, что фрагмент I экзосайта играет важную роль в распознавании субстрата, осуществляемом в процессе свертывания крови, которое вызывается преимущественно тромбином. В непатентном документе 3 (Biochemical J. (2001) 354, 309-313) указывается, что ангидротромбин, который представляет собой инактивированный тромбин, обладающий связывающей способностью в отношении белкового субстрата тромбина (далее также называемого как «субстрат тромбина»), обладает, как и тромбин дикого типа, высокой связывающей активностью в отношении субстрата тромбина, способного связываться с экзосайтом 1. Дополнительно в непатентном документе 3 отмечается, что добавление вещества, такого как бензамидин, которое создает пространственное препятствие в активном центре, устраняет связывающую способность АГТ (AHT). В непатентном документе 4 (Voet: Biochemistry, 1^st volume, 1996, p.331-340, Tokyo Kagaku Dojin) указывается, что сериновые протеазы, такие как тромбин, содержат в активном центре серин, гистидин и аспарагиновую кислоту, и заряженные системы указанных трех аминокислот вызывают экспрессию протеазной активности; а также глицин в положении 193 (номер 193 указывает на положение аминокислоты в молекуле химотрипсиногена и соответствует глицину в положении 203 в B цепи тромбина) вовлекается в процесс преобразования комплекса Михаэлиса сериновых протеаз в тетраэдральный комплекс.

На основании указанных результатов были предприняты различные попытки ввести модификации и изменения в молекулу тромбина с целью разработки антитромботического агента и т.п. В патентном документе 1 (WO 01/03740) описывается ингибитор сериновой протеазы, содержащий вещество (далее также называемое как «вещество, ингибирующее реакцию»), которое связывается с субстратом сериновой протеазы, конкурируя с сериновой протеазой и тем самым ингибируя реакцию между сериновой протеазой и субстратом. Далее, в патентном документе 1 указывается, что ингибитор сериновой протеазы эффективно служит в качестве антитромботического средства (то есть ингибитора тромбогенеза). В патентном документе 1 также описывается в качестве конкретного примера вещества, ингибирующего реакцию, производное тромбина (например, ангидротромбин, называемый далее также как «AГT») со значительно сниженной активностью сериновой протеазы, которое получают при проведении реакции сериновой протеазы тромбина с ингибитором, таким как фенилметилсульфонилфторид (далее также называемый как «ФМСФ»), который превращает серин, имеющийся в активном сайте, в дегидроаланин (далее реакция также будет называться как ангидратация).

Соответственно в патентном документе 2 (WO 02/077031) описывается производное ангидротромбина (AHT) (далее также называемое как «M-AHT»), получаемое путем химической модификации AHT при проведении реакции карбоксильной группы AHT с имидогруппой. M-AHT обладает селективно низкой связывающей способностью с фибриногеном (далее называемым как «Fbgn»), который присутствует в крови в больших количествах и может повышать эффект по увеличению частичного активированного тромбопластинового времени (также называемого как «ЧАТВ») в сравнении с AHT и оказывает высокий антитромботический эффект.

Соответственно, были проведены исследования производных тромбина, содержащих замещения аминокислот. Приведенное ниже обсуждение данных относится к рекомбинантам, полученным путем замещения аминокислоты в активном центре путем генной рекомбинации тромбина. Например, в непатентном документе 5 (Experimental Cell Research 219, 650-656 (1995)) описывается влияние производного тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином, на лейкоциты. Дополнительно, в непатентном документе 5 указывается, что у данного производного тромбина отсутствует ферментативная активность.

В непатентном документе 6 (Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186) описываются: производное тромбина, в котором глицин в положении 203 B-цепи тромбина замещен аланином; производное тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином или треонином; производное тромбина, в котором гистидин активного центра замещен аспарагином; и производное тромбина, в котором аспарагиновая кислота активного центра замещена аспарагином. В непатентном документе 6 описывается ферментативная активность указанных производных тромбина. Так, производное тромбина, в котором серин активного центра замещен треонином, производное тромбина, в котором гистидин активного центра замещен аспарагином, и производное тромбина, в котором аспарагиновая кислота активного центра замещена аспарагином, обладает, каждое, ферментативной активностью, которая снижена от нескольких тысячных долей до нескольких десятков тысячных долей в сравнении с активностью тромбина дикого типа. Кроме того, показано, что ферментативная активность у производного тромбина, в котором глицин в положении 203 В цепи тромбина замещен аланином, и у производного тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином, полностью отсутствует.

Однако производные тромбина, описанные в непатентных документах 5 и 6, все еще обладают ферментативной активностью (активностью по разложению субстрата тромбина) на уровне, который не может быть обнаружен методами тестирования, описанными в соответствующих документах, и характеризуются значительно сниженной способностью к связыванию субстрата тромбина или характеризуются высокой связывающей способностью с Fbgn, который присутствует в крови в больших количествах. Таким образом, трудно утверждать, что каждое из производных тромбина обладает активностью, достаточной для того, чтобы выполнять функцию антитромботического агента и/или противовоспалительного средства.

В патентном документе 3 (WO 95/13385), в непатентном документе 7 (J. Biol. Chem. Vol. 275, 39827-39830), в непатентном документе 8 (J. Biol. Chem. Vol. 279, 26387-26394) и в непатентном документе 9 (J. Biol. Chem. Vol. 277, 27581-27584) описываются производные тромбина, каждое из которых обладает ферментативной активностью (активностью по разложению субстрата тромбина) и антикоагулирующим эффектом, которые получают при замене аминокислоты. Указанные производные тромбина, каждый, обладают сохранившейся или даже повышенной связывающей способностью с тромбомодулином (далее также называемым как «ТМ») при значительно сниженной способности к разложению Fbgn, и в этой связи каждый из них представляет собой производное тромбина, которое специфически связывается с ТМ при активации белка С, проявляя таким образом антитромботический эффект.

В патентном документе 4 (WO 96/41868) описывается производное протромбина, которое содержит замещение аминокислоты в активном центре и которое предлагается использовать для нейтрализации антикоагулирующей активности С-концевого пептида гирудина, когда при введении С-концевого пептида гирудина пациенту в качестве антитромботического средства возникают проблемы, такие как кровотечение.

В патентных документах 5 и 6 отмечается, что производное тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином, и производное тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином и аспарагиновая кислота активного центра замещена аспарагином, ингибирует стимуляцию рецептора тромбина тромбином в суспензии промытых тромбоцитов.

Однако каждое из указанных производных тромбина обладает сильной способностью по связыванию с Fbgn, который присутствует в крови в больших количествах. В том случае, когда указанные производные тромбина вводят в кровь, большая часть из них связывается с Fbgn. В этой связи должно быть введено большое количество производного тромбина, с тем чтобы достичь желательного ингибирующего эффекта в отношении рецептора тромбина. Таким образом, было практически невозможно использовать каждое из указанных производных тромбина в качестве агента, ингибирующего рецептор тромбина (например, антитромбоцитарного агента) в крови (см. экспериментальный пример 3, приведенный ниже).

[Патентный документ 1] WO 01/03740

[Патентный документ 2] WO 02/077031

[Патентный документ 3] WO 95/13385

[Патентный документ 4] WO 96/41868

[Патентный документ 5] WO 92/14750

[Патентный документ 6] US 5 256 766

[Непатентный документ 1] J. Biol. Chem. 261 (1986), 15928-15933)

[Непатентный документ 2] Japanese Journal of Thrombosis and Hemostasis, vol. 10, Nos. 2 and 3, (1999)

[Непатентный документ 3] Biochemical J. (2001) 354, 309-313

[Непатентный документ 4] Voet: Biochemistry, 1 том Руководства, который переведен на японский язык, 1996, p.331-340, Tokyo Kagaku Dojin

[Непатентный документ 5] Experimental Cell Research 219, 650-656 (1995)

[Непатентный документ 6] Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186

[Непатентный документ 7] J. Biol. Chem. Vol. 275, 39827-39830

[Непатентный документ 8] J. Biol. Chem. Vol. 279, 26387-26394

[Непатентный документ 9] J. Biol. Chem. Vol. 277, 27581-27584

Описание изобретения

Производные тромбина, такие как AHT и M-AHT, получаемые с помощью химических процедур, оказывают антитромботические эффекты или противовоспалительное действие, однако у них все еще сохраняется активность сериновой протеазы, которая варьируется в зависимости от химических процедур. Для превращения AHT требуется множество стадий, включающих щелочную обработку, процедуру восстановления и т.п., что сказывается на снижении выхода, который составляет от 50 до 60%. Остающаяся в AHT и M-AHT на следовом уровне ферментативная активность (активность по разложению субстрата тромбина) в ряде случаев снижает антикоагулирующую активность AHT и M-AHT. В частности, это с большей вероятностью имеет место в случае AHT.

Таким образом, нет оснований констатировать, что производное тромбина, содержащее замещение аминокислот в активном центре тромбина, обладает активностью, достаточной для того, чтобы выполнять функцию антитромботического агента или противовоспалительного средства. Причиной этого может быть тот факт, что каждое из указанных производных тромбина обладает выраженной активностью по разложению тромбинового субстрата в случае его использования в качестве антитромботического агента или противовоспалительного средства, или обладает значительно сниженной способностью к связыванию с субстратом тромбина в связи со структурными изменениями, преимущественно в экзосайте I, вызванными замещениями аминокислот.

Например, в непатентном документе 6 (Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186) сообщается, что производное тромбина, в котором глицин в положении 203 В цепи тромбина замещен аланином, полностью теряет активность по разложению субстрата тромбина. Однако указанное производное тромбина все еще обладает существенной активностью по разложению субстрата тромбина в случае его использования в качестве антитромботического агента или противовоспалительного средства. Кроме того, замещение глицина в положении 203, гистидина активного центра и аспарагиновой кислоты в цепи В тромбина, как описано в непатентном документе 6, снижает активность по разложению субстрата тромбина до более низкого уровня, но некоторое сочетание замещений вызывает структурные изменения в экзосайте I, которые ведут к нарушению способности к связыванию с субстратом тромбина.

По данным медицинской статистики, в настоящее время выявлены три основных причины смерти в Японии, которые включают: на первом месте - рак (30%), на втором месте - заболевания сердечно-сосудистой системы (15%) и на третьем месте - нарушения мозгового кровообращения (13%), что в целом составляет 60 процентов от всех летальных исходов. Большая часть заболеваний сердца представляет собой заболевания коронарных сосудов, такие как сердечный инфаркт и грудная жаба. В настоящее время ангиопатии сердца и мозга в целом составляют почти половину в процентах от числа смертных случаев, вызванных раком. Однако процент ангиопатий будет в будущем возрастать, и в этой связи разработка эффективного терапевтического средства приобретает выраженное социальное звучание. Кроме того, церебральный инфаркт, если он даже не приводит к смертельному исходу, характеризуется частыми побочными эффектами, что сопряжено с социальными проблемами, такими как серьезные траты на уход за больными и оплату медицинских услуг.

Тромбоз, включающий инфаркт миокарда, грудную жабу, церебральный инфаркт и аналогичные заболевания, возникает в результате действия множества факторов. Как показано на Фиг.48, по имеющимся сообщениям, при истинном инфаркте сердца отмечается белый тромб, впоследствии смешанный тромб в центральной части кровотока и красный тромб в нижней части кровотока.

Большая часть сосудистых заболеваний мозга или сердца представляет собой тромбоз. Основные причины тромбоза включают нарушенный кровоток, аномалии в коагулирующем компоненте и аномалии в эндотелии сосудов, но фактически все они в сочетании вызывают и индуцируют тромбоз. Коагулаза тромбина - один из компонентов, которые вовлекаются в работу всех причин такого рода и играют центральную роль в тромбогенезе. Тромбин продуцирует агрегаты фибрина на конечной стадии каскадного процесса свертывания крови, и в то же время тромбин ускоряет каскадную реакцию свертывания крови под действием активирующих факторов XI, V и VIII. Кроме того, тромбин вызывает агрегацию тромбоцитов и активацию эндотелиальных клеток через PAR1, который является рецептором на тромбоцитах и сосудистом эндотелии. Сообщается, что активация эндотелиальных клеток ускоряет коагуляцию сосудистой стенки, и происходит тромбогенез в связи с протеканием цепи отрицательных реакций. В патологической анатомии истинного артериального тромбоза в большинстве наблюдаются белый, смешанный и красный тромбы, при этом показано, что ингибирование процесса свертывания крови и тромбоцитов, в сочетании, является важным фактором в антитромботическом лечении. Тем не менее, все существующие антитромботические агенты подразделяются на антикоагулянты или антитромбоцитарные агенты, и лечение проводят с использованием соответствующих лекарственных средств.

Ввиду указанных выше обстоятельств желательно разработать антитромботический агент, который мог бы использоваться в качестве антитромботического агента и в качестве противовоспалительного средства, который бы эффективно ингибировал (i) активацию и ускорение свертывания, (ii) агрегацию и адгезию тромбоцитов и (iii) способность активировать эндотелиальные клетки сосудов.

Авторы настоящего изобретения выявили следующие факты.

Так, авторы показали, что производные тромбина, которые включают замещение одного или нескольких видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина и которые обладают активностью по разложению субстрата тромбина, сниженной до такого уровня, при котором субстрат тромбина уже по существу не разлагается, и в которых замещения аминокислот активного центра не нарушают структур экзосайта I и экзосайта II, характерных для незамещенного тромбина, могут оказывать антитромботический эффект, преимущественно включающий эффект по увеличению ЧАТВ, аналогичный таковому у AHT; указанный эффект по увеличению ЧАТВ несомненно приводит к увеличению ЧАТВ, при этом на него не оказывает воздействие инкубация в связи с наличием остаточной активности тромбина (см. Экспериментальный пример 21). Далее, авторы обнаружили, что производные тромбина, обладающие связывающей способностью, более специфичной к субстрату тромбина, которая играет важную роль в тромбогенезе, могут с большей определенностью оказывать антитромботический эффект или противовоспалительный эффект, равный или превышающий таковой у AHT.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность к связыванию с Fbgn, имеющимся в крови в больших количествах, может быть относительно снижена в сравнении со связывающейся способностью с рецептором тромбина или фактором свертывания крови 8 (далее называемым как «FVIII») за счет замещений аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, что приводит к достижению хорошего антитромботического эффекта даже в малой дозировке. Дополнительно, было обнаружено, что замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, приводят к получению производных тромбина, обладающих различными аспектами данных эффектов, таких как производные тромбина, которые оказывают повышенный эффект по увеличению ЧАТВ, но обладают низким антитромбоцитарным эффектом, и производные тромбина, которые имеют высокий эффект по увеличению ЧАТВ и высокий антитромбоцитарный эффект (только PAR1-ингибирующий эффект).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что замещения некоторых дополнительных аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, не нарушают антитромботический эффект, осуществляемый производным тромбина по настоящему изобретению, и специфически снижают связывающую способность тромбинового производного в отношении ТМ. В случае введения в живой организм производных тромбина согласно настоящему изобретению, в которых замещены аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, указанные производные тромбина не ингибируют активацию белка С на ТМ, вызванную тромбином. Иными словами, производные тромбина по настоящему изобретению, в которых имеются замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, не ингибируют антитромботическую активность, присущую тромбину.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в том случае, когда карбоксильная группа в производных тромбина согласно настоящему изобретению модифицирована по методу, описанному в патентном документе 2 (WO 02/077031), то достигается не только увеличение ЧАТВ, но и антитромбоцитарный эффект, в особенности активация PAR1, и эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, может быть нарушен или может подвергаться контролируемому воздействию, в зависимости от типа аминокислотного замещения. Для достижения специфичности могут быть получены производные тромбина, обладающие контролируемым балансом лекарственной эффективности, такие как: производные тромбина, обладающие чрезвычайно высоким эффектом по увеличению ЧАТВ и высоким антитромбоцитарным эффектом; или производные тромбина, обладающие умеренным уровнем эффекта по увеличению ЧАТВ и мощным антитромбоцитарным эффектом. Таким образом, модификация карбоксильных групп в производных тромбина согласно настоящему изобретению может обеспечивать создание производных тромбина, оказывающих антикоагуляционный эффект на кровь и антитромбоцитарный эффект, так что они могут найти применение при разных видах тромбоза.

Указанные результаты авторов и составили суть настоящего изобретения.

Соответственно, ниже описывается настоящее изобретение.

(1) Производное тромбина, включающее А цепь и В цепь, где В цепь имеет аминокислотную последовательность, в которой один или несколько видов аминокислот активного центра, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина, замещены и где:

1) производное тромбина разлагает субстрат тромбина в доле 10% или менее при взаимодействии с субстратом тромбина в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 M NaCl, при температуре 37°С в течение 3 ч, и

2) производное тромбина сохраняет структуру экзосайта I.

(2) Производное тромбина, включающее А цепь и В цепь, где В цепь имеет аминокислотную последовательность, в которой один или несколько видов аминокислот активного центра, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина, замещены, где

1) производное тромбина разлагает субстрат тромбина в доле 10% или менее при взаимодействии с субстратом тромбина в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 M NaCl, при температуре 37°С в течение 3 ч, и

2) производное тромбина сохраняет способность к связыванию с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле.

(3) Производное тромбина согласно пункту (2), которое также сохраняет способность к связыванию с гепарином.

(4) Производное тромбина согласно пункту (1) или (2), где указанный субстрат тромбина представляет собой фактор свертывания крови 13.

(5) Производное тромбина согласно пункту (1) или (2), где указанный субстрат тромбина представляет собой фибриноген.

(6) Производные тромбина согласно любому из пунктов (1)-(5), где указанные замещения аминокислот активного центра представляют собой замещения двух или более видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина.

(7) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(6), где указанные замещения аминокислот активного центра включают замещение серина в положении 205.

(8) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(7), где указанное замещение аминокислот активного центра включает замещение серина в положении 205 и гистидина в положении 43.

(9) Производное тромбина согласно пункту (8), где гистидин в положении 43 замещен аланином или серином.

(10) Производное тромбина согласно любому из пунктов (6)-(9), где серин в положении 205 замещен аланином, треонином или глицином.

(11) Производное тромбина согласно любому из пунктов (6)-(9), где серин в положении 205 замещен аланином.

(12) Производное тромбина согласно пункту (8), где серин в положении 205 и гистидин в положении 43 замещены аланином.

(13) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(12), где его способность связываться с фактором свертывания крови 8 на 10% или более превосходит соответствующую способность у ангидротромбина.

(14) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(12), где его способность связываться с фактором свертывания крови 8 составляет 80% или более относительно соответствующей способности у ангидротромбина.

(15) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(14), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) у ангидротромбина.

(16) Производное тромбина по любому из пунктов (1)-(14), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,2 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) у ангидротромбина.

(17) Производное тромбина по любому из пунктов (1)-(12), где значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,1 раза или более превышает данный показатель у ангидротромбина.

(18) Производное тромбина по любому из пунктов (1)-(12), где его связывающая способность с фибриногеном снижена на 10% или более и значение частичного активированного тромбопластинового времени увеличено в 1,1 раза или более за счет аминокислотных замещений среди аминокислот активного центра.

(19) Производное тромбина, включающее цепь А и цепь В, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой замещены серин в положении 205 и один или несколько видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина.

(20) Производное тромбина, включающее цепь А и цепь В, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой замещены серин в положении 205 и гистидин в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина.

(21) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(20), где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой также замещены аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра.

(22) Производное тромбина согласно пункту (21), где аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, представляют собой аминокислоты фрагмента экзосайта I тромбина.

(23) Производное тромбина согласно пункту (22), где аминокислоты фрагмента экзосайта I тромбина представляют собой основные аминокислоты.

(24) Производное тромбина согласно пункту (22), где аминокислоты во фрагменте экзосайта I тромбина представляют собой одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глютамина в положении 24, лизина в положении 65 и лизина в положении 77 в цепи В тромбина.

(25) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(26) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,5 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и способностью связываться с фибриногеном (Fa) у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(27) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где указанное производное тромбина обладает:

- любым эффектом, выбранным из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию активации рецептора тромбина и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином; и обладает

- сниженной связывающей способностью с тромбомодулином, в сравнении с соответствующей способностью у производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(28) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где указанное производное тромбина обладает:

- любым эффектом, выбранным из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию активации рецептора тромбина и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином; и обладает

- связывающей способностью с тромбомодулином, сниженной на 10% или более, в сравнении с соответствующей способностью у производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(29) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/TMA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМА), у производного тромбина, в 1,1 раза или более превышает VIIIa/TMa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМа) у производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(30) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/TMA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМА) у производного тромбина, в 1,5 раза или более превышает VIIIa/TMa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМа) у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(31) Производное тромбина согласно пункту (21), где указанные аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, представляют собой аминокислоты фрагмента экзосайта II тромбина, и его антитромботическая способность сохраняется, тогда как способность связываться с гепарином снижена.

(32) Производное тромбина согласно пункту (31), где указанные аминокислоты во фрагменте экзосайта II тромбина представляют собой один или несколько видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина в положении 98, аргинина в положении 245, лизина в положении 248 и лизина в положении 252 в цепи В тромбина.

(33) Производное тромбина согласно пункту (31) или (32), где гепарин-связывающая способность у производного тромбина составляет 90% или менее в сравнении с соответствующей способностью у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(34) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(33), где усилены один или несколько видов антитромботических эффектов, выбранных из группы, состоящей из эффекта по увеличению частичного активированного тромбопластинового времени, эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной модифицированным тромбином, и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

(35) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(33), где указанное значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,1 раза или более превышает данный показатель у ангидротромбина.

(36) Производное тромбина согласно пункту (31) или (32), где указанное значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,5 раза или более превышает данный показатель у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, и его связывающая способностью с тромбомодулином снижена до 50% или менее в сравнении с соответствующей способностью у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(37) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(36), указанная аминокислотная последовательность В цепи тромбина представляет собой аминокислотную последовательность В цепи человеческого тромбина дикого типа.

(38) Производное тромбина согласно пункту (37), где указанная аминокислотная последовательность В цепи человеческого тромбина дикого типа представляет собой аминокислотную последовательность от положения 50 до положения 308 в SEQ ID No: 2.

(39) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(38), где его карбоксильная группа модифицирована.

(40) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована сложным эфиром аминокислоты.

(41) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована полиэтиленгликолем.

(42) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована полиэтиленгликолем, содержащим аминогруппу.

(43) Производное тромбина согласно пункту (41) или (42), где указанный полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1000 или менее.

(44) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована карбодиимидом.

(45) Производное тромбина согласно пункту (39), где по меньшей мере 3 карбоксильных группы на молекулу модифицированы.

(46) Производное тромбина согласно пункту (39), где 25 или менее карбоксильных групп на молекулу модифицированы.

(47) Производное тромбина согласно пункту (39), где модифицирована по меньшей мере карбоксильная группа глютаминовой кислоты в положении 25 в цепи В.

(48) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(47), обладающее эффектом по ингибированию активации PAR1 и/или эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

(49) ДНК, кодирующая производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(38).

(50) Фармацевтическая композиция, включающая производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(48).

(51) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой антитромботический агент.

(52) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой противовоспалительное средство.

(53) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой средство, оказывающее ингибирование агрегации тромбоцитов.

(54) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой агент, ингибирующий адгезию тромбоцитов.

(55) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой агент, ингибирующий эндогенное свертывание крови.

(56) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой агент, ингибирующий активацию рецептора тромбина.

(57) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), обладающая свертывающим эффектом на кровь и антитромбоцитарным эффектом.

Краткое описание рисунков

Фиг.1. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой (37 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «009» и «010» обозначают контроль и 203A205G тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно. Вертикальная ось обозначает пропускание (%), а горизонтальная ось обозначает время (мин): то же справедливо для Фиг.2-12, 15, 21 и 22, и 25-35.

Фиг.2. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой (37 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют 1 мкг/мл М-тромбина (то есть тромбином с модифицированной карбоксильной группой). Точки «002» и «001» обозначают контроль и 203A205G тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.3. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «079» и «080» обозначают контроль и 205A43А тромбин соответственно.

Фиг.4. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «083» и «084» обозначают контроль и 205A43А тромбин соответственно.

Фиг.5. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «056» и «055» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.6. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (15 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «042» и «041» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.7. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (7,5 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «058» и «057» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.8. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «064» и «063» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.9. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (15 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «067» и «066» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.10. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (7,5 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «070» и «069» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.11. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 203A205G тромбина (80 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «104» и «095» обозначают контроль и 203A205G тромбин соответственно.

Фиг.12. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 203A205G тромбина (80 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «097» и «098» обозначают контроль и 203A205G тромбин соответственно.

Фиг.13. График, демонстрирующий специфичность по связыванию 203A205G тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10 ^-7 М Fbgn и непрерывная линия относится к 1,0×10 ^-7 М FVIII.

Фиг.14. График, демонстрирующий специфичность по связыванию AHT с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и непрерывная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.15. График, демонстрирующий антитромбоцитарные эффекты 205A43А тромбина (точки «007» и «008» обозначают концентрации 3,26 мкМ и 0,81 мкМ соответственно) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точка «009» обозначает контроль.

Фиг.16. График, демонстрирующий специфичность по связыванию производного 205А43А тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и непрерывная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.17. График, демонстрирующий специфичность по связыванию производного 205А43А тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10 ^-7 М Fbgn и непрерывная линия относится к 1,0×10 ^-7 М FVIII.

Фиг.18. График, демонстрирующий специфичность по связыванию 24Е205А43А тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и непрерывная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.19. График, демонстрирующий ТМ-связывающие способности 205А43А тромбина и 24Е205А43А тромбина. D и Е обозначают 205А43А тромбин и 24Е205А43А соответственно.

Фиг.20. Фотография электрофореза, демонстрирующая активность 203А тромбина по разложению субстрата тромбина. Линия 1 обозначает маркер молекулярного веса, линии 2 и 5 обозначают слепую пробу, линия 3 обозначает FXIII и линия 4 обозначает FXIII + 203А тромбин. Дополнительно, линии 6-10 относятся к результатам, полученным при добавлении 203А тромбина в FXIII с проведением впоследствии реакции в течение 0, 0,5, 1, 3, и 6 ч, соответственно.

Фиг.21. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A тромбина с модифицированной карбоксильной группой (100 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «016» и «015» обозначают контроль и 205A тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.22. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A тромбина с модифицированной карбоксильной группой (100 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «003» и «004» обозначают контроль и 205A тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.23. График, демонстрирующий связывающую специфичность производного 205A тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и сплошная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.24. График, демонстрирующий связывающую специфичность производного 205A203А тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и сплошная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.25. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 77Е203А205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой (50 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «001» и «002» обозначают контроль и 77Е203А205G тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.26. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 77Е203А205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой (50 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «014» и «013» обозначают контроль и 77Е203А205G тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.27. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 77Е205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (100 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «019» и «020» обозначают контроль и 77Е205А43А тромбин соответственно.

Фиг.28. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 77Е205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «005» и «006» обозначают контроль и 77Е205А43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.29. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (100 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «020» и «019» обозначают контроль и 65А205А43А тромбин соответственно.

Фиг.30. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (25 или 50 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «021» и «022» обозначают 65А205А43А тромбин в концентрации 25 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно.

Фиг.31. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина (10 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «023» и «024» обозначают контроль и 65А205А43А тромбин соответственно.

Фиг.32. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (36 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «038» и «033» обозначают контроль и 65А205А43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.33. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (9 или 18 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «035» и «036» обозначают 18 мкг/мл и 9 мкг/мл соответственно.

Фиг.34. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (4,5 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина.

Фиг.35. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 65А205А43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (36 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «041» и «042» обозначают контроль и 65А205А43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.36. График, демонстрирующий связывающую специфичность производного 65А205A43А тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и сплошная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.37. График, демонстрирующий ТМ-связывающую способность 65А205A43А тромбина.

Фиг.38. Фотография, показывающая результаты электрофореза 205А43А тромбина в процессе очистки с использованием колонки с С-концевым пептидом гирудина. ДСН-ПААГ проводят без восстановления и затем проводят СBB-окрашивание. Линии 1 и 2, каждая, обозначают стандартный тромбин, линия 3 соответствует фракции до нанесения на колонку, линия 4 обозначает протекающую фракцию и линии 5-10, каждая, обозначают элюированную фракцию.

Фиг.39. Фотография, показывающая результаты электрофореза 205А тромбина в процессе очистки с использованием колонки с С-концевым пептидом гирудина. ДСН-ПААГ проводят без восстановления и затем проводят окрашивание с использованием СBB. Линии 1-3, каждая, обозначают стандартный тромбин, линия 4 соответствует фракции до нанесения на колонку, линия 5 обозначает протекающую фракцию и линии 6-11, каждая, обозначают элюированную фракцию.

Фиг.40. Фотография, показывающая результаты электрофореза и активность 205А тромбина по разложения субстрата тромбина. Линия 1 обозначает маркер, линии 2 и 5, каждая, обозначают вариант без образца, линия 3 обозначает только FXIII и линия 4 обозначает FXIII + тромбин. Линии 6-10 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 205А тромбином в течение 0, 1, 3, 6 и 24 ч соответственно.

Фиг.41. Фотография электрофореза, демонстрирующая результаты оценки активности 203А205G тромбина по разложению субстрата тромбина. Линия 1 обозначает маркер, линия 2 обозначает только FXIII и линия 3 обозначает FXIII + тромбин. Линии 4-8 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 203A205G тромбином в течение 0, 1, 3, 6 и 24 ч соответственно.

Фиг.42. Фотография электрофореза, демонстрирующая активности соответствующих производных по разложению субстрата тромбина. Линия 1 обозначает маркер, линия 3 обозначает только FXIII и линии 2 и 4, каждая, обозначают FXIII + тромбин. Линии 5-7 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 205G тромбином в течение 0, 1 и 3 часов, соответственно. Лиинии 8 и 9 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 205А43А тромбином в течение 0 и 3 ч соответственно. Линии 10 и 11 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 203A205G тромбином в течение 0 и 3 ч соответственно.

Фиг.43. Фотография электрофореза, демонстрирующая активности соответствующих производных по разложению субстрата тромбина. Линия 1 обозначает маркер, линия 2 обозначает только FXIII и линия 3 обозначает FXIII + тромбин. Линии 4-8 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 203А205А тромбином в течение 0, 1, 3, 6 и 24 ч соответственно. Полосы 9-13 обозначают FXIII, который взаимодействовал с 203А205А99N тромбином в течение 0, 1, 3, 6 и 24 ч соответственно.

Фиг.44. Фотография, демонстрирующая картину электрофореза 205V тромбина в процессе очистки с использованием колонки с С-концевым пептидом гирудина. ДСН-ПААГ проводят после восстановления S-S связей и вестерн-блоттинг проводят с использованием поликлональных антител против человеческого тромбина для подтверждения характера полос. Линия 1 обозначает маркер, линии 2 и 3, каждая, обозначают стандартный тромбин, линия 4 соответствует фракции до нанесения на колонку, линия 5 обозначает проходящую фракцию и линия 6 обозначает элюированную фракцию.

Фиг.45. Фотография, демонстрирующая характер электрофореза 205D тромбина в процессе очистки с использованием колонки с С-концевым пептидом гирудина. ДСН-ПААГ проводят после восстановления S-S связей и вестерн-блоттинг проводят с использованием поликлональных антител против человеческого тромбина для подтверждения характера полос. Линия 1 обозначает маркер, линии 2 и 3, каждая, обозначают стандартный тромбин, линия 4 соответствует фракции до нанесения на колонку, линия 5 обозначает протекающую фракцию и линия 6 обозначает элюированную фракцию.

Фиг.46. График, демонстрирующий эффект анти-PAR1 антитела на агрегацию тромбоцитов под действием 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «002» и «001» обозначают 1 мкг/мл М-тромбина и 1 мкг/мл М-тромбина + анти-PAR1 антитело соответственно.

Фиг.47. График, демонстрирующий связывающую специфичность производного 19А205А43А тромбина с Fbgn и FVIII. Прерывистая линия относится к 1,0×10^-7 М Fbgn и сплошная линия относится к 1,0×10^-7 М FVIII.

Фиг.48. Схематический рисунок, показывающий рост артериального тромба.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Ниже дано подробное описание настоящего изобретения.

1. Тромбин

Производное тромбина, используемое в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой такое производное тромбина, которое включает цепь А и цепь В и в котором замещена определенная аминокислота в цепи В. Производное тромбина, используемое в настоящем изобретении, конкретно не ограничивается, главное, чтобы оно могло формировать третичную структуру, в рамках которой А цепь и В цепь в живом организме будут связаны друг с другом через С-связи. А цепь и В цепь, каждая, образуются путем процессинга белка-предшественника тромбина, так что производное тромбина по настоящему изобретению может вводиться в живой организм в форме белка-предшественника, такого как претромбин или протромбин, с тем чтобы далее они подвергались процессингу в организме с образованием третичной структуры. При этом цепь А и цепь В могут быть раздельно получены с использованием методов генной рекомбинации, путем химического синтеза или т.п., и затем между ними могут быть образованы S-S связи in vitro, или они могут быть раздельно введены, с тем чтобы образовалась третичная структура, в соответствии с которой А цепь и В цепь соединены друг с другом в живом организме через S-S связи.

В контексте настоящего описания А цепь представляет собой участок, соответствующий аминокислотам с номерами 1-49 в SEQ ID NО: 2, в случае человеческого тромбина дикого типа. В цепь представляет собой участок, соответствующий аминокислотам с номерами 50-308 в SEQ ID NО: 2, в случае человеческого тромбина дикого типа.

В человеческом тромбине 13 аминокислотных остатков на N-конце А цепи выщепляется путем автолиза. При этом А цепь может представлять собой последовательность, в которой 13 аминокислотных остатков (то есть аминокислоты с номерами 1-13 в SEQ ID NО: 2) на N-конце А цепи отщеплены. Кроме того, белки-предшественники тромбина, такие как протромбин и претромбин, каждый из которых может образовать в живом организме третичную структуру, описанную выше, также входят в определение «производное тромбина» согласно настоящему изобретению. Аминокислотная последовательность человеческого тромбина дикого типа описана в базе данных Swissprot под номером P00734.

Производные тромбина, получаемые согласно настоящему изобретению, могут вводиться в живой организм в форме протромбина. В этом случае производные протромбина активируются с образованием тромбина, обладающего антитромботическим действием в тромботическом сайте, и антитромботический эффект проявляется в области, где образуется тромб, за счет чего достигается более целенаправленный антитромботический эффект в живом организме.

2. Активность по разложению субстрата тромбина

В том случае, когда производное тромбина по настоящему изобретению взаимодействует с фактором свертывания крови 13 (FXIII), с фибриногеном (Fbgn), c синтетическим субстратом (доступным от SIGMA), таким как S2238, с рецептором тромбина или субстратом тромбина, таким как белок C, в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 М NaCl, при 37°С в течение 3 ч, процент разложенного субстрата тромбина составляет 10% или менее. Поскольку активность по разложению субстрата тромбина находится в указанном диапазоне, активация тромбинового субстрата производным тромбина после введения его в живой организм с последующим метаболизмом производного тромбина не вызывает каких-либо проблем. Среди субстратов тромбина FXIII является относительно стабильным к нагреванию и может легко выявляться при электрофорезе, так что в настоящем изобретении предпочтительно использован FXIII. Разложение предпочтительно определяют при молярной концентрации производного тромбина относительно FXIII, равной 1:1 или более.

Наличие или отсутствие способностей по разложению субстрата тромбина может быть подтверждено выявлением полосы активированного субстрата при проведении электрофореза FXIII, и наличие или отсутствие фибриногена может быть подтверждено выявлением наличия или отсутствия небольшого количества фибриновых сгустков. В соответствии с методом оценки активности по разложению субстрата тромбина производное, которое было получено путем замещения аланина на глицин в положении 203 в цепи В и которое, в соответствии с непатентным документом 6 (Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186), полностью теряет свою активность, как было показано, все еще сохраняет активность по разложению субстрата тромбина.

Производные тромбина, получаемые согласно настоящему изобретению, имеют механизм антитромботического действия, отличный от механизма действия производных тромбина, описанных в патентном документе 3 (WO 95/13385), в непатентном документе 7 (J. Biol. Chem. Vol. 275, 39827-39830), в непатентном документе 8 (J. Biol. Chem. Vol. 279, 26387-26394) и в непатентном документе 9 (J. Biol. Chem. Vol. 277, 27581-27584). Иными словами, описанные в указанных документах производные тромбина обладают сохранившейся или улучшенной специфичностью в отношении ТМ и, таким образом, предпочтительно активируют белок С, проявляя при этом антитромботический эффект. С другой стороны, производное тромбина согласно настоящему изобретению не обладает способностью активировать субстрат тромбина, включая белок С. Производное тромбина согласно настоящему изобретению связывается более специфично с субстратом тромбина, что важно для тромбогенеза, без активации субстрата тромбина и ингибирует вызванную тромбином активацию указанных субстратов тромбина, которые присутствуют в крови, проявляя таким образом антитромботический эффект. Однако желательно, чтобы производное тромбина по настоящему изобретению не ингибировало ТМ-связывающую способность тромбина, имеющегося в живом организме, но обладало сниженной ТМ-связывающей активностью.

3. Замещение аминокислоты и модификация карбоксильной группы

Первый аспект настоящего изобретения относится к производному тромбина, в котором замещены одна или несколько аминокислот (аминокислот активного центра), выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина, при этом (1) доля субстрата тромбина, который был разложен производным тромбина при взаимодействии c субстратом тромбина в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 M NaCl, при температуре 37°С в течение 3 ч, составляет 10% или менее, и (2) сохраняется структура экзосайта I. Первый аспект настоящего изобретения относится к варианту, в котором проявляется антитромботический эффект, преимущественно определяемый эффектом увеличения показателя частичного активированного тромбопластинового времени (ЧАТВ), который становится равным или превосходит указанный показатель у ангидротромбина (AHT). Эффект по увеличению ЧАТВ оказывает безусловный эффект на повышение ЧАТВ, и на него не оказывает воздействие инкубация.

Второй аспект настоящего изобретения относится к производному тромбина, в котором также замещены аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра. Данное производное тромбина представляет собой такое производное, которое обладает улучшенной антитромботической способностью, определяемой сниженной способностью к связыванию с Fbgn, который присутствует в крови в больших количествах. Снижение связывающей способности с Fbgn позволяет осуществлять эффективное связывание с целевым субстратом тромбина, что ускоряет свертывание крови и тем самым ингибирует активацию субстрата тромбина.

Примеры субстрата тромбина, который ускоряет свертывание крови, включают FV, FVIII, FXI, рецептор тромбина (например, PAR1) и PAR4. Более предпочтительно осуществлять специфическое ингибирование рецептора тромбина или FVIII, с тем чтобы более эффективно повысить антитромботическую активность. В этой связи предпочтительный пример производного тромбина согласно настоящему изобретению представляет такое производное, у которого способность к связыванию с Fbgn относительно ниже, чем способность к связыванию с рецептором тромбина или FVIII и который, таким образом, может обеспечивать хороший антитромботический эффект даже в сниженной дозировке. Кроме того, дополнительное замещение аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, приводит к специфическому снижению способности связываться с ТМ без устранения антитромботического эффекта, осуществляемого производным тромбина согласно первому аспекту настоящего изобретения.

Кроме того, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения могут быть получены производные тромбина, которые в разных аспектах выражают данный эффект, такие как производное тромбина, имеющее высокий эффект по увеличению ЧАТВ, но низкий антитромбоцитарный эффект, и производное тромбина, которое имеет высокий эффект по увеличению ЧАТВ и высокий антитромбоцитарный эффект (только PAR1-ингибирующий эффект).

Примеры таких аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, включают: аминокислоты во фрагменте экзосайта I, такие как глютамин в положении 24, лизин в положении 65 и лизин 77 в цепи В тромбина; аминокислоты во фрагменте экзосайта II, такие как аргинин в положении 98, аргинин в положении 245, лизин в положении 248 и лизин в положении 252 в цепи В; и аминокислоты на участке, который не принадлежит ни одному из экзосайтов, такие как аргинин в положении 197 в цепи В и фенилаланин в положении 19 в цепи В.

Третий аспект настоящего изобретения относится к производному тромбина, получаемому путем модификации карбоксильных групп в производном тромбина согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения в соответствии с методом, описанным в патентном документе 2 (WO 01/077031). Производное тромбина не только увеличивает значение ЧАТВ, но придает или контролирует антитромбоцитарный эффект, в особенности ингибируя эффект активации PAR1 и агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, что определяется характером замещения аминокислот. Для достижения специфичности действия могут быть получены: производное тромбина, обладающее чрезвычайно высоким эффектом по увеличению ЧАТВ и мощным антитромбоцитарным эффектом; производное тромбина, обладающее умеренным уровнем эффекта по увеличению ЧАТВ и мощным антитромбоцитарным эффектом и т.п. Таким образом, в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения может быть получено производное тромбина, обладающее противосвертывающим эффектом на кровь и антитромбоцитарным эффектом, которые могут быть применены при разных видах тромбоза.

Далее, для облегчения понимания эффектов и возможностей использования аминокислотных замещений, настоящее изобретение описывается в двух отдельных частях: описывается вариант замещения аминокислот активного центра (первый аспект настоящего изобретения); вариант замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра (второй аспект настоящего изобретения); и вариант модификации карбоксильных групп (третий аспект настоящего изобретения).

Следует отметить, что производное тромбина согласно настоящему изобретению может представлять собой производное тромбина, имеющее аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот были замещены, удалены, встроены или добавлены в В цепь (аминокислоты с номерами 50-308 в SEQ ID NО: 2) в дополнение к конкретной аминокислоте, указанной выше, при условии, что эффект настоящего изобретения не изменяется. В данном контексте термин «несколько» означает 2-20, предпочтительно 2-10 и более предпочтительно 2-5. Производное тромбина согласно настоящему изобретению может представлять собой производное тромбина с аминокислотной последовательностью, в которой одна или несколько аминокислот были замещены, удалены, встроены или добавлены также в А цепь (аминокислоты с номерами 1-49 в SEQ ID NО: 2). В данном контексте термин «несколько» означает 2-10, предпочтительно 2-5 и более предпочтительно 2-3.

Кроме того, производное тромбина согласно настоящему изобретению может представлять собой такое производное, которое имеет дополнительную модификацию, такую как замещение, делецию, вставку или добавление в положении, отличном от аминокислот с номерами 1-49 в SEQ ID NО: 2 в А цепи и аминокислот с номерами 50-308 в SEQ ID NО: 2 в цепи В, при этом каждая из цепей имеет гомологию определенного уровня или выше, так что доля субстрата тромбина, который был разложен производным тромбина при взаимодействии субстрата тромбина в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 M NaCl, при температуре 37°С в течение 3 ч, составляет 10% или менее, и сохраняется структура экзосайта I. В контексте данного описания термин «гомология определенного уровня или выше» относится к гомологии, равной 80% или выше, предпочтительно 90% или выше и особенно предпочтительно 95% или выше.

Производное тромбина согласно настоящему изобретению получают путем конструирования ДНК, кодирующей каждое производное, с помощью сайт-направленного мутагенеза, включения ДНК в вектор или т.п., с последующей экспрессией ДНК в клетке млекопитающего или т.п. Такая ДНК может кодировать и А цепь, и В цепь, как описано выше, или каждая из цепей может экспрессироваться по отдельности. Метод сайт-направленного мутагенеза конкретно не ограничивается и может быть проведен с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit) (производство Stratagene) или т.п. Производное тромбина может быть также получено путем химического синтеза.

3-1. Замещение аминокислот активного центра; приведенное далее также будет также относиться к первому аспекту настоящего изобретения

Производное тромбина согласно настоящему изобретению представляет собой такое производное тромбина, в котором одна или несколько аминокислот (аминокислот активного центра) выбраны из группы, состоящей из серина в положении 205 (положение 205 в цепи В; серина, соответствующего серину в положении 254 в SEQ ID NО: 2), глицина в положении 203 (положение 203 в цепи В; глицина, соответствующего глицину в положении 252 в SEQ ID NО: 2), гистидина в положении 43 (положение 43 в цепи В; гистидина, соответствующего гистидину в положении 92 в SEQ ID NО: 2), и аспарагиновой кислоты в положении 99 (положение 99 в цепи В; аспарагиновой кислоты, соответствующей аспарагиновой кислоте в положении 148 в SEQ ID NО: 2) в цепи В тромбина.

В контексте настоящего описания термины «положение 205 в цепи В», «положение 203 в цепи В» и т.п. относятся, каждый, к номеру аминокислоты, отсчитываемой с первой аминокислоты в цепи В, например изолейцин с аминокислотным номером 50 в SEQ ID NО: 2. Положение замещенной аминокислоты в соответствии с приведенным выше описанием может быть сдвинуто назад или вперед в зависимости от наличия делеции, вставки, добавления или т.п. аминокислоты. Например, в том случае, когда остаток аминокислоты вводят на N-конец, сериновый остаток, который первоначально имелся в положении 205, становится 206 остатком. В настоящем изобретении такой сериновый остаток соответствует сериновому остатку в положении 205 и также будет называться как сериновый остаток в положении 205.

Для того, чтобы производное тромбина по настоящему изобретению проявляло эффект настоящего изобретения, структура экзосайта I, имевшаяся в тромбине до замещения, должна сохраняться даже после проведения замещения аминокислот активного центра.

Экзосайт I в тромбине рассматривается как фрагмент, который играет важнейшую роль в связывании со многими субстратами тромбина, каждый из которых вовлекается в тромбогенез, воспалительную реакцию или т.п. (Journal of Biological Chemistry, 1989, Vol, 264, 8692-8698). Известно, что С-концевой пептид гирудина специфически связывается с экзосайтом I (Journal of Biological Chemistry, 1991, Vol, 266, 23633-23636). В частности, сообщается, что рецептор тромбина, который играет важную роль в тромбогенезе, определяемую активацией тромбоцитов, обладает высокой гомологией с фрагментом С-конца гирудина и в значительной степени связывается с экзосайтом I. В этой связи считается, что производное тромбина, потерявшее связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина, имеет нарушенную структуру экзосайта I, вследствие чего связывающая способность со многими субстратами тромбина, включая рецептор тромбина, теряется. Соответственно в первом аспекте настоящего изобретения подтверждение наличия или отсутствия связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина (например, SEQ ID Nо: 3) используется на первой стадии скрининга для подтверждения факта сохранения структуры экзосайта I или наоборот.

Подтверждение наличия связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина может быть получено при определении коэффициента связывания производного тромбина с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле, как описано в приведенных ниже примерах.

Производное тромбина согласно настоящему изобретению предпочтительно сохраняет связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина. Предпочтительный пример производного тромбина согласно настоящему изобретению включает производное тромбина, которое при добавлении в реакционную систему связывается в количестве 10% или более, предпочтительно 50% или более, с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле, в условиях, благоприятствующих реакции с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле.

Следует отметить, что определение коэффициента связывания производного тромбина с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле, проводят только для подтверждения того, что структура экзосайта I сохраняется или нет, до или после замещения аминокислоты активного центра. В этой связи во втором аспекте настоящего изобретения, в том случае, когда также проводят замещение аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, FVIII-связывающая способность может сохраняться, а связывающая способность с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле, может быть потеряна или значительно снижена в связи с таким дополнительным замещением аминокислоты, даже если структура экзосайта I сохраняется.

Кроме того, производное тромбина согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой такое производное, которое не теряет гепарин-связывающей способности при замещении аминокислот активного центра. Производное тромбина, которое сохраняет гепарин-связывающую способность на 80% или более относительно гепарин-связывающей способности тромбина до замещения аминокислот активного центра, является более предпочтительным. Активный центр в третичной структуре тромбина локализован в области, удаленной от сайта связывания с гепарином или экзосайта II. Иными словами, тот факт, что гепарин-связывающая способность устраняется при замещении аминокислот активного центра, означает, что замещение аминокислот активного центра приводит к структурной аномалии по всей молекуле тромбина, что приводит к разрушению структуры гепарин-связывающего участка, который локализован в положении, удаленном от активного центра. Структурная аномалия, распространяющаяся на всю молекулу, означает снижение связывающей способности с субстратом тромбина.

В настоящем изобретении замещение аминокислот активного центра представляет собой предпочтительно замещение 2 или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина. Замещения аминокислот активного центра более предпочтительно включают замещение по меньшей мере серина в положении 205 и особенно предпочтительно включают замещения по меньшей мере серина в положении 205 и гистидина в положении 43.

Глицин в положении 203 в цепи В предпочтительно замещается любой одной аминокислотой из аланина, серина и треонина. Аспарагиновая кислота в положении 99 предпочтительно замещается аспарагином. Гистидин в положении 43 предпочтительно замещается аланином, серином или аспарагином.

Серин в положении 205 в цепи В предпочтительно замещается аланином, треонином или глицином. Из них замещение аланином является особенно предпочтительным, поскольку структура экзосайта I в значительной мере нарушается.

В том случае, когда замещения аминокислот активного центра представляют собой замещения серина в положении 205 и гистидина в положении 43, предпочтительно производное, в котором серин в положении 205 замещается аланином, глицином или треонином и гистидин в положении 43 замещается аланином или серином, и особенно предпочтительным является производное, в котором и серин в положении 205 и гистидин в положении 43 замещаются аланином.

Далее, замещение аминокислот активного центра в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения будет проиллюстрировано с помощью конкретных примеров. В том случае, когда замещения аминокислот активного центра представляют собой замещение 2 или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина, сочетание 2 или более аминокислот, подлежащих замещению (сайты замещения), и вид аминокислот, служащих в качестве партнеров-заместителей, могут создать различия в способности связываться с субстратом тромбина и в антитромботическом эффекте. Для пояснения ниже дается описание, в котором в качестве примера используются производные тромбина 1-7.

Таблица 1
	Сайт замещения (аминокислота активного центра)
205 Ser	203 Gly	99 Asp	43 His
Производное тромбина 1	Ala	-	Asn	-
Производное тромбина 2	Ala	-	-	Ala
Производное тромбина 3	Gly	Ala	-	-
Производное тромбина 4	Ala	Ala	-	-
Производное тромбина 5	Ala	Ala	Asn	-
Производное тромбина 6	Gly	-	-	Ala
Производное тромбина 7	Ala	-	-	Ser

Производное тромбина 1: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 22), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205 и по аспарагиновой кислоте в положении 99 в цепи В и в котором серин замещается аланином, а аспарагиновая кислота замещается аспарагином.

Производное тромбина 2: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 26), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205 и по гистидину в положении 43 в цепи В и в котором серин замещается аланином и гистидин замещается аланином.

Производное тромбина 3: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 8), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205 и по глицину в положении 203 в цепи В и в котором серин замещается глицином и глицин замещается аланином.

Производное тромбина 4: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 24), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205 и по глицину в положении 203 в цепи В и в котором серин и глицин, каждый, замещается аланином.

Производное тромбина 5: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 14), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205, по глицину в положении 203 и по аспарагиновой кислоте в положении 99 в цепи В и в котором серин и глицин, каждый, замещается аланином и аспаргиновая кислота замещается аспаргином.

Производное тромбина 6: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 34), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205 и по гистидину в положении 43 в цепи В и в котором серин замещается глицином и гистидин замещается аланином.

Производное тромбина 7: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 36), которое имеет сайты замещения по серину в положении 205 и по гистидину в положении 43 в цепи В и в котором серин замещается аланином и гистидин замещается серином.

Каждый из производных тромбина 1-7 сохраняет способность связываться с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле. Однако производные тромбина 4 и 5, каждое, имеют сниженную способность связываться с гепарином в геле в сравнении со способностью человеческого тромбина дикого типа.

Каждое из производных тромбина 1-7 обладает антитромботическим эффектом, преимущественно включающим эффект по увеличению ЧАТВ, и порядок этих эффектов описан ниже.

Производное тромбина 2 > производные тромбина 6 и 7 > производные тромбина 1 и 3 > > производные тромбина 4 и 5

Производные тромбина 2, 6 и 7, каждое, демонстрируют чрезвычайно высокий антитромботический эффект, независимо от наличия или отсутствия модификации карбоксильной группы, как будет описано ниже. Кроме того, антитромботический эффект, наблюдаемый в случае производного тромбина 2, имеет специфическое приложение на каскад реакции свертывания крови и, таким образом, характеризуется также особенно увеличенным ЧАТВ. Далее, производное тромбина, получаемое при модификации карбоксильной группы в производном тромбина 2, обладает привнесенной или усиленной антитромбоцитарной способностью и, в этой связи, оказывает эффект по ингибированию каскада реакций свертывания крови, агрегации тромбоцитов и адгезии тромбоцитов.

Производные 2 и 4 тромбина, каждое, содержат серин в положении 205, замещенный аланином, но они обладают значительными различиями по антитромботическому действию, как описано выше. Аналогично, производные тромбина 3 и 4, каждое, содержат глицин в положении 203, замещенный аланином, и обладают значительными различиями по антитромботическому действию, как описано выше.

Производные тромбина 1 и 3, каждое, не демонстрируют такого сильного антитромботического эффекта. Однако модификации их карбоксильных групп, как будет описано ниже, вызывают изменения в их субстратной специфичности или вызывают замещение аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, таких как лизин в положении 77 в цепи В, что специфически снижает связывающую способность с Fbgn и относительно улучшает специфичность к FVIII, приводя тем самым к тому, что производное тромбина демонстрирует один или оба мощных эффекта, включающих мощный эффект по увеличению ЧАТВ и мощный эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов. Специфичные эффекты по увеличения ЧАТВ и антитромбоцитарные эффекты (то есть в отношении агрегации и адгезии) достигаются в случае модификации карбоксильных групп, а производное тромбина, обладающее лишь эффектом по увеличению ЧАТВ, получают в случае замещения аминокислоты в положении 77 в цепи В.

Соответственно производные тромбина 4 и 5, каждое, обладают слабым антитромботическим эффектом, даже в случае модификации карбоксильных групп или в том случае, когда проводят замещение аминокислоты в положении 77 в цепи В. Производные тромбина 6 и 7, каждое, демонстрируют антитромботический эффект, аналогичный эффекту, наблюдаемому у производного тромбина 2.

Как показано в настоящем изобретении и как это известно в настоящей области, производные тромбина, каждое, получаемое путем замещения любого из остатков: серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина, классифицируются по следующим группам.

А. Производное тромбина, обладающее антитромботическим эффектом, которое преимущественно включает мощный эффект по увеличению ЧАТВ, как и производное тромбина, получаемое путем замещения серина в положении 205 и гистидина в положении 43, даже без модификации карбоксильных групп и/или без замещения аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, для снижения Fbgn-связывающей способности.

B. Производное тромбина, которое не демонстрирует такого мощного антитромботического эффекта, как производное тромбина, получаемое при замещении аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и серина в положении 205, но которое оказывает высокий антитромботический эффект при модификации карбоксильных групп и/или при замещении аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, для снижения Fbgn-связывающей способности.

C. Производное тромбина, у которого утеряна активность по разложению субстрата тромбина, но которое не демонстрирует мощного антитромботического эффекта, даже при модификации карбоксильных групп и/или при замещении аминокислоты, для снижения Fbgn-связывающей способности.

D. Производное тромбина, которое демонстрирует антитромботический эффект, но не может использоваться в качестве антитромботического агента в связи с наличием у него остаточной активности.

Принадлежность к группе А подтверждается по связывающей способности с Fbgn и FVIII, и было показано, что каждый представитель данной группы обладает улучшенной способностью к связыванию с FVIII. В этой связи считается, что высокий эффект по увеличению ЧАТВ в данной группе связан с потерей активности по разложению субстрата тромбина, вызванной сочетанием замещения аминокислот активного центра и в то же время относительным и специфическим повышением способности к связыванию с FVIII (относительное снижение Fbgn-связывающей способности). Для указанных производных тромбина был также подтвержден более слабый антитромбоцитарный эффект в связи со сниженной Fbgn-связывающей способностью, даже без модификации карбоксильных групп. Кроме того, данный эффект представляет собой эффект по ингибированию PAR1-активации, не сопровождаемой эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

Степень относительного и специфического усиления связывающей способности с FVIII, вызванного замещением аминокислот активного центра, определяют применительно к сочетанию конкретных позиций замещения, как указывалось выше. В основном, антитромботическая способность производного тромбина согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем снижения Fbgn-связывающей способности при сохранении связывающей способности с субстратом тромбина, что способствует ускорению реакции свертывания крови. Дополнительно, в том случае, когда VIIIA/FA, соотношение между FVIII-связывающей способностью (VIIIA) и Fbgn-связывающей способностью (FA) полученного производного тромбина в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между FVIII-связывающей способностью (VIIIa) и Fbgn-связывающей способностью (Fа) у AHT, достигается высокий антитромботический эффект, а в том случае, когда указанное соотношение составляет 1,2 раза или более, достигается чрезвычайно высокий антитромботический эффект.

Производное тромбина, содержащее замещение аминокислот в активном центре, обладает FVIII-связывающей способностью, сохраненной предпочтительно на уровне 10% или более предпочтительно 80% или выше относительно ангидротромбина.

Предпочтительный пример производного тромбина, имеющего замещение аминокислот в активном центре, включает производное, характеризующееся показателем частичного активированного тромбопластинового времени (ЧАТВ), который в 1,1 раза или более превышает соответствующий показатель для ангидротромбина (AHT).

Кроме того, сочетание замещений аминокислот в активном центре приводит к появлению различий в самой FVIII-связывающей способности, а также создает относительные и специфические изменения в Fbgn-связывающей способности, FVIII-связывающей способности и т.п. Производные тромбина 2, 6 и 7, каждое, демонстрируют высокую FVIII-связывающую способность, эквивалентную таковой у AHT. С другой стороны, у каждого из других производных тромбина сама по себе FVIII-связывающая способность снижается. Таким образом, группа А обладает высокой FVIII-связывающей способностью и характеризуется повышенным соотношением FVIII-связывающей способности относительно Fbgn, и оба указанных эффекта в сочетании обеспечивают высокий антитромботический эффект.

Более предпочтительный пример производного тромбина согласно настоящему изобретению имеет Fbgn-связывающую способность, которая снижена на 10% или более в связи с замещениями аминокислот активного центра, так что эффект по увеличению ЧАТВ повышается в 1,1 раза или более.

В третичной структуре сайт активного центра тромбина удален от экзосайта I и экзосайта II, которые представляют собой сайты связывания С-концевого пептида гирудина и гепарина соответственно. Ввиду такой третичной структуры тромбина полагают, что производное тромбина, обладающее сниженной связывающей способностью с гепарином, определяемой сочетанием замещений аминокислот активного центра, а также производное тромбина, имеющее сниженную связывающую способность с С-концевым пептидом гепарина, иммобилизованным в геле, определяемую замещениями аминокислот активного центра, как показано выше, содержат, каждое, аномалию в складчатой структуре и структурную аномалию, распространяющуюся на всю молекулу, которые вызваны неблагоприятным замещением (то есть замещением, способным оказывать нагрузку на структуру) аминокислоты активного центра. Кроме того, аномалии могут иметь место в структуре экзосайта I или в структуре экзосайта II. Соответственно считается, что снижение связывающей способности с субстратом тромбина ведет к снижению антитромботического эффекта.

3-2. Замещение аминокислот, за исключением аминокислот активного центра; описываемое ниже в контексте «второго аспекта настоящего изобретения»

Ниже описано получение производного тромбина путем дополнительного замещения аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, в частности аминокислот, которые имеются во фрагменте экзосайта I и/или экзосайта II, для улучшения антитромботического эффекта, согласно первому аспекту настоящего изобретения. Замещение аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, может снижать связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле, или с гепарином. Однако указанное снижение является результатом прямого замещения аминокислот в указанных фрагментах и, исходя их этого, отличается от снижения связывающей способности за счет структурных аномалий во всем белке, вызванных замещением аминокислот активного центра.

Производное тромбина согласно второму аспекту настоящего изобретения представляет собой производное, имеющее дополнительно усиленный антитромботический эффект, достигаемый при снижении связывающей способности с Fbgn, который присутствует в крови в больших количествах.

Снижение Fbgn-связывающей способности позволяет производному тромбина эффективно связываться с целевым субстратом тромбина, что способствует свертыванию крови и, тем самым, ингибирует активацию субстрата тромбина.

Примеры субстрата тромбина, который ускоряет свертывание крови, включают FV, FVIII, FXI, рецептор тромбина (PAR1) и PAR4. Более предпочтительно специфически ингибировать рецептор тромбина или FVIII, с тем чтобы более эффективно усилить антитромботическую способность.

Таким образом, производное тромбина по настоящему изобретению представляет собой производное тромбина, которое обладает Fbgn-связывающей способностью, которая относительно ниже, чем связывающая способность с рецептором тромбина или FVIII, и которое может обеспечивать хороший антитромботический эффект даже в сниженной дозировке. Дополнительно, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, связывающая способность с ТМ может специфически снизиться без существенного ухудшения антитромботического эффекта, осуществляемого производным тромбина, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Таким образом, в настоящем изобретении при селективном снижении ТМ-связывающей способности производное тромбина по настоящему изобретению не связывается с ТМ и, таким образом, не ингибирует активацию белка С тромбином, даже в том случае, когда производное тромбина вводят в живой организм.

Поскольку ТМ не является субстратом, он не взаимодействует с активным центром тромбина. В этой связи трудно специфически снизить ТМ-связывающую активность в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Тем не менее, антитромботическая способность, усиленная в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, также применима ко второму аспекту настоящего изобретения, что определяется привнесением характеристик, таких как повышенный антитромботический эффект или субстратная специфичность.

Производное тромбина в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предпочтительно обладает сниженной Fbgn-связывающей способностью. Кроме того, производное тромбина предпочтительно обладает относительно низкой Fbgn-связывающей способностью в сравнении со связывающей способностью с рецептором тромбина или FVIII. В варианте достижения специфичности VIIIА/FA, соотношение между FVIII-связывающей способностью (VIIIA) и Fbgn-связывающей способностью (FA), предпочтительно в 1,1 раза или выше или, более предпочтительно, превышает в 1,5 раз или более VIIIа/Fa, соотношение между FVIII-связывающей способностью (VIIIa) и Fbgn-связывающей способностью (Fa), характерное для производного тромбина до замещения аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра.

Далее, производное тромбина в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предпочтительно обладает специфически сниженной связывающей способностью с ТМ. В варианте достижения специфичности VIIIА/ТМA, соотношение между FVIII-связывающей способностью (VIIIA) и ТМ-связывающей способностью (ТМA), предпочтительно в 1,1 раза или выше, или, более предпочтительно, в 1,5 раз или более превышает VIIIа/ТМa, соотношение между FVIII-связывающей способностью (VIIIa) и ТМ-связывающей способностью (ТМa), характерное для производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

Кроме того, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения могут быть получены производные тромбина, оказывающие различные эффекты, например, такие, как производное тромбина, которое оказывает высокий эффект по увеличению ЧАТВ, но имеющее низкий антитромбоцитарный эффект, и производное тромбина, которое оказывает высокий эффект по увеличению ЧАТВ и высокий антитромбоцитарный эффект (только PAR1-ингибирующий эффект).

Замещение аминокислоты за пределами активного центра специфически не ограничивается, главное, чтобы были достигнуты описанные выше эффекты. Конкретные примеры замещения включают замещение аминокислоты во фрагменте экзосайта I или экзосайта II и замещение в другом участке производного тромбина, которое взаимодействует с фибриногеном или ТМ.

Фрагмент экзосайта I тромбина известен как аминокислотный участок, который обогащен основными элементами и который специфически взаимодействует с С-концевым участком гирудина, и рассматривается как важный участок, который взаимодействует с Fbgn, рецептором тромбина, ТМ и т.п. (E. Di Cera, Thrombin Interactions Chest, 2003; 124 (90030): 11-17). В настоящем изобретении предпочтительно осуществляют замещение одной или нескольких аминокислот, выбранных из основных аминокислот. Более предпочтительно, проводят замещение одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глютамина в положении 24 (то есть В цепь 24; что соответствует глютамину в положении 77 в SEQ ID NO: 2), лизина в положении 65 и лизина в положении 77 (то есть В цепь 77; что соответствует лизину в положении 126 в SEQ ID NO: 2) в цепи В. Аминокислота, замещающая лизин в положении 77, глютамин в положении 24 или лизин в положении 65, конкретно не ограничивается, но предпочтительно это аланин, серин, треонин, глютаминовая кислота или глютамин.

Фрагмент экзосайта II рассматривается как аминокислотный участок, который обогащен основными элементами и который преимущественно взаимодействует с гепарином (E. Di Cera, Thrombin Interactions Chest, 2003; 124 (90030): 11-17). В настоящем изобретении предпочтительно проводят замещение одной или нескольких аминокислот, выбранных из основных аминокислот. Более предпочтительно, проводят замещение одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина в положении 98 (то есть аргинина, соответствующего аргинину в положении 147 в SEQ ID NO: 2), аргинина в положении 245 (то есть аргинина, соответствующего аргинину в положении 294 в SEQ ID NO: 2), лизина в положении 248 (то есть лизина, соответствующего лизину в положении 297 в SEQ ID NO: 2) и лизина в положении 252 (то есть лизина, соответствующего лизину в положении 301 в SEQ ID NO: 2) в цепи В тромбина. Примеры аминокислот, замещающих аргинин в положении 98, аргинин в положении 245, лизин в положении 248 и лизин в положении 252 соответственно, включают аланин и т.п., но конкретно не ограничиваются, при условии, что при этом может быть получено интересующее производное.

Относительно снижения гепарин-связывающих способностей, в том случае, когда снижение гепарин-связывающей способности вызвано замещением за пределами гепарин-связывающего участка (например, во фрагменте экзосайта II или т.п.), например замещением аминокислот активного центра, полагают, что замещение дает побочный эффект, такой как неправильная ориентация или т.п., по всей молекулярной структуре производного тромбина и также в третичной структуре экзосайта II, что ведет к снижению гепарин-связывающей способности.

При этом, в случае введения в живой организм, аминокислота активного центра может быть замещена, в соответствии с оптимальной комбинацией, описанной в настоящем изобретении, и затем аминокислота, за исключением аминокислот активного центра, которая представляет собой аминокислоту, локализованную в экзосайте II, такую как аргинин в положении 98 в цепи В, аргинин в положении 245 в цепи В или лизин в положении 248 в цепи В, может быть позитивно замещена другой аминокислотой, такой как аланин, что определяется поставленной целью, с получением производного тромбина, обладающего сниженной гепарин-связывающей способностью. Ожидается, что связывающая способность с гепарансульфатом или т.п. на эндотелиальной клетке сосуда снижается при использовании производного, обладающего сниженной гепарин-связывающей способностью, что увеличивает его количество, циркулирующее в крови.

Такое производное тромбина, которое вводят с наличием аминокислотных замещений во фрагменте экзосайта II, в дополнение к замещению аминокислот активного центра предпочтительно обладает величиной связывающей способности с гепариновым гелем до 90% или менее относительно тромбина до замещения аминокислот во фрагменте экзосайта II.

Примеры такого производного тромбина включают: производное тромбина (например, последовательность аминокислот с номерами от 44-351 в SEQ ID NO: 54), в котором серин в положении 205, гистидин в положении 43 и лизин в положении 65, каждый, замещены аланином и аргинин в положении 245 дополнительно замещен аланином; и производное тромбина (например, последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 56), в котором серин в положении 205, гистидин в положении 43 и лизин в положении 65, каждый, замещены аланином и лизин в положении 248 дополнительно замещен аланином. Каждое из указанных производных обладает эффектом по увеличению ЧАТВ и характеризуется относительно сниженной афинностью к гепарину, в сравнении с человеческим гепарином дикого типа, определяемой замещением аминокислот в экзосайте II.

В документах WO 2002/004008 и WO 2002/007748 описано, что тромбин посылает множественный сигнал различным клеткам, независимо от гидролиза до PAR, через участок Arg-Gly-Asp-Ala (то есть от положения 197 до положения 200 в цепи В тромбина: участок, соответствующий положению 246-249 в SEQ ID NО: 2), а также отмечается, что последовательность Arg-Gly-Asp-Ala в целом необходима для прохождения сигнала. В случае использования производных, полученных в соответствии с настоящим изобретением, множественный клеточный сигнал не является обязательным, и в этой связи аминокислота в последовательности Arg-Gly-Asp-Ala может быть замещена, как и любая другая аминокислота. Например, производное (то есть последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 48), в котором аргинин в положении 197 (то есть аргинин, соответствующий аргинину в положении 246 в SEQ ID NО: 2), серин в положении 205 и гистидин в положении 43 в цепи В, как описано в экспериментальном примере 25, каждый, замещен аланином, обладает относительно высокой способностью по увеличению ЧАТВ, в сравнении с производным, в котором серин в положении 205 и гистидин в положении 43, каждый, замещены аланином. Считается, что указанное производное теряет способность передавать клеточный сигнал через последовательность Arg-Gly-Asp-Ala.

В этой связи фенилаланин в положении 19 (то есть фенилаланин, соответствующий фенилаланину в положении 68 в SEQ ID NО: 2) в цепи В может быть замещен. Пример такого производного тромбина включает производное тромбина (то есть последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 58), в котором серин в положении 205, гистидин в положении 43 и фенилаланин в положении 19, каждый, замещены аланином.

Производное тромбина в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения более предпочтительно имеет значение частично активированного термопластинового времени, увеличенное в 1,5 раза или более, и тромбомодулин-связывающую способность, сниженную до 50% или менее, за счет замещения аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра.

Производное тромбина в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения более предпочтительно демонстрирует по меньшей мере один или несколько видов усиленного антитромботического эффекта, выбранного из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной модифицированным тромбином, и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

Ниже вариант замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, согласно второму аспекту настоящего изобретения поясняется с помощью конкретных примеров.

Конкретный пример 1: эффект производного тромбина 3 по увеличению ЧАТВ (производное тромбина, в котором глицин в положении 203 и серин в положении 205 замещены аланином и глицином соответственно), рассматриваемого в качестве конкретного примера в описании первого аспекта настоящего изобретения, не очень высокий. С другой стороны, производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 28), в котором лизин в положении 77 замещен глютаминовой кислотой, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, для получения производного тромбина 3, обладает сниженной Fbgn-способностью и относительно увеличенной FVIII-связывающей способностью, в сравнении с Fbgn-связывающей способностью, что ведет к более высокому эффекту по увеличению ЧАТВ.

Конкретный пример 2: производное тромбина 2 (производное тромбина, в котором серин в положении 205 и гистидин в положении 43, каждый, замещены аланином), рассматриваемое в качестве конкретного примера в описании первого аспекта настоящего изобретения, обладает высоким эффектом по увеличению ЧАТВ. Производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 38, 44 или 50), в котором лизин в положении 77 замещен глютаминовой кислотой, аланином или серином, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, для получения производного тромбина 2, демонстрирует еще более сильный эффект по увеличению ЧАТВ. Таким образом, считается, что изменение в специфичности связывания с субстратом тромбина, которое вызывает замещение аминокислот активного центра, и изменение в специфичности связывания с субстратом, вызываемое замещением аминокислотой, за исключением аминокислот активного центра, оказывает синергический эффект на эффективность лекарственного средства.

Конкретный пример 3: производное тромбина (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 40), в котором глютамин в положении 24 был замещен глютаминовой кислотой, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, для получения производного тромбина 2, обладает эффектом по увеличению ЧАТВ и значительно сниженной ТМ-связывающей способностью.

Конкретный пример 4: производное (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 46), в котором лизин в положении 25 замещен аланином, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, для получения производного тромбина 2, демонстрирует двойной эффект по увеличению ЧАТВ и значительному снижению ТМ-связывающей способности. Замещение лизина в положении 65 в экзосайте I аланином приводит к некоторому снижению связывающей способности с гелем гирудина. Однако FVIII-связывающая способность сохраняется, а специфичность к FVIII относительно Fbgn повышается.

Конкретный пример 5: производное (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 52), в котором лизин в положении 25 и лизин в положении 77, каждый, замещены аланином, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, для получения производного тромбина 2, демонстрирует чрезвычайно высокий синергический эффект на увеличение ЧАТВ, определяемый замещениями аминокислот в двух положениях.

Конкретный пример 6: производное (последовательность аминокислот с номерами 44-351 в SEQ ID NО: 54), в котором лизин в положении 65 и аргинин в положении 245, каждый, замещен аланином, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, для получения производного тромбина 2, обладает эффектом по увеличению ЧАТВ и демонстрирует сниженную гепарин-связывающую способность.

Как указывалось выше, могут быть получены производные тромбина, обладающие различными характеристиками, при проведении, в дополнение к замещению аминокислот активного центра, замещения другой аминокислоты, в частности аминокислоты во фрагменте экзосайта I или во фрагменте экзосайта II.

3-3. Модификация карбоксильной группы. Третий аспект настоящего изобретения

Карбоксильную группу в производном тромбина в соответствии с первым и вторым аспектами настоящего изобретения модифицируют по методу, описанному в патентном документе 2 (WO 02/077031), для снижения Fbgn-связывающей способности и повышения селективности к субстратам тромбина, таким как рецептор тромбина, с достижением антитромботического эффекта, даже в малых количествах.

Дополнительно, повышается не только ЧАТВ, но также антитромбоцитарный эффект, в особенности ингибирующий эффект на активацию PAR1, и воздействие на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином (за счет взаимодействия между GPIb и vWF), могут быть добавлены и поставлены под контролем, в зависимости от вида аминокислотного замещения. Для достижения специфичности может быть получено производное тромбина, которое обладает чрезвычайно сильным эффектом по увеличению ЧАТВ и мощным антитромбоцитарным эффектом, производное, оказывающее умеренный эффект по увеличению по ЧАТВ и мощный антитромбоцитарный эффект и т.п. Иными словами, карбоксильная группа в производном тромбина по настоящему изобретению может быть модифицирована с получением производного тромбина, обладающего антикоагуляционным эффектом на кровь и антитромбоцитарным эффектом, и которое в этой связи может быть применено при различных тромбозах.

В том случае, когда карбоксильную группу в производном тромбина по настоящему изобретению модифицируют по методу, описанному в патентном документе 2 (WO 02/077031), предпочтительно осуществляют модификацию карбоксильной группы с помощью карбодиимида.

Карбоксильная группа в производном тромбина согласно настоящему изобретению может быть модифицирована соединением, имеющим аминогруппу. Указанное соединение с аминогруппой конкретно не ограничивается, однако его предпочтительные примеры включают сложные эфиры аминокислот и полиэтиленгликоль, имеющий аминокислоту в боковой цепи. Пример сложного эфира аминокислоты включает сложный глицинэтиловый эфир. Модификация с помощью соединения, содержащего аминогруппу, может быть также проведена по методике, описанной в WO 02/077031. С другой стороны, производное тромбина по настоящему изобретению может быть подвергнуто реакции с полиэтиленгликолем для модификации карбоксильной группы. В случае использования полиэтиленгликоля, содержащего аминогруппу, молекулярная масса полиэтиленгликолевого фрагмента составляет предпочтительно 1000 или менее.

Следует отметить, что в случае проведения модификации карбоксильной группы ее эффект может варьироваться в зависимости от числа модификаций. Для достижения приведенных в настоящем описании эффектов указанных ниже модифицированных продуктов 1-5 предпочтительно, чтобы карбоксильные группы были модифицированы в трех или более положениях. В том случае, когда количество карбоксильных групп, подвергаемых модификации, составляет три или более, может быть получен явный эффект, определяемый модификацией карбоксильной группы. При этом количество карбоксильных групп, подлежащих модификации, составляет желательно 25 или менее. В том случае, когда количество модифицированных карбоксильных групп составляет 25 или менее, аналогичным образом может быть получен эффект, достигаемый модификацией карбоксильных групп, и в то же время может иметь место снижение выхода за счет трудностей процесса модификации. Производное тромбина, получаемое при введении или делеции карбоксильной группы при замещении аминокислоты на поверхности производного тромбина, не включает увеличение или уменьшение количества карбоксильных групп, имеющее место при замещении.

Кроме того, получают производное, оказывающее различные эффекты, в зависимости от количества модификаций. Например, в том случае, когда число сайтов модификации в описанном ниже модифицированном продукте 1 снижается с 8 до 5, может быть получено производное, оказывающее чрезвычайно высокий эффект по увеличению ЧАТВ и антитромбоцитарный эффект от умеренного до сниженного.

В том случае, когда карбоксильные группы модифицируют согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы модификация проводилась по меньшей мере по карбоксильной группе в глютаминовой кислоте в положении 25 В цепи. Производное тромбина по настоящему изобретению, в котором карбоксильная группа модифицирована, представляет собой предпочтительно производное тромбина, которое обладает усиленной способностью по ингибированию агрегации, вызванной ристоцетином, и/или обладает GPIb -антагонизирующей способностью относительно тромбоцитов.

Эффект, достигаемый при замещении аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, по повышению антитромботического эффекта, и эффект, достигаемый за счет модификации карбоксильной группы, очень широко варьируется, в зависимости от сочетания аминокислот, подвергаемых замещению, или т.п. В зависимости от заболевания и клинического состояния или в зависимости от конкретных целей может использоваться производное тромбина, в которое введено одно только замещение по аминокислоте, или производное тромбина, в котором модификация карбоксильной группы объединена с замещением аминокислоты.

Иными словами, в случае тромбоза вен, такого как тромбоз глубоких вен, в основном используют лекарственное средство, которое ингибирует свертывание крови. В этой связи желательно использовать производное тромбина, оказывающее высокий эффект по увеличению ЧАТВ, выбранное из соответствующих производных тромбина и соответствующих его продуктов с модифицированной карбоксильной группой.

При этом лекарственное средство, которое ингибирует агрегацию тромбоцитов, используют в основном в случае тромбоза в артериальной системе, такого как инфаркт миокарда и нестабильная стенокардия, поскольку желательно, чтобы в этом случае каждое из производных тромбина обладало высоким эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов. Среди них должны быть выбраны такие производные тромбина, которые оказывают различные эффекты по увеличению ЧАТВ в зависимости от наличия побочных реакций, таких как кровотечение.

Кроме того, сообщается, что важно осуществлять ингибирование свертывающей системы крови, а также тромбоцитов в случае тромбоза, сопровождающегося раскрытием бляшки в сайте атеросклероза («Thrombosis», Nankodo Co., Ltd.), и в этой связи ингибирование и тромбоцитов, и свертывания крови будут эффективны. В настоящее время отсутствует коммерчески доступное лекарственное средство, которое бы действовало и на свертывающую систему крови, и на тромбоциты, как что настоящее изобретение предлагает радикально новый терапевтический агент.

Далее с помощью конкретных примеров описывается взаимосвязь между замещением аминокислот активного центра и аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, и модификацией карбоксильной группы. Приведенные ниже отдельные примеры описывают производные, в которых модифицированы примерно 15 карбоксильных групп, что достигается с использованием водорастворимого карбодиимида в качестве конденсирующего агента и при модификации сложным глицинэтиловым эфиром.

Модифицированный продукт 1: производное тромбина, в котором серин в положении 205 и гистидин в положении 43, каждый, замещены аланином, обладает чрезвычайно высоким эффектом по увеличению ЧАТВ, без модификации карбоксильной группы. В производном тромбина осуществляют модификацию карбоксильной группы, получая производное тромбина, которое обладает повышенным до определенной степени эффектом по увеличению ЧАТВ и высоким эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, а также эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином, что приводит к чрезвычайно высоким эффектам в плане антикоагулирующего и антитромбоцитарного воздействия.

Модифицированный продукт 2: производное тромбина, в котором серин в положении 205 замещен глицином и глицин в положении 203 замещен аланином, не обладает ни высоким эффектом по увеличению ЧАТВ, ни антитромбоцитарным эффектом до модификации карбоксильной группы. Однако модификация карбоксильной группы повышает эффект по увеличению ЧАТВ и антитромботический эффект, приводя к образованию производного тромбина, которое обладает умеренным эффектом по ингибированию ЧАТВ и высоким антитромбоцитарным эффектом.

Модифицированный продукт 3: производное тромбина, в котором серин в положении 205 и глицин в положении 203, каждый, замещены аланином, не обладает высоким эффектом по увеличению ЧАТВ. Даже в том случае, когда модифицируют карбоксильную группу в производном тромбина, в значительной мере не наблюдается повышения эффекта по увеличению ЧАТВ.

Модифицированный продукт 4: производное тромбина, в котором серин в положении 205 замещен глицином, глицин в положении 203 замещен аланином и лизин в положении 77 замещен глютаминовой кислотой, обладает эффектом по увеличению ЧАТВ и чрезвычайно слабым антитромбоцитарным эффектом. В том случае, когда производное тромбина подвергают модификации по карбоксильной группе, отмечается некоторое дополнительное повышение эффекта по увеличению ЧАТВ, однако антитромбоцитарный эффект существенно усиливается. При этом модификация карбоксильной группы значительно снижает выход до 50% или менее.

Модифицированный продукт 5: производное, в котором серин в положении 205 замещен аланином, обладает относительно слабым эффектом по увеличению ЧАТВ и чрезвычайно слабым антитромбоцитарным эффектом. В том случае, когда проводят модификацию по карбоксильной группе в производном тромбина, не наблюдается существенного повышения эффекта по увеличению ЧАТВ, тогда как антитромбоцитарный эффект значительно усиливается применительно как к PAR1, так и к ристоцетину.

Модифицированный продукт 6: производное, в котором серин в положении 205, гистидин в положении 43 и лизин в положении 65, каждый, замещены аланином, обладает сильным эффектом по увеличению ЧАТВ и мощным эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов на пути PAR1. С другой стороны, данное производное не оказывает эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином. В том случае, когда производное тромбина подвергают модификации по карбоксильной группе, слегка повышается эффект по увеличению ЧАТВ, слегка повышается эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной производным М-тромбина, и появляется эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином. Дополнительно, не происходит значительного снижения выхода, наблюдаемого в случае модифицированного продукта 4.

Следует отметить, что в случае производного, которое ингибирует только GPIb , может использоваться производное тромбина, полученное при модификации PPACK-тромбина (тромбина, полученного в результате модификации последовательности Phe-Pro-Arg хлорметилкетоном), которое обладает сниженной активностью по разложению субстрата тромбина и сниженной связывающей способностью с субстратом тромбина из-за нарушений в активном центре. Однако в этом случае достигается также более заметный эффект при проведении описанного выше замещения аминокислот, которое снижает ТМ-связывающую способность.

Различные производные тромбина согласно настоящему изобретению могут по-разному использоваться, в зависимости от поставленной цели. Например, описанное выше производное тромбина 2 будет, как ожидается, также эффективным в случае пластиночного тромба (красный тромб) в вене, и продукт с модифицированной карбоксильной группой на основе производного тромбина 2 будет, как ожидается, эффективным также в случае пластиночного тромба (белый тромб) в артерии.

Альтернативно, считается, что производное тромбина, полученное при проведении замещения серина в положении 205, гистидина в положении 43 и лизина в положении 77 производного тромбина, без модификации карбоксильной группы аланином, аланином или глютаминовой кислотой соответственно, также эффективно для внутривенного тромба.

В том случае, когда кровотечение создает проблемы в течении заболевания, такого как пластиночный тромб в артерии, продукт с модифицированной карбоксильной группой на основе производного тромбина 3, который оказывает низкий эффект по увеличению ЧАТВ, будет более подходящим, чем продукт с модифицированной карбоксильной группой на основе производного тромбина 2. Выбор может быть сделан с учетом риска для данного заболевания у данного пациента и риска кровотечения.

4. Применение и другие аспекты настоящего изобретения

Настоящее изобретение также относится к ДНК, которая кодирует любое из указанных выше производных тромбина. Примеры такой ДНК включают ДНК, которая кодирует предшественник производного тромбина, включая нуклеотидную последовательность 130-1056 в SEQ ID NO: 7, 13, 21, 23, 25, 27, 33, 35, 37 или 39. Указанные ДНК могут содержать изменение в кодоне без сопутствующего изменения последовательности кодируемой аминокислоты. Кроме того, если при замещении конкретной аминокислоты, как указано выше, кодируемое производное тромбина обладает интересующей активностью, примеры ДНК могут включают ДНК, которая гибридизируется в строгих условиях с ДНК, включающей нуклеотидную последовательность 130-1056 в SEQ ID NO: 7, 13, 21, 23, 25, 27, 33, 35, 37 или 39. В контексте настоящего описания пример строгих условий включает условия, при которых промывку проводят один раз или, что более предпочтительно, два или три раза при 60°С с концентрацией соли 1 × SSC, 0,1% ДСН, что представляет собой условия промывки в нормальной процедуре саузерн-гибридизации, предпочтительно при 60°С, 0,1 × SSC, 0,1% ДСН и особенно предпочтительно при 65°С, 0,1 × SSC, 0,1% ДСН.

Следует отметить, что ДНК согласно настоящему изобретению не ограничивается ДНК, которая кодирует предшественник производного тромбина, но ДНК, которая кодирует А цепь и В цепь соответственно, также включается в определение ДНК согласно настоящему изобретению.

Производное тромбина согласно настоящему изобретению оказывает антитромботический эффект. Указанное действие может быть подтверждено, например, при определении показателя ЧАТВ, при определении времени свертывания цельной крови или при выявлении эффекта по ингибированию способности к агрегации тромбоцитов, как описано в примерах. В рамках настоящего изобретения подтверждение антитромбоцитарного эффекта проводят при демонстрации эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином.

Считается, что М-тромбин активирует тромбоциты через рецептор тромбина (PAR1), поскольку М-тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов в тромбоцитемии (плазме, обогащенной тромбоцитами), а индукция агрегации тромбоцитов полностью ингибируется анти-PAR1 антителом (ATAP2, Cosmo Bio Co., Ltd.). В этой связи считается, что ингибирующий эффект производного, получаемый согласно настоящему изобретению применительно к агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином, основан на эффекте ингибирования активации рецептора тромбина.

Производное тромбина по настоящему изобретению может представлять собой производное тромбина, в котором замещен натрий-связывающий сайт, в дополнение к указанному выше замещению. Термин «натрий-связывающий сайт» относится к сайту, описанному в литературе (Biochemistry, 1992, Vol. 31, p 11721-11730). В контексте настоящего описания предпочтительно замещается аспарагиновая кислота в положении 232 или в положении 234 в цепи В (аспарагиновая кислота, соответствующая аспарагиновой кислоте в положении 281 или 283 в SEQ ID NO: 2). Оба остатка аспарагиновой кислоты могут быть замещены. Остатки аспарагиновой кислоты могут быть замещены аланином или аспарагином.

Производное тромбина по настоящему изобретению может быть объединено с фармацевтически приемлемым носителем для использования в качестве фармацевтической композиции. Предпочтительные примеры фармацевтической композиции включают антитромботическое лекарственное средство, противовоспалительное средство, средство, ингибирующее агрегацию тромбоцитов, средство, ингибирующее адгезию тромбоцитов, агент, обладающий GPIb -антагонизирующей активностью для тромбоцитов, и агент, ингибирующий активацию рецептора тромбина. Фармацевтически приемлемый носитель конкретно не ограничивается при условии, что он является фармацевтически приемлемым, и его подходящие для использования примеры включают растворитель для инъекций, стабилизатор, разбавитель и поверхностно-активное вещество, которые широко используется при изготовлении традиционных лекарственных средств. Форма дозировки для фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению конкретно не ограничивается и может быть соответствующим образом выбрана в зависимости от цели лечения. Один из примеров включает инъецируемую форму. Дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть соответствующим образом выбрана в зависимости от заболевания и т.п.

ПРИМЕРЫ

Ниже настоящее изобретение описывается более подробно с помощью примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается примерами, которые даны лишь для пояснения настоящего изобретения.

1. Тест для определения активности по разложению субстрата тромбина

Метод А: тест проводят на основе определения повышения уровня поглощения при длине волны 405 нм при температуре 37°С с использованием синтетического субстрата S2238 (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата в 50 мМ Трис-HCl (pH 8).

По 200 мкл каждого из 50 мМ Трис-HCl/0,1 М NaCl (pH 7,4), содержащего исследуемый образец (например, человеческий тромбин дикого типа или производное тромбина) (концентрация 1 мкг/мл в случае человеческого тромбина дикого типа и концентрация 200 мкг/мл в случае производного тромбина), и 20 мМ Трис-HCl/0,1 М NaCl (pH 7,4), содержащего синтетический субстрат S2238, добавляют в эппендорфовскую пробирку и инкубируют при 37°С в течение 12 ч. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл 50% уксусной кислоты.

Контроль получают при добавлении 200 мкл каждого из 50 мМ Трис-HCl/0,1 М раствора NaCl (pH 7,4), содержащего синтетический субстрат S2238 и 50 мМ Трис-HCl/0,1 М раствора NaCl (pH 7,4), в эппендорфовскую пробирку с последующим инкубированием при 37°С в течение 12 часов.

После завершения 12-часовой инкубации поглощение контроля повышается на 0,005 в сравнении с поглощением до инкубации. В том случае, когда поглощение исследуемого образца после окончания 12-часовой инкубации составляет 0,05 или менее в сравнении с поглощением до инкубации, указанное повышение расценивается как значение ниже измеряемого предела.

Тромбин, активность которого снижается до такого уровня, что не может быть измерена активность по методу А, также подвергают тестированию с измерением активности по любому из других методов B, C и D.

Метод В: Фиброгаммин P (Aventis Pharma) используют в качестве FXIII. К 50 мкл раствора в эппендорфовской пробирке, полученной при проведении диализа 3 мл Фиброгаммина Р, 250 единиц, против 50 мМ ЭДТА/0,1 М раствора NaCl (pH 7,4), добавляют 100 мкл ФБР раствора (pH 7,4), содержащего 0,1 мг/мл исследуемого образца (то есть производное тромбина) и все инкубируют при температуре 37°С в течение 3 ч. После этого подтверждают наличие или отсутствие активации FXIII по данным анализа в ДСН-ПААГ. В том случае, когда продукт разложения наблюдается визуально, ДСН-ПААГ проводят в условиях «-SH», что позволяет сравнить и проанализировать интенсивности полос в А цепи и А цепи активированного FXIII с использованием метода световой оценки (Atto Corporation).

Метод С: 200 мкл раствора 50 мМ Трис-HCl/0,1 М NaCl (pH 7,4), содержащего 4 мг/мл растворенного Fbgn, добавляют к 100 мкл исследуемого образца (например, производного тромбина) и доводят до концентрации 0,2 мг/мл. Все хорошо перемешивают и инкубируют при температуре 37°С в течение 3 ч. Через 3 ч визуально оценивают наличие или отсутствие образовавшихся сгустков.

Метод D: 200 мкл раствора 50 Трис-HCl/0,1 М NaCl NaCl (pH 7,4), содержащего 0,1 мг/мл растворенного пептида внеклеточного домена рецептора тромбина (SEQ ID NO: 4), добавляют к 100 мкл исследуемого образца (то есть производного тромбина) и доводят до концентрации 0,3 мг/мл. Все хорошо перемешивают и инкубируют при температуре 37°С в течение 3 ч. Смесь добавляют вместе с 200 мкл 50% уксусной кислоты для остановки реакции. После этого подтверждают наличие или отсутствие активации рецептора тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ. В том случае, когда продукт разложения визуально наблюдается, ДСН-ПААГ проводят в условиях «-SH», что позволяет сравнить и проанализировать интенсивности полос продуктов разложения рецептора тромбина с использованием метода световой оценки (Atto Corporation).

2. Метод оценки связывающей способности с субстратом

Метод Е: Подтверждение связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина (SEQ ID NO: 3)

(1) Получение геля с С-концевым пептидом гирудина

10 мг С-концевого пептида гирудина растворяют в буферном растворе с 0,1 М NaHCO ₃. К раствору добавляют, при перемешивании, 10 мл NHS-активированного целлулофина (Cellulofine) (Chisso Corporation), который был уравновешен буферным раствором, и все перемешивают при температуре 25°С в течение 30 мин.

Смесь добавляют вместе с 20 мл 1 М Трис-HCl (pH 8, 25°С) и все вместе перемешивают еще в течение 30 мин, получая гель с иммобилизованным С-концевым пептидом гирудина. Гель уравновешивают с 50 мМ Трис-HCl/0,15 М NaCl (pH 7,4) при температуре 25°С. После этого в полученную смесь добавляют производные тромбина, каждое из которых было подвергнуто диализу против буферного раствора с 0,1 М NaHCO ₃, и далее промывают с использованием 30 мл указанного буферного раствора с 0,1 М NaHCO₃.

(2) Подтверждение связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина (SEQ ID NO: 3)

2 мл фракции, содержащей человеческий тромбин дикого типа или производное тромбина, добавляют к 10 мл в колонку с С-концевым пептидом гирудина, который был уравновешен с 50 мМ Трис-HCl/0,15 М NaCl (pH 7,4) при температуре 4°С. Полученную смесь промывают 30 мл 50 мМ Трис-HCl буферного раствора и затем проводят элюцию с использованием 50 мМ Трис-HCl/1 М NaCl/3 М мочевины (pH 8). Вестерн-блоттинг проводят при использовании антител против человеческого тромбина для подтверждения наличия тромбина в протекающей фракции или в элюированной фракции. Производное тромбина по настоящему изобретению, имеющее коэффициент связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле, 50% или менее относительно данного показателя у исследуемого образца, который был добавлен в колонку, был расценен как потерявший связывающую способность с субстратом.

3. Способ подтверждения связывающей способности с гепарином

Метод F: 5 мл человеческого тромбина дикого типа или производного тромбина добавляют к колонке HI-TRAP HEPARIN (Amersham Pharmacia), которая была уравновешена 50 мМ NaHCO₃/50 мМ раствора NaCl, и все промывают с помощью 15 мл 50 мМ NaHCO₃ /50 мМ раствора NaCl. После этого при использовании буфера А: 50 мМ NaHCO₃/50 мМ NaCl и буфера В: 50 мМ NaHCO ₃/1 М NaCl полученную смесь подвергают градиентной элюции от В = 0% до В = 100% при скорости течения 0,5 мл/мин в течение 100 мин.

Человеческий тромбин дикого типа имеет пик элюции при А = 50% (0,5 NaCl). Производное тромбина, которое элюируется при концентрации соли А = 40% или ниже, в сравнении с таковыми для тромбина дикого типа в указанных условиях, оценивают как имеющее гепарин-связывающую способность, сниженную на 80%.

Метод F: Определение связывающей способности с рецептором тромбина у производного тромбина с использованием биосенсоров (IАsys, Nissei Sangyo Co., Ltd.)

(1) Получение производного тромбина, иммобилизованного в кювете

Исследуемый образец в 10 мМ фосфатном буфере (pH 7,7) (то есть производное тромбина) перемешивают в кювете с NHS-активированным СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.) при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая производное тромбина, иммобилизованное в кювете. Далее, добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования.

(2) 0,1 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 раствор NaCl корректируют до достижения 1000, 500, 200, 100, 50, 25 или 10 нМ концентрации пептида внеклеточного домена рецептора тромбина (SEQ ID NO:4) и добавляют к производному тромбина, иммобилизованному в кювете, полученному в приведенном выше разделе (1), и далее анализируют кривые связывания.

Анализ проводят с использованием набора FAST (Nissei Sangyo Co., Ltd.) в соответствии с инструкцией производителя.

3. Метод определения ЧАТВ

Определение ЧАТВ проводят по методу, который специально описан ниже, поскольку этот метод конкретно не определен в примерах настоящего изобретения.

Стандартную плазму (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и образец смешивают. Смесь добавляют вместе с реактивом ЧАТВ (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) (25% от всего количества) и все инкубируют при температуре 37°С в течение 5 мин. Через пять минут смесь добавляют вместе с 0,1 М CaCl₂ до концентрации 8 мкМ и измеряют время от момента добавления кальция до свертывания.

4. Синтез AHT

AHT, используемый в примерах настоящего изобретения, получают с использованием следующих процедур.

4-1: Синтез AHT

60 мг человеческого тромбина дикого типа растворяют в 50 мл 100 мкМ PIPES (pH 6,5) и добавляют 10 мг APMSF (WAKO) и все перемешивают в течение 10 мин. Затем растворенный образец охлаждают ледяной водой и добавляют 6 мл 1 N NaOH, после чего все оставляют для взаимодействия на 10 мин (реакция проводится в ледяной воде). После этого полученную смесь добавляют вместе с 14 мл 5 M NaCl и 70 мл глицерина и все перемешивают и корректируют до pH 8,0 с помощью 1 М PIPES (pH 6,5). Далее, откорректированный образец разбавляют, прикапывая до 560 мл 0,1 M NaHCO₃ - 0,5 M NaCl, и впоследствии проводят диализ против 0,1 M NaHCO ₃ - 0,5 М NaCl. Затем диализованный образец подвергают центрифугированию при 8000 об/мин в течение 5 мин для удаления осадка и образец концентрируют до конечного объема 100 мл.

1 мл 50 единиц/мл антитромбина (АТ) добавляют вместе с 10 мг гепарина и полученную смесь добавляют к концентрированному образцу, после чего проводят диализ против 50 мМ NaHCO₃ - 0,3 М NaCl. После этого полученную смесь подвергают центрифугированию при 8000 об/мин в течение 5 мин для удаления осадка.

4-2: Очистка AHT

К 50 мл бензамидин-сефарозы, которая была уравновешена 50 мМ NaHCO₃, добавляют 50 мл раствора, полученного по методу А (со скоростью 2 мл/мин). Полученную смесь промывают 50 мM NaHCO₃-0,1 М NaCl и затем проводят элюцию с использованием 0,1 M бензамидина - 50 мМ NaHCO₃-0,1 М NaCl. Подтверждение наличия белка проводят с помощью ВCA и фракцию, содержащую AHT белок, добавляют к гепарин-сефарозе, которая была уравновешена с использованием 50 мМ NaHCO₃ (со скоростью 2 мл/мин). После этого полученную смесь промывают 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5) для удаления бензамидина и затем проводят элюцию AHT с использованием 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5). Элюированную фракцию объединяют с 10 мг APMSF и все подвергают диализу против 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5).

4-3: Второй метод очистки бензамидина

Далее, образец объединяют с 1 мг APMSF непосредственно перед внесением образца на колонку и затем смесь добавляют к колонке с бензамидин-сефарозой, которая была уравновешена 1 мМ PIPES (pH 6,5). Полученную смесь промывают 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5) и затем проводят элюцию с использованием 0,1 М бензамидина - 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5). AHT-содержащую фракцию добавляют к гепарин-сефарозе, которая была уравновешена 1 мМ PIPES (pH 6,5), и промывают 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5), после чего проводят элюцию с использованием 1 мМ PIPES - 1 М NaCl (pH 6,5).

4-4: Третий метод очистки бензамидина

Полученный образец объединяют с 10 мг APMSF и все подвергают диализу против 1 мМ PIPES - 0,1 М NaCl (pH 6,5). После этого AHT очищают с помощью процедур, аналогичных тем, которые использовались во втором методе очистки бензамидина. Снова добавляют гепарин - элюированный AHT вместе с 1 мг APMSF и собирают примерно 30 мг AHT.

4-5: Метод определения ЧАТВ

100 мкл раствора ФБР (ФБР; 137 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, 8,1 мМ Nа₂HPO₄, 1,47 мМ KH ₂PO₄) (pH 7,4), содержащего AHT или производное тромбина, доводят до концентрации 50 мкг/мл и 25 мкг/мл соответственно и смешивают со 100 мкл стандартной плазмы (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) соответственно. К полученной смеси добавляют 50 мМ реактива ЧАТВ (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и все инкубируют при температуре 37°С в течение 5 мин. После этого к смесям добавляют по 22 мкл 0,1 М CaCl₂ и измеряют время от момента добавления кальция до свертывания (осаждение фибриновых сгустков) соответственно. Стандартная плазма, к которой, в аналогичном методе, был добавлен только ФБР, используется в качестве контроля и для нее также проводят измерение ЧАТВ.

В описанных ниже примерах применяют аналогичные методы инкубации, используя аналогичный реактив ЧАТВ, в рамках которых при добавлении раствора кальция проводят определение ЧАТВ.

Способность каждого производного тромбина увеличивать показатель ЧАТВ рассматривается как повышенная, если ЧАТВ повышается относительно контроля, такого как AHT, по меньшей мере в одной из взятых концентраций: 50 мкг/мл и 25 мкг/мл. Например, в том случае, когда ЧАТВ повышается в 1,1 раза или более относительно контроля по меньшей мере в одной из концентраций: 50 мкг/мл и 25 мкг/мл, считается, что эффект по увеличению ЧАТВ возрастает в 1,1 раза или более.

4-6: Определение ЧАТВ для AHT

100 мкл раствора ФБР (ФБР; 137 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, 8,1 мМ Nа₂HPO₄, 1,47 мМ KH ₂PO₄) (pH 7,4), содержащего AHT или производное тромбина, доводят до концентрации 50 мкг/мл и 25 мкг/мл соответственно и смешивают со 100 мкл стандартной плазмы (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) соответственно. К полученной смеси добавляют 50 мМ реактива ЧАТВ (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и все инкубируют при температуре 37°С в течение 5 мин. После этого к смесям добавляют по 22 мкл 0,1 М CaCl₂ и измеряют время от момента добавления кальция до свертывания (осаждение фибриновых сгустков) соответственно. Стандартная плазма, к которой, в аналогичном методе, был добавлен только ФБР вместо раствора AHT, используется в качестве контроля. Ниже описаны полученные результаты.

Контроль:	46,5 с
AHT 50 мкг/мл:	63,5 с (увеличение в 1,36 раза)
AHT 25 мкг/мл:	58,5 с (увеличение в 1,25 раза)

Экспериментальный пример 1

(1) Экспрессия человеческого тромбина дикого типа

ДНК (SEQ ID NO:5), содержащую А цепь и В цепь человеческого тромбина дикого типа, вводят в вектор для трансфекции CHO клеток, получая тем самым клетку, продуцирующую претромбин.

Последовательность человеческого претромбина дикого типа, показанная в SEQ ID NO:6, включает сигнальную последовательность аминокислот с номерами 1-43, цепь А аминокислот с номерами 44-92 и В цепь аминокислот с номерами 93-351.

Клетки, продуцирующие претромбин, культивируют в 2 л среды CD-CHO в течение 10 дней. 2 л полученного раствора культуры клеток, продуцирующих претромбин, подвергают диализу против 20 л 10 мМ буферного раствора PIPES (pH 7) при температуре 4°С два раза по 6 ч в каждом диализе. Затем полученную смесь добавляют к 500 мкл СM целлулофина (Chisso Corporation) и промывают 1 л 10 мМ буферного раствора PIPES (pH 7). Затем полученную смесь подвергают элюции с использованием 10 мМ буферного раствора PIPES (pH 7) в линейном градиенте концентраций от 0 до 1 М NaCl. Элюат распределяют по фракциям по 25 мл каждая, и каждую из фракций подвергают вестерн-блоттингу с использованием поликлонального антитела против человеческого тромбина (Cosmo Bio Co., Ltd.), подтверждая тем самым, что человеческий тромбин дикого типа элюируется во фракции примерно 0,4 М.

(2) Активация человеческого тромбина дикого типа экарином и подтверждение связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина активированного человеческого тромбина дикого типа

Примерно 100 мл фракции, содержащей 5 мг полученного человеческого тромбина дикого типа, подвергают диализу против 2 л 50 мМ Трис-HCl буферного раствора (pH 8), содержащего 0,15 M NaCl и 5 мМ CaCl₂ . После этого к полученной смеси добавляют 100 единиц экарина (Sigma-Aldrich) и все инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Проводят эксперимент по связыванию с С-концевым пептидом гирудина, как описано в процедуре метода Е, с использованием части тромбина, обработанного экарином, и подтверждают, что тромбин отсутствует в протекающей фракции, но отмечается полоса тромбина в элюируемой фракции.

(3) Очистка человеческого тромбина дикого типа

Далее, 98 мл раствора, содержащего тромбин, активированный экарином, который представляет собой остаток тромбина, использованного в эксперименте по изучению связывания с С-концевым пептидом гирудина, добавляют к 200 мл сульфатированного целлулофина в колонке (Chisso Corporation), уравновешенной 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 8), содержащего 0,1 M NaCl. Колонку промывают 200 мл буфера и затем проводят элюцию с использованием 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 8), содержащего 1 М NaCl. После этого элюат подвергают диализу против 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 8), содержащего 0,1 М NaCl. Полученную смесь добавляют к 30 мл в колонку с С-концевым пептидом гирудина (подготовленную по методу, описанному в разделе «метод Е: подтверждение связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина (SEQ ID NO:6»), за исключением того, что количество С-концевого пептида гирудина изменено до 200 мг и количество NHS-активированного целлулофина (Chisso Corporation) изменено до 30 мл, где колонка уравновешена буфером. Колонку с С-концевым пептидом гирудина промывают 150 мл 50 мМ Трис-HCl буфером и затем проводят элюцию с использованием 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 8), содержащего 1 М HCl и 4 М гидрохлорида гуанидина, получая примерно 5 мг почти чистого человеческого тромбина дикого типа, обладающего связывающей способностью с гирудином, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(4) Синтез тромбина с модифицированной карбоксильной группой (М-тромбина)

1 мг человеческого тромбина дикого типа, который был растворен в 5 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5), содержащего 0,5 М NaCl, подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в человеческом тромбине дикого типа. Добавляют глицин, так чтобы конечная концентрация оставшегося карбодиимида стала 0,5 М, завершая реакцию. Данные масс-спектрального анализа показывают, что молекулярная масса повышается примерно на 1400, что указывает на то, что примерно 15 карбоксильных групп были модифицированы.

(5) Оценка с использованием тромбоцитемического образца возможности индукции агрегации тромбоцитов и ингибирования анти-PAR1 антитела (ATAT2, Cosmo Bio Co., Ltd.) модифицированным тромбином

Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемической пробы из супернатанта. Далее, кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл ФБР добавляют к 140 мкл тромбоцитемического образца и к смеси добавляют 35 мкл раствора ФБР, содержащего 1 мкг/мл модифицированного тромбина, и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. Результаты показаны в пункте «002» на Фиг.46.

Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемической пробы из супернатанта. Далее, кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемическую пробу. 100 мкл ФБР, содержащего 50 мкг/мл PAR1, добавляют к 140 мкл тромбоцитемической пробы и к смеси добавляют 35 мкл ФБР, содержащего 1 мкг/мл модифицированного тромбина, и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. Результаты показаны в пункте «001» на Фиг.46.

Указанные выше результаты демонстрируют, что модифицированный тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов и что агрегация тромбоцитов, вызываемая модифицированным тромбином, полностью ингибируется PAR1 антителом. Соответственно было подтверждено, что модифицированный тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов через активацию PAR1.

Экспериментальный пример 2

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «203A205G тромбин»), в котором глицин в положении 230 в цепи В замещен аланином и серин в положении 205 в цепи В замещен глицином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 203A205G тромбина. В SEQ ID NO:7 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 203A205G тромбин.

203A205G тромбин экспрессируют по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина подтверждают по методу, приведенному выше в разделе (2) в экспериментальном примере 1, и при этом показано отсутствие полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции наблюдается полоса, эквивалентная тромбину. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая при этом 5 мг практически чистого 203A205G тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ. Далее, определяют связывающую способность с гелем гепарина по методу F и получают элюат в том же положении элюции (А50%), что и в случае человеческого тромбина дикого типа.

(2) Определение активности 203A205G тромбина по разложению субстрата

Активность 203A205G тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного по методике, описанной в указанном выше разделе (1), оценивают по методу А. В результате анализа показано отсутствие существенного увеличения поглощения после инкубации.

Далее, на Фиг.41 показан результат определения активности по разложению субстрата тромбина у 203A205G тромбина, которое проводят по методу В. Не наблюдается полосы, соответствующей А цепи активированного продукта FXIII в образце (линия 6), который получают после 3-часовой инкубации. Кроме того, активность по разложению субстрата тромбина у 203A205G тромбина определяют по методу С, и в результате было показано отсутствие образования сгустков.

(3) Подтверждение связывающей способности 203A205G тромбина с рецептором тромбина

Связывающую способность 203A205G тромбина, полученного по методике указанного выше раздела (1), с рецептором тромбина определяют по методу F. 203A205G тромбин имеет константу диссоциации 3,2 мкМ с рецептором тромбина.

(4) Определение ЧАТВ для 203A205G тромбина

100 мкл раствора ФБР (ФБР; 137 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, 8,1 мМ Nа₂HPO ₄, 1,47 мМ KH₂PO₄) (pH 7,4) смешивают со 100 мкл стандартной плазмы (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и определяют ЧАТВ. Стандартную плазму, в которую добавляют только ФБР, используют в качестве контроля в данной процедуре определения. В результате было получено значение для контроля 44 с, тогда как в случае 203A205G тромбина оно составило 48 с, что соответствует увеличению в 1,09 раза.

(5) Оценка антитромбоцитарного эффекта 203A205G тромбина с использованием тромбоцитемического образца (плазмы, обогащенной тромбоцитами)

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2500 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец (плазму, обедненную тромбоцитами). 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, содержащего 203A205G тромбина, который был откорректирован таким образом, чтобы конечная концентрация 203A205G тромбина составляла 80 мкг/мл, при добавлении 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемической пробы. К смеси добавляют 35 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, содержащего 5 мг/мл ристоцетина. В качестве контроля используют пробу, в которой 130 мкл тромбоцитемического образца объединяют со 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания (при длине волны 700 нм) проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). На Фиг.11 показаны полученные результаты. Пропускание, показанное на вертикальной оси, представляет собой величину, которая указывает на наличие позитивной корреляции со способностью к агрегации тромбоцитов.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве вещества, индуцирующего агрегацию тромбоцитов, используют 1 мкг/мл М-тромбина (человеческий тромбин дикого типа)/5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемической пробы добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). На Фиг.12 показаны полученные результаты.

На Фиг.11 и Фиг.12 приведены результаты, показывающие, что существенный ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов не достигается даже при добавлении 80 мкг/мл 203A205G тромбина.

(6) Эксперимент по сравнению связывающих способностей в отношении субстрата тромбина с использованием IAsys

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий 0,1 мг/мл производного 203A205G тромбина или AHT, добавляют к кювете, содержащей NHS-активированный CM декстран (Nissei Sangyo Co., Ltd.). Каждый из растворов перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным CM декстраном, получая кюветы с иммобилизованными 203A205G тромбином и AHT (кюветы содержат 4100 arc связанного 203A205G тромбина и 2400 arc связанного AHT соответственно). Затем добавляют 0,2 мл 1М этаноламина (pH 8) для блокирования. К кювете с 203A205G тромбином и к кювете с AHT, к каждой, добавляют по 100 нМ Fbgn и FVIII и отслеживают кривые связывания. На Фиг.13 и Фиг.14 показаны полученные результаты.

На Фиг.14 показано, что кювета с AHT содержит практически то же самое количество связанного Fbgn и FVIII, тогда как из Фиг.13 видно, что кювета с 203A205G содержит меньшее количество связанного с ней FVIII, чем Fbgn. Это показывает, что 203A205G тромбин обладает сниженной FVIII-связывающей способностью в сравнении с AHT, который был получен простым превращением серина в положении 205 в дегидроаланин, с тем чтобы минимизировать структурные изменения. При этом 203A205G тромбин характеризуется коэффициентом связывающей способности к FVIII на отвержденное количество, сниженным примерно на 11% в сравнении с AHT. Соответственно делается вывод о том, что 203A205G тромбин имеет низкий эффект по увеличению ЧАТВ.

(7) Определение ЧАТВ для 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой и определение протромбинового времени (ПВ)

1 мг 203A205G тромбина, который был растворен в 5 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)/0,5 М NaCl, подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в 203A205G тромбине. Добавляют глицин, так чтобы конечная концентрация оставшегося карбодиимида стала 0,5 М, завершая реакцию. Данные масс-спектрального анализа показывают, что молекулярная масса возрастает примерно на 1400, что соответствует модификации примерно 15 карбоксильных групп.

Метод оценки 1: ЧАТВ, определение 1

500 мг модифицированного 203A205G тромбина растворяют в 1 мл 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl. 50 мкл смеси добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) с достижением объемного соотношения 1:10 и определяют ЧАТВ. Для контроля 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) с достижением объемного соотношения 1:10 и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате было получено, что ЧАТВ контроля составляет 38 с, тогда как ЧАТВ для 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой составляет 65 с.

Метод оценки 2: ЧАТВ, определение 2

100 мг смеси, полученной при растворении 50 мкг модифицированного 203A205G тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.), в рамках аналогичной процедуры используют в качестве контроля и также определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате было получено, что ЧАТВ в контроле составляет 44 с, тогда как ЧАТВ для 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой составляет 85 с.

Метод оценки 3: Определение ПВ

Смесь, полученную при растворении 500 мкг модифицированного 203A205G тромбина в 1 мл 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) с достижением соотношения объемов 1:10 и определяют ЧАТВ. Для контроля 5 мМ PIPES буфер (pH 7,4)/0,15 М NaCl добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.), так чтобы соотношение объемов составляло 1:10, и определяют ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что ПВ в контроле составляет 20 с, тогда как ПВ для 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой составляет 21 с.

(8) Оценка антитромбоцитарного эффекта 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой при использовании тромбоцитемического образца (плазмы, обогащенной тромбоцитами)

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец (плазму, обедненную тромбоцитами). 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, содержащего 203A205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами, который был откорректирован до конечной концентрации 203A205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами 37 мкг/мл, при добавлении 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. К смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl в качестве вещества, индуцирующего агрегацию тромбоцитов. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания (при длине волны 700 нм) проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). На Фиг.1 показаны полученные результаты. Пропускание, показанное на вертикальной оси, представляет собой величину, которая указывает на наличие позитивной корреляции со способностью к агрегации тромбоцитов.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что используют 1 мг/мл М-тромбина (человеческий тромбин дикого типа)/5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl в качестве вещества, индуцирующего агрегацию тромбоцитов. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). На Фиг.2 показаны полученные результаты.

На Фиг.1 и Фиг.2 приведены результаты, показывающие, что агрегация тромбоцитов подавляется при использовании 203A205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами, из чего следует, что указанное производное тромбина оказывает антитромбоцитарный эффект на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином, и агрегацию тромбоцитов, индуцированную модифицированным тромбином.

Приведенные выше результаты показывают, что 203A205G тромбин обладает активностью, которая снижается до уровня ниже предела обнаружения, тогда как сохраняет способность связываться с субстратом. Кроме того, результаты определения ЧАТВ и результаты эксперимента по ингибированию агрегации тромбоцитов показывают, что 203A205G тромбин А не оказывает достаточного антитромботического и антитромбоцитарного эффектов в концентрации 80 мгк/мл, тогда как 203A205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами, в котором примерно 15 карбоксильных групп были модифицированы, оказывает достаточно выраженные антитромботический и антитромбоцитарный эффекты, даже в низкой концентрации.

Дополнительно, из эксперимента по сравнению способностей к связыванию с субстратом с использованием IAsys было показано, что 203A205G тромбин обладает низкой FVIII-связывающей способностью, и коэффициент связывающей способности в расчете на иммобилизованные белки снижается примерно на 11% в сравнении с соответствующим коэффициентом для AHT. Таким образом, 203A205G тромбин рассматривается как не оказывающий эффекта по увеличению ЧАТВ. 203A205G тромбин, содержащий модифицированные карбоксильные группы, оказывает эффект по увеличению ЧАТВ, эквивалентный таковому у 205A43A тромбина, описанного в экспериментальном примере 12, и при этом 203A205G с модифицированными карбоксильными группами также демонстрирует эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, эквивалентный таковому у 205A43A тромбина. В сравнении с результатами, полученными для 205A43A с модифицированными карбоксильными группами, 203A205G тромбин, содержащий модифицированные карбоксильные группы, обладает более слабым эффектом по увеличению ЧАТВ, но демонстрирует на эквивалентном уровне выраженный эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов.

(9) Оценка взаимосвязи между количеством модифицированных карбоксильных групп в 203A205G тромбине и антитромботическим эффектом

(9)-1. Получение производного 203A205G с модифицированными карбоксильными группами, который содержит от 1 до 10 модификаций

1 мг 203A205G тромбина, растворенный в 5 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)/0,5 М NaCl, подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 часов. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации от 2 до 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 60-120 мин, получая производное тромбина с модифицированными карбоксильными группами 1-5, каждое из которых содержит от 2 до 28 модифицированных карбоксильных групп в молекуле 203A205G тромбина.

(9)-2. Эффекты по увеличению ЧАТВ соответствующих производных 1-5 тромбина с модифицированными карбоксильными группами, которые были диализованы против ФБР

100 мкл смеси, полученной при растворении 50 мкг модифицированного 203A205G тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к 100 мкл стандартной плазмы (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.), используют в аналогичной процедуре в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd.

Ниже показаны полученные результаты.

203A205G тромбин: примерно 0 модификаций, ЧАТВ - 47 с

Производное тромбина 1 с модифицированными карбоксильными группами: примерно 1 модификация, ЧАТВ - 48 с

Производное тромбина 2 с модифицированными карбоксильными группами: примерно 3 модификации, ЧАТВ - 56 с

Производное тромбина 3 с модифицированными карбоксильными группами: примерно 5 модификаций, ЧАТВ - 61 с

Производное тромбина 4 с модифицированными карбоксильными группами: примерно 10 модификаций, ЧАТВ - 77 с

Производное тромбина 5 с модифицированными карбоксильными группами: примерно 26 модификаций, ЧАТВ - 60 с

Как отмечалось выше, было подтверждено, что 203A205G тромбин в случае использования EDC характеризуется значительным эффектом по увеличению ЧАТВ, определяемым введением трех или более модификаций карбоксильных групп. Выход производного тромбина с модифицированными карбоксильными группами 1-4 до и после модификации составляет 75% или более. Производное, содержащее 26 модификаций, демонстрирует эффект по увеличению ЧАТВ, однако, как было показано, происходит агрегация, и выход снижается до 40%, где снижение выхода вызывается избыточной модификацией карбоксильных групп.

Экспериментальный пример 3

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «205А тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205А тромбина. На SEQ ID NO:9 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205А тромбин.

Проводят экспрессию 205А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методу указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, при этом отмечается отсутствие полосы в протекающей фракции и наличие полосы, эквивалентной полосе тромбина в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 6 мг практически чистого 205А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ. На Фиг.39 приведены результаты электрофореза образца, полученного после очистки 205А тромбина с использованием иммобилизованного С-концевого пептида гирудина. В протекающей фракции в линии 5 не выявляется 205А тромбин, а в элюированной фракции отмечается полоса очищенного 205А тромбина.

Приведенные выше результаты указывают на то, что 205А тромбин обладает связывающей способностью с С-концевым пептидом, иммобилизованным в геле.

Далее определяют связывающую способность с гепариновым гелем по методу Е и получают элюат в том же самом положении элюции (А50%), что и в случае человеческого тромбина дикого типа.

(2) Определение активности 205А тромбина по разложению субстрата

На Фиг.40 показаны результаты определения активности по разложению субстрата тромбина для 205А тромбина, полученного в соответствии с указанным выше разделом (1), по методу В. Уже через 3 ч не отмечается А цепи активированного FXIII, как показано на линии 8.

(3) Определение ЧАТВ для 205А тромбина

100 мкл раствора, полученного при растворении 500 мкг 205А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 55 с, а значение ЧАТВ для 205А тромбина составляет 95 с.

100 мкл раствора, полученного при растворении 50 мкг 205А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 41 с, а значение ЧАТВ для 205А тромбина составляет 62 с.

Кроме того, 1 мг/5 мл 205А тромбина/50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)/0,5 М HCl подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в молекуле 205А тромбина. Получают примерно 80% модифицированных производных в солюбилизированном состоянии.

100 мкл раствора, полученного при растворении 50 мкг 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 42 с, а значение ЧАТВ для 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 79 с.

(4) Определение протромбинового времени (ПВ)

Растворы, полученные при соответствующем растворении 50 мкг 205А тромбина и 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами в 1 мл ФБР, каждый, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что ПВ в контроле составляет 21 с, значение ПВ для 205А тромбина составляет 25 с, а значение для 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 20 с. Таким образом, и 205А тромбин, и 205А тромбин с модифицированными карбоксильными группами не демонстрируют увеличивающего эффекта.

(5) Оценка антитромбоцитарного действия 205А тромбина при использовании тромбоцитемического образца (плазмы, обогащенной тромбоцитами)

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец (плазму, обедненную тромбоцитами). 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl с 205А тромбином, который был откорректирован до достижения конечной концентрации 205А тромбина 70 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина /5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl в качестве вещества, индуцирующего агрегацию тромбоцитов. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания (при длине волны 700 нм) проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). Однако в рамках данного эксперимента эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов не наблюдается в концентрации 70 мкг/мл.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве вещества, индуцирующего агрегацию тромбоцитов, используют 1 мкг/мл М-тромбина (человеческий тромбин дикого типа)/5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl. Для контроля используют пробу, в которой к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). Однако в рамках данного эксперимента эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов не наблюдается в концентрации 70 мкг/мл.

Как отмечалось выше, было подтверждено, что 205А тромбин обладает слабым эффектом по увеличению ЧАТВ. Однако не наблюдается и антитромбоцитарного эффекта. Это указывает на то, что 205А тромбин демонстрирует способность к ингибированию активации рецептора тромбина в тех условиях среды, когда среда не содержит плазму, как описано в патентном документе 4, но 205А тромбин не обладает способностью активировать рецептор тромбина на уровне, при котором 205А тромбин может практически использоваться в качестве антитромбоцитарного агента в плазме.

(6) Оценка антитромбоцитарного эффекта 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами при использовании тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл ФБР раствора 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами, который был откорректирован до достижения конечной концентрации 205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами, равной 100 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют (i) 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР раствора или (ii) 5 мг/мл ристоцетина/ФБР раствора, где каждый из агентов служит в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и проводят эксперимент по ингибированию агрегации тромбоцитов. На Фиг.21 и Фиг.22 показаны результаты, полученные по указанным выше пунктам (i) и (ii).

(7) Сравнение связывающей способности 205А тромбина с Fbgn и FVIII

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,7), содержащий 205А тромбин в концентрации 0,1 мг/мл, добавляют в кювету с NHS-активированным СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.). Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая 205А тромбин, иммобилизованный в кювете (примерно 600 arc иммобилизации). Далее добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования.

К кювете с 205А тромбином добавляют соответственно 100 нМ Fbgn и FVIII и строят соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.23 показаны полученные результаты. Из Фиг.23 видно, что 205А тромбин не демонстрирует повышенной специфичности к FVIII, тогда как сам по себе FVIII-связывающий сигнал относительно снижается примерно на 40% в сравнении с сигналом AHT (Фиг.14). В этой связи делается вывод о том, что 205А тромбин не проявляет мощного антитромботического действия. Кроме того, 205А тромбин приобретает повышенную способность к увеличению ЧАТВ при модификации карбоксильных групп и демонстрирует эффекты по ингибированию как агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином, так и агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

Экспериментальный пример 4

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205Т тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен треонином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205Т тромбина. На SEQ ID NO:11 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205Т тромбин.

Проводят экспрессию 205Т тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, при этом выявляют отсутствие полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 5 мг практически чистого 205Т тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Определение активности по разложению субстрата для 205Т тромбина

Активность 205Т тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного в соответствии с процедурой указанного выше раздела (1), анализируют по методу А. В результате получают значение активности по разложению субстрата для 205Т тромбина, которое составляет 2,5×10^-4 раз в сравнении с соответствующим значением для человеческого тромбина дикого типа.

Далее определяют активность тромбина по разложению субстрата тромбина в соответствии с методом В. В результате показано, что А цепи практически всех FXIII активируются аналогично тромбину дикого типа, и выявляются полосы разложенного FXIII. Как отмечалось выше, было показано, что у 205Т тромбина все еще сохраняется активность.

Экспериментальный пример 5

(1) Экспрессия тромбина (то есть 203А205A99N тромбина), в котором глицин в положении 203 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 в цепи В замещен аланином, а аспарагиновая кислота в положении 99 замещена аспарагином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 203А205A99N тромбина. На SEQ ID NO:13 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 203А205A99N тромбин.

Проводят экспрессию 203А205A99N тромбина по методу указанного выше раздела (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методу указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляется полоса в протекающей фракции, а в пике элюции наблюдается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методу указанного выше раздела (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 5 мг практически чистого 203А205A99N тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

Далее измеряют способность связываться с гепариновым гелем по методу F и получают элюат при А40%, что подтверждает снижение афинности в отношении гепаринового геля.

(2) Определение активности по разложению субстрата для 203А205A99N тромбина

Активность 203А205A99N тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного в соответствии с методом указанного выше раздела (1), анализируют по методу А. В результате показано отсутствие повышения уровня поглощения после инкубации.

Далее определяют активность 203А205A99N тромбина по разложению субстрата тромбина в соответствии с методом В. В результате показано отсутствие полосы А цепи - активированного продукта FXIII.

(3) Определение ЧАТВ в крови с добавлением 203A205A99N тромбина

Раствор, полученный при растворении 100 мкг 203A205A99N тромбина в 1 мл 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 M NaCl, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 M NaCl к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 55 с, тогда как значение ЧАТВ для 203A205A99N тромбина составляет 60 с. Соответственно было показано, что 203A205A99N тромбин обладает связывающей способностью к гирудинововому гелю и что 203A205A99N тромбин обладает достаточно сниженной активностью, но оказывает заметный антитромботический эффект.

Экспериментальный пример 6

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205V тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен валином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205V тромбина. На SEQ ID NO:15 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205V тромбин.

Проводят экспрессию 205V тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1. На Фиг.44 показаны результаты вестерн-блоттинга в условиях восстановления S-S связи. Практически все полосы тромбина обнаруживаются в протекающей фракции, а в пике элюции не отмечается тромбин. Соответственно было подтверждено, что замещение аминокислот в активном центре снижает связывающую способность 205V тромбина с субстратом. Полоса, которая появилась выше относительно метчика молекулярной массы стандартного тромбина в ранее нанесенном образце, представляет собой тромбин, который не был активирован или расщеплен экарином на А и В цепи, при этом было подтверждено, что тромбин обладает существенно сниженной чувствительностью к экарину.

Экспериментальный пример 7

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205D тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен аспарагиновой кислотой

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205V тромбина. На SEQ ID NO:17 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205D тромбин.

Проводят экспрессию 205D тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1. На Фиг.45 показаны результаты вестерн-блоттинга в условиях восстановления S-S связи. Практически все полосы тромбина выявляются в протекающей фракции, тогда как в пике элюции не наблюдается тромбин. Соответственно было подтверждено, что замещение аминокислот в активном центре снижает связывающую способность 205D тромбина с субстратом. Полоса, которая появилась выше относительно метчика молекулярной массы стандартного тромбина в ранее нанесенном образце, представляет собой тромбин, который не был активирован или расщеплен экарином на цепи А и В, и при этом было подтверждено, что тромбин обладает существенно сниженной чувствительностью к экарину.

Экспериментальный пример 8

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205N тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен аспарагином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205N тромбина. На SEQ ID NO:19 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205N тромбин.

Проводят экспрессию 205N тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина подтверждают по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1 и выявляют практически все полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции не наблюдается тромбин. Соответственно было подтверждено, что замещение аминокислот в активном центре снижает связывающую способность 205N тромбина с субстратом.

Экспериментальный пример 9

Определение способности АНТ связываться с субстратом тромбина проводят по методике D и оценивают константу диссоциации между AHT и рецептором тромбина на уровне 1,2 мкМ.

Экспериментальный пример 10

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205A99N тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен аланином и аспарагиновая кислота в положении 99 в цепи В замещена аспарагином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205A99N тромбина.

На SEQ ID NO:21 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205A99N тромбин.

Проводят экспрессию 205A99N тромбина по методике указанного выше раздела (1) в экспериментальном примере 1. Связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина подтверждают по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, при этом показано отсутствие полосы протекающей фракции и наличие полосы, эквивалентной полосе тромбина, в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 5 мг практически чистого 205A99N тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Определение активности по разложению субстрата для 205A99N тромбина

Активность 205A99N тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного в соответствии c методикой указанного выше раздела (1), определяют по методу А. В результате показано отсутствие существенного повышения уровня поглощения после инкубации.

Далее измеряют активность 205A99N тромбина по разложению субстрата тромбина в соответствии с методом В. В результате было показано отсутствие полосы А цепи - активированного продукта FXIII.

(3) Определение ЧАТВ для 205A99N тромбина

50 мкг 205A99N тромбина растворяют в 1 мл ФБР. 100 мкл раствор смешивают со стандартной плазмой (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) и определяют ЧАТВ. Для контроля ФБР добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 55 с, тогда как значение ЧАТВ для 205A99N тромбина составляет 58 с.

Экспериментальный пример 11

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «203A205А тромбин»), в котором глицин в положении 203 в цепи В замещен аланином и серин в положении 205 в цепи В замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 203A205А тромбина. На SEQ ID NO:23 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 203A205А тромбин.

Проводят экспрессию 203A205А тромбина по методике, описанной выше в разделе (1) в экспериментальном примере 1. Связывающую способность с С-концевым пептидом гирудина подтверждают по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, при этом показано отсутствие полосы проходящей фракции и наличие полосы, эквивалентной полосе тромбина, в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 4 мг практически чистого 203A205А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ. Далее определяют связывающую способность с гепариновым гелем по методике F и получают элюат при А40%, что соответствует снижению афинности к гепариновому гелю на 40% в сравнении с человеческим тромбином дикого типа.

(2) Определение активности по разложению субстрата для 203A205А тромбина

Активность 203A205А тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного в соответствии c методикой, указанной выше в разделе (1), определяют по методу А. В результате показано, что после инкубации не наблюдается повышения уровня поглощения.

Далее определяют активность 203A205А тромбина по разложению субстрата тромбина в соответствии с методом В. На Фиг.43 показаны полученные результаты. Не выявляется полос А цепи - активированного продукта FXIII даже в линии 6, которая была получена после 3-часовой инкубации. Было обнаружено, что 203A205А тромбин обладает способностью по связыванию с С-концевым пептидом гирудина и что 203A205А тромбин в достаточной степени потерял свою активность.

Раствор, полученный при растворении 100 мкг 203A205 тромбина в 1 мл 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 M NaCl, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении 5 мМ PIPES буфера (pH 7,4)/0,15 M NaCl к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 55 с, тогда как значение ЧАТВ для 203A205 тромбина составляет 59 с.

(3) ЧАТВ продукта с модифицированными карбоксильными группами

Далее, 1 мг/5 мл 205А205А тромбина/0,5 М NaCl (pH 6,5) подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в 203А205А тромбине. Получают примерно 80% продукта с модифицированными карбоксильными группами в солюбилизированном состоянии.

100 мкл раствора, полученного при растворении 50 мкг 203А205А тромбина с модифицированными карбоксильными группам в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 45 с, тогда как значение ЧАТВ для 203А205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 46 с.

(4) Определение протромбинового времени (ПВ)

Растворы, полученные при соответствующем растворении 50 мкг 203А205А тромбина и 203А205А тромбина с модифицированными карбоксильными группами соответственно в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 используют в качестве контроля и определяют ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что значение ПВ в контроле составляет 20 с, значение ПВ для 203A205А тромбина составляет 21 с и для тромбина 203А204А с модифицированной карбоксильной группой данный показатель равен 20 с. Таким образом, и тромбин 203А205А, и тромбин 203А205А с модифицированными карбоксильными группами не оказывают эффекта по увеличению ЧАТВ.

(5) Оценка антитромбоцитарного эффекта 203A205А тромбина при использовании тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл раствора ФБР с 203A205А тромбином, который был откорректирован до конечной концентрации 203A205А тромбина, равной 100 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл (i) 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР раствора и (ii) 5 мг/мл ристоцетина/ФБР раствора, где каждый из агентов служит в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и проводят эксперимент по ингибированию агрегации тромбоцитов. Однако при этом не было выявлено разницы между контролем и 203А205А тромбином в отношении индуцирующих веществ по пунктам (i) и (ii).

(6) Сравнение связывающей специфичности 203А205А тромбина с Fbgn и FVIII

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,7), содержащий 203А205А тромбин в концентрации 0,1 мг/мл, добавляют в кювету с NHS-активированным СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.). Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая 203А205А тромбин, иммобилизованный в кювете (примерно 600 arc иммобилизации). Далее добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования. К кювете с 203А205А тромбином добавляют 100 нМ Fbgn и FVIII соответственно и строят соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.24 показаны полученные результаты. На Фиг.24 видно, что 203А205А тромбин демонстрирует примерно 5% сигнал для FVIII в расчете на количество отвержденного белка в сравнении с сигналом AHT. Был сделан вывод, что сама по себе способность к связыванию с субстратом у производного с указанной последовательностью снижается, и в этой связи у него отсутствует противосвертывающая способность.

Экспериментальный пример 12

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «205А43А тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен аланином и гистидин в положении 43 в цепи В замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 25 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205А43А тромбин.

Проводят экспрессию 205А43А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, и при этом показано отсутствие полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Таким образом, было подтверждено, что происходит связывание 95% или более 205А43А тромбина.

Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

На фиг.38 продемонстрирована процедура очистки с использованием колонки с С-концевым пептидом гирудина. На стадии очистки с С-концевым пептидом гирудина не происходит элюции тромбина с вытекающей фракцией (то есть в линии 4), а очищенный 205А43А тромбин выявляется в пике элюции, который собирают.

Далее определяют связывающую способность с гелем гепарина по методу F и получают элюат в том же самом положении элюции при А50%.

(2) Определение активности по разложению субстрата для 205А43А тромбина

Активность 205А43А тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного в соответствии с методикой указанного выше раздела (1), определяют по методу А. В результате не было выявлено повышения уровня поглощения после инкубации.

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 205А43А в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 46 с, тогда как значение ЧАТВ для 205А43А тромбина составляет 78 с, что указывает на увеличение ЧАТВ в 1,7 раз. Возрастание эффекта (то есть эффект по увеличению ЧАТВ) составляет 1,25 раз в сравнении с данным эффектом у ангидротромбина в тех же условиях тестирования.

(3) Определение ПВ

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют значение ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что значение ПВ в контроле составляет 24 с, тогда как значение ПВ для 205А43А тромбина составляет 25 с.

(4) Определение ЧАТВ для 205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами

1 мг/5 мл 205А43А тромбина/50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)/0,5 М NaCl, подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в 203А43А тромбине. Исходя из данных масс-спектрального анализа, выявлено, что примерно 16 карбоксильных групп были модифицированы.

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 46 с, тогда как значение ЧАТВ для 205А43А с модифицированными карбоксильными группами составляет 190 с.

(5) Определение протромбинового времени (ПВ)

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют значение ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют значение ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что значение ПВ в контроле составляет 22 с, тогда как значение ПВ для 205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 23 с. Таким образом, даже модифицированный продукт на основе 205А43А тромбина не демонстрирует эффектов по увеличению ПВ.

(6) Оценка антитромбоцитарного эффекта 205А43А тромбина с использованием тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл ФБР раствора с 205А43А тромбином, который был откорректирован до достижения конечной концентрации 205А43А тромбина, равной 30 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР раствора в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной.

На Фиг.3 показаны полученные результаты.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мг/мл М-тромбина/ФБР. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.4 показаны полученные результаты.

Метод оценки 3: 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР раствора используют в качестве индуцирующего вещества и добавляют растворы 205А43А тромбина, откорректированные до конечной концентрации 205А43А тромбина, в случае добавления 100 мкл раствора, равной 120 мкг/мл и 30 мкг/мл. На фиг.15 показаны полученные результаты.

Метод оценки 4: 100 мкл ФБР раствора 205А43А тромбина, откорректированного до конечной концентрации 205А43А тромбина, равной 150 мкг/мл, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. К смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР, служащего в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. Однако даже при высокой концентрации 205А43А тромбина не обнаруживается ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином.

(7) Оценка антитромбоцитарного эффекта 205А43А тромбина c модифицированными карбоксильными группами с использованием тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, содержащего 205А43А тромбин c модифицированными карбоксильными группами, который был откорректирован до конечной концентрации 205А43А тромбина c модифицированными карбоксильными группами 30 мкг/мл, 15 мкг/мл и 7,5 мкг/мл соответственно в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина /5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl, служащего в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Измерение пропускания проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). На Фиг.5-7 показаны полученные результаты.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мг/мл М-тромбина/5 мМ фосфатный буфер (pH 7,4)/0,15 М NaCl. В качестве контроля 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют к 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и фиксируют время, когда проба становится прозрачной. Измерение пропускания проводят с использованием системы EASY TRACER ET-800 (Tokyo Koden). На Фиг.8-10 показаны полученные результаты.

(8) Эксперимент по сравнению связывающих способностей в отношении субстрата тромбина с использованием IAsys

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий производное 205А43А тромбина или AHT, каждый взятый в концентрации 0,1 мг/мл, добавляют к кювете, содержащей NHS-активированный CM декстран (Nissei Sangyo Co., Ltd.). Растворы перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным CM декстраном, получая кюветы с иммобилизованными 205A43А тромбином и AHT. На кювете иммобилизуется 1,307 arc 205А43А тромбина. Далее добавляют 0,2 мл 1М этаноламина (pH 8) для блокирования. К кювете с 205А43А тромбином и к кювете с AHT, к каждой, добавляют 100 мМ Fbgn и FVIII и записывают соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.16 и Фиг.14 показаны полученные результаты. Из данных Фиг.14 видно, что кювета с AHT имеет практически то же самое количество связанных Fbgn и FVIII, тогда как из данных Фиг.16 видно, что кювета с 205A43А тромбином содержит большее количество связанного с ней FVIII, чем Fbgn.

Было подтверждено, что соотношение между связывающими способностями в отношении FVIII и Fbgn у производного 205А43А тромбина повышается примерно в 1,4 раза в сравнении с таковым для AHT.

Дополнительно делается вывод о том, что производное 205А43А тромбина обладает FVIII-связывающей способностью в расчете на иммобилизованные белки, эквивалентной таковой для AHT.

(9) Эксперимент по оценке количества модификаций и эффекта по увеличению ЧАТВ для 205А43А тромбина

1 мг/5 мл 205А43А тромбина/50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)/0,5 М NaCl подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 10 мин, 60 мин и 120 мин соответственно для модификации карбоксильных групп. Добавляют глицин в пробы с разной длительностью реакции, так чтобы конечная концентрация оставшегося карбодиимида стала 0,5 М, завершая реакцию.

При проведении реакции по модификации карбоксильных групп было подтверждено относительно непрореагировавшего 205А43А тромбина, что молекулярная масса образца, который взаимодействует в течение 10 мин, повышается примерно на 480 Да (что соответствует 5,6 модификациям), молекулярная масса образца, который взаимодействует в течение 60 мин, повышается примерно на 1240 Да (что соответствует 14,6 модификациям) и молекулярный вес образца, который взаимодействует в течение 120 минут, повышается примерно на 1900 Да (что соответствует 22,4 модификациям).

Эффекты соответствующих производных тромбина по увеличению ЧАТВ

Модифицированные продукты подвергают корректировке до достижения концентраций 50, 25 и 12,5 мкг/мл соответственно и каждый из модифицированных продуктов подвергают диализу против ФБР. Каждый из образцов смешивают со стандартной плазмой в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. В приведенной ниже таблице 2 показаны результаты проведенного анализа. Значения ЧАТВ определяют дважды для каждого образца и вычисляют средние величины.

ТАБЛИЦА 2
	ЧАТВ	среднее значение (с)	Соотношение
первое определение	второе определение
Диализ-контроль	42	42	42	1
0 мин, концентрация образца 12,5 мкг/мл	61	62	61,5	1,46
0 мин, концентрация образца 25 мкг/мл	70	71	70,5	1,68
0 мин, концентрация образца 50 мкг/мл	83	80	81,5	1,94
10 мин, концентрация образца 12,5 мкг/мл	87	89	88	2,1
10 мин, концентрация образца 25 мкг/мл	100	103	101,5	2,42
10 мин, концентрация образца 50 мкг/мл	118	114	116	2,76
60 мин, концентрация образца 12,5 мкг/мл	88	90	89	2,12
60 мин, концентрация образца 25 мкг/мл	110	112	111	2,64
60 мин, концентрация образца 50 мкг/мл	140	143	141,5	3,37
120 мин, концентрация образца 12,5 мкг/мл	88	90	89	2,12
120 мин, концентрация образца 25 мкг/мл	137	125	131	3,12
120 мин, концентрация образца 50 мкг/мл	240	250	245	5,83

На основе полученных выше результатов был сделан вывод о том, что эффект по увеличению ЧАТВ у 205А43А тромбина повышается даже при наличии 5,6 модификаций в сравнении с немодифицированным 205А43А тромбином. При увеличении количества модификаций от 14,6 до 22,4 повышается эффект по увеличению ЧАТВ, однако выход при наличии 22,4 модификаций снижается примерно до 50%. Был сделан вывод, что с точки зрения выхода и эффекта по увеличению ЧАТВ 5 или более модификаций являются эффективными для достижения эффекта по увеличению ЧАТВ, определяемого модификацией, тогда как 22 или более модификаций приводят к снижению выхода.

Было показано, что 205А43А тромбин обладает более высокой FVIII-специфичностью в сравнении с AHT, который получают путем простого превращения серина активного центра в дегидроаланин для минимизации структурных изменений.

Приведенные выше результаты показывают, что производное 205А43А тромбина обладает мощным эффектом по увеличению ЧАТВ, независимо от наличия или отсутствия модификации карбоксильной группы. Дополнительно эффект по увеличению ЧАТВ повышается при модификации карбоксильных групп. Эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, который зависит от ингибирования агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином (то есть ингибирования PAR1-активации), имеет место, независимо от наличия или отсутствия модификаций карбоксильных групп, но указанный эффект усиливается после модификации карбоксильных групп по сравнению с тем, что было до модификации. Таким образом, было обнаружено, что 205А43А тромбин оказывает мощное воздействие преимущественно на процесс свертывания крови, в котором ЧАТВ играет центральную роль, и оказывает слабый эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, тогда как 205А43А тромбин с модифицированными карбоксильными группами обладает мощной антитромбоцитарной способностью, а также эффектом в отношении ЧАТВ. Модифицированный 205А43А тромбин оказывает эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, в дополнение к эффекту по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином (то есть по ингибированию PAR1-активации), тогда как немодифицированный 205А43А тромбин не оказывает такого воздействия на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином, даже в высокой концентрации. Соответственно было получено производное тромбина, которое имеет приведенные ниже характеристики и оказывает антитромботический эффект.

205А43А тромбин с модифицированными карбоксильными группам:

Эффект по увеличению ЧАТВ высокий, по PAR1-ингибированию высокий, в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, высокий.

205А43А тромбин:

Эффект по увеличению ЧАТВ высокий, по PAR1-ингибированию низкий, в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, отсутствует.

Дополнительно было отмечено, что 205А43А тромбин обладает чрезвычайно высоким эффектом по увеличению ЧАТВ в эксперименте, проведенном для сравнения способностей по связыванию с субстратом тромбина с использованием IAsys, поскольку производное тромбина, в котором серин в положении 205 и гистидин в положении 43 одновременно подвергнуты мутации, полностью теряет активность по разложению субстрата и обладает FVIII-связывающей способностью более высокой, чем у AHT (что соответствует относительному снижению Fbgn-связывающей способности). Как описано в экспериментальных примерах 16 и 17, приведенных ниже, производное тромбина, в котором серин в положении 205 и гистидин в положении 43 одновременно подвергнуты мутации, обладает высоким антитромботическим эффектом, включающим в качестве основного эффекта увеличение ЧАТВ, даже в случае использования сочетания других аминокислот.

Экспериментальный пример 13

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «77Е203А205G тромбин»), в котором глицин в положении 203 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 в цепи В замещен глицином и лизин в положении 77 в цепи В замещен глютаминовой кислотой

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 77Е203А205G тромбина. На SEQ ID NO: 27 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 77Е203А205G тромбин.

Проводят экспрессию 77Е203А205G тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, при этом показано отсутствие полосы в протекающей фракции, а в пике элюции обнаруживается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 77Е203А205G тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Определение ЧАТВ в крови с добавлением 77Е203А205G тромбина

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 77Е203А205G тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Аналогично, раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 44 с, тогда как значение ЧАТВ для 77Е203А205G тромбина составляет 74 с, что указывает на повышение значения ЧАТВ в 1,68 раза.

В экспериментальном примере 2 повышение значения ЧАТВ для 203А205G тромбина в тех же условиях составляет 1,09 раз. Таким образом, замещение глютамина на лизин в положении 77 повышает эффект по увеличению ЧАТВ в 1,5 раза.

(3) Оценка антитромбоцитарного действия 77Е203А205G тромбина с использованием тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл раствора ФБР с 77Е203А205G тромбином, который был откорректирован до достижения конечной концентрации 77Е203А205G тромбина 70 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР, служащего в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Однако не наблюдается эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР. Для контроля к 130 тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. Однако не наблюдается эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином.

Как указывалось выше, 203А205G тромбин не оказывает достаточного антитромботического действия, тогда как 77Е203А205G тромбин вызывает значительное повышение эффекта по увеличению ЧАТВ за счет снижения Fbgn-связывающей способности, определяемого замещением лизина в положении 77. Дополнительно 77Е203А205G тромбин не демонстрирует ингибирующих эффектов на агрегацию тромбоцитов, индуцированную как М-тромбином, так и ристоцетином.

(4) Тест по определению ЧАТВ для продукта с модифицированными карбоксильными группами

Далее 1 мг/5 мл 77Е203А205G тромбина/0,5 мМ NaCl (pH 6,5) подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в 77Е203А205G тромбине. Получают примерно 35% продукта с модифицированными карбоксильными группами в солюбилизированном состоянии.

100 мкл раствора, полученного при растворении 50 мкг 77Е203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 45 с, тогда как значение ЧАТВ для 77Е203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 77,5 с.

(5) Определение протромбинового времени (ПВ)

Растворы, полученные при соответствующем растворении 50 мкг 77Е203А205G тромбина и 77Е203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами соответственно в 1 мл ФБР добавляют, каждый, к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что значение ПВ в контроле составляет 20 с, тогда как значение ПВ для 77Е203А205G тромбина составляет 22 с и значение ПВ для 77Е203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 23 с. Таким образом, ни 77Е203А205G тромбин, ни 77Е203А205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами не демонстрируют эффекта по увеличению значения ПВ.

(6) Оценка антитромбоцитарного эффекта 77Е203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами с использованием тромбоцитемической пробы

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл раствора ФБР с модифицированным 77Е203А205G тромбином, который был откорректирован до конечной концентрации модифицированного 77Е203А205G тромбина, равной 50 мкг/мл, в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР, служащего в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.25 показаны полученные результаты.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу оценки, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.26 показаны полученные результаты.

Приведенные выше результаты подтверждают тот факт, что 77Е203А205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами не обладает повышенным эффектом по увеличению ЧАТВ в сравнении с вариантом до модификации карбоксильных групп, но демонстрирует ингибирующие эффекты на агрегацию тромбоцитов, индуцированную М-тромбином, и на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином. Дополнительно было подтверждено существенное снижение выхода, определяемое замещением глютаминовой кислотой в положении 77 в сравнении с вариантом до замещения.

(7) Подтверждение специфичности по связыванию для 77Е203А205G тромбина с Fbgn и ТМ

0,1 мг/мл 203А205G тромбина/10 мМ фосфатного буфера (pH 7,7) и 0,1 мг/мл 77Е203А205G тромбина/10 мМ фосфатного буфера (pH 7,7) добавляют в кювету с NHS-активируемым СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.) соответственно. Каждый из растворов перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) на кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая кювету с иммобилизованным 203А205G тромбином и кювету с иммобилизованным 77Е203А205G тромбином. Примерно 4100 arc белка иммобилизуется на кювете с 203А205G и примерно 2000 arc белка иммобилизуют на кювете с 77Е203А205G. Далее добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования.

После этого обе кюветы промывают 50 мМ фосфатным буфером (pH 7,7), содержащим 2 M NaCl и 30 мМ бензамидина, и регенерируют. Затем в обе кюветы добавляют по 100 мкл 500 мМ раствора Fbgn, полученного при растворении Fbgn в 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,7)/0,15 M NaCl. Через три минуты примерно 300 arc сек адсорбируются на кювете с иммобилизованным 203А205G тромбином и примерно 80 arc сек Fbgn адсорбируется на кювете с иммобилизованным 77Е203А205G тромбином.

Затем обе кюветы промывают по процедуре описанного выше способа и регенерируют. После этого в обе кюветы добавляют по 100 мкл 500 нМ раствора FVIII, полученного при растворении FVIII в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащего 0,15 M NaCl и 10 мМ CaCl₂. Через три минуты примерно 300 arc сек FVIII адсорбируется на кювете с иммобилизованным 203А205G тромбином и примерно 300 arc сек FVIII адсорбируется на кювете с иммобилизованным 77Е203А205G тромбином.

Затем обе кюветы промывают 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 2М NaCl и 30 мМ бензамидина, и регенерируют. После этого кювету с иммобилизованным 203А205G тромбином и кювету с 77Е203А205G тромбином, в каждую, добавляют по 100 мкл 50 нМ раствора растворимого ТМ (Cosmo Bio Co., Ltd.), полученного при растворении растворимого ТМ в 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 NaCl. Через три минуты примерно 100 arc сек ТМ адсорбируется на кювете с иммобилизованным 203А205G тромбином и примерно 20 arc сек ТМ адсорбируется на кювете с иммобилизованным 77Е203А205G тромбином.

Приведенные выше результаты показывают, что дополнительное замещение глютаминовой кислоты на лизин в положении 77 в цепи В производного 203А205G тромбина приводит к снижению количества адсорбированного Fbgn примерно на одну треть и к снижению количества адсорбированного ТМ примерно наполовину относительно адсорбции фактора свертывания крови 8 на кювете.

Дополнительно результаты анализа с использованием программы IAsys FAST FIT PROGRAM (Nissei Sangyo Co., Ltd.) показывают, что константа связывания Fbgn составляет 10,8 нМ и FVIII-связывающая способность составляет 5,07 нМ для 203А205G, тогда как для 77Е203А205G тромбина Fbgn-связывающая способность составляет 190 нМ и FVIII-связывающая способность составляет 22,5 нМ.

Был сделан вывод, что 77Е203А205G тромбин, описанный в экспериментальном примере 13, обладает большей способностью к увеличению ЧАТВ, чем 203А205G тромбин, что определяется повышением FVIII-специфичности к Fbgn, вызванным замещением лизина в положении 77 в цепи В.

Экспериментальный пример 14

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «77Е203А205A99N тромбин»), в котором глицин в положении 203 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 в цепи В замещен аланином, аспарагиновая кислота в положении 99 в цепи В замещена аспарагином и лизин в положении 77 замещен глютаминовой кислотой

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 77Е203А205A99N тромбина. На SEQ ID NO: 29 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 77Е203А205A99N тромбин.

Проводят экспрессию 77Е203А205A99N тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, при этом не выявлено полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 77Е203А205A99N тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Определение ЧАТВ в крови с добавлением 77Е203А205A99N тромбина

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 77Е203А205A99N тромбина, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Аналогично, раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля, равное 41 с, тогда как значение ЧАТВ для 77Е203А205A99N тромбина составляет 39 с. Как указывалось выше, показано, что 77Е203А205A99N тромбин обладает связывающей способностью с гелем гирудина, но не обладает достаточным анти-ЧАТВ эффектом, хотя содержит мутацию, которая в достаточной степени снижает активность и Fbgn-связывающую способность.

Экспериментальный пример 15

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «203А тромбин»), в котором глицин в положении 203 в цепи В замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 203А тромбина. На SEQ ID NO: 31 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 203А тромбин.

Проводят экспрессию 203А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 2 мг практически чистого 203А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

Определяют активность 203А тромбина по разложению субстрата тромбина в соответствии с методикой В. На Фиг.20 показаны полученные результаты. Цепь A FXIII, по результатам анализа, образует продукт разложения через 30 мин и более половины цепи А разлагается через три часа.

Далее активность 203А тромбина по разложению субстрата тромбина определяют в соответствии с методикой С. Показано, что сгусток образуется через три часа.

Полученные выше результаты подтверждают тот факт, что 203А тромбин, который несмотря на то, что в непатентном документе 5 рассматривается как производное, которое полностью потеряло свою активность, обладает заметной активностью по разложению субстрата тромбина в том случае, когда 203А тромбин используют в качестве антитромботического агента, как следует из результатов определения активности в рамках метода, включающего использование субстрата тромбина по настоящему изобретению, так что если использовать 203А тромбин в качестве антитромботического агента, возможны проблемы.

Экспериментальный пример 16

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205G43А тромбин»), в котором серин в положении 205 замещен глицином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205G43А тромбина. На SEQ ID NO: 33 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205G43А тромбин.

Проводят экспрессию 205G43А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методу указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1 и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 0,5 мг практически чистого 205G43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Активность 205G43А тромбина по разложению субстрата

Активность 205G43А тромбина по разложению субстрата тромбина, полученного по процедуре указанного выше раздела (1), определяют в соответствии с методикой А. В результате выявлено повышение уровня поглощения после инкубации.

Далее активность 205G43А тромбина по разложению субстрата тромбина определяют в соответствии с методикой В. В результате было показано отсутствие полосы цепи А - активированного продукта FXIII. Было обнаружено, что 205G43А тромбин обладает способностью связываться с С-концевым пептидом гирудина и в значительной степени потерял свою активность. Растворы, полученные при растворении 205G43А тромбина в количестве 24 мкг и 12 мкг соответственно в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют значение ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате было получено, что ЧАТВ в контроле составляет 43 с, тогда как значение ЧАТВ для 205G43А тромбина составляет 62 с и 55 с, что демонстрирует увеличение ЧАТВ в 1,44 раза и в 1,28 раза соответственно.

Эффект образца по увеличению ЧАТВ при добавлении 25 мкг/мл Aht составляет 1,25 раза, а эффект образца по увеличению ЧАТВ при добавлении 24 мкг/мл 205G43А составляет 1,44 раза, так что 205G43А тромбин демонстрирует эффект по увеличению ЧАТВ, превышающий в 1,15 раз или более соответствующий эффект для Aht.

Описанные выше результаты показывают, что 205G32А тромбин, в котором серин и гистидин в активном центре одновременно замещены, демонстрирует высокий эффект по увеличению ЧАТВ без модификации карбоксильных групп даже в низкой концентрации.

Экспериментальный пример 17

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «205А43S тромбин»), в котором серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен серином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205А43S тромбина. На SEQ ID NO: 35 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205А43S тромбин.

Проводят экспрессию 205А43S тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методу указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в Экспериментальном Примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 205А43S тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Определение активности 205А43S тромбина по разложению субстрата

Активность 205А43S тромбина по разложению субстрата, полученного в указанном выше разделе (1), анализируют в соответствии с методикой В. В результате было показано отсутствие полосы цепи А - активированного продукта FXIII. Было выявлено, что 205А43S тромбин обладает способностью связываться с С-концевым пептидом гирудина и в значительной степени потерял свою активность. Далее раствор, полученный при растворении 40 мкг 205А43S тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате было получено, что ЧАТВ в контроле составляет 42 с, тогда как значение ЧАТВ для 205А43S тромбина составляет 72 с, что демонстрирует увеличение ЧАТВ в 1,71 раза. 50 мкг/мл AhT демонстрирует повышающий эффект, равный 1,36 раза, и таким образом, показано, что 205А43S тромбин обладает эффектом про увеличению ЧАТВ по меньшей мере в 1,26 раза или более в сравнении с таковым для Aht. Описанные выше результаты выявляют, что 205А43S тромбин, в котором серин и гистидин в активном центре одновременно замещены, демонстрирует высокий эффект по увеличению ЧАТВ без модификации карбоксильных групп.

(3) Сравнение специфичности по связыванию 205А43S тромбина с Fbgn и FVIII

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,7), содержащий производное 205А43S тромбина и AHT, каждый из них в концентрации 0,1 мг/мл, добавляют в кювету с NHS-активированным СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.). Каждую смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая кювету с иммобилизованным 205А43S тромбином и иммобилизованным AHT. На кювете иммобилизуется примерно 1200 arc 205А43S тромбина. Далее добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования.

К кювете с 205А43S и к кювете с AHT, к каждой, добавляют соответственно 100 нМ Fbgn и FVIII и строят соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.17 показаны полученные результаты. Из Фиг.14 видно, что примерно одинаковое количество Fbgn и FVIII связывается в кювете с AHT, тогда как на Фиг.17 показано, что в кювете с 205А43S тромбином связывается большее количество FVIII, чем Fbgn.

Далее, данные по соотношению связывающих сигналов подтверждают, что соотношение по связывающей способности относительно FVIII и Fbgn повышается примерно в 1,2 раза в сравнении с таковым для Aht.

Дополнительно было показано, что по меньшей мере 205А43S тромбин обладает FVIII-связывающей способностью, эквивалентной таковой для AHT, при сравнении на иммобилизованный белок. Было обнаружено, что 205А43S тромбин обладает более высокой FVIII-специфичностью, чем AHT, который был получен простым превращением серина активного центра в дегидроаланин для минимизации структурных изменений.

Экспериментальный пример 18

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «77Е205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 77 в цепи В замещен глютаминовой кислотой, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 77Е205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 37 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 77Е205А43А тромбин.

Проводят экспрессию 77Е205А43А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 77Е205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг или 25 мкг 77Е205А43А тромбина соответственно в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 45 с, тогда как значение ЧАТВ для 77Е205А43А тромбина составляет 92 с (50 мкг) и 85 с (25 мкг) соответственно, которые демонстрируют увеличение ЧАТВ в 2,04 раза и в 1,89 раз соответственно. 50 мкг/мл 205А43А тромбин в примере 13 демонстрирует увеличение ЧАТВ в 1,7 раза, так что эффект по увеличению ЧАТВ повышается в 1,2 раза в сравнении с таковым до замещения, что определяется замещением глютаминовой кислотой лизина в положении 77 в цепи В.

(3) Оценка антитромбоцитарного действия 77Е205А43А тромбина при использовании тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл ФБР раствора с 77Е205А43А тромбином, который был откорректирован до достижения конечной концентрации 77Е205А43А тромбина, равной 100 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. Однако было показано, что кривая активации соответствует контрольной кривой, так что не было выявлено ингибирующего эффекта.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР раствора. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.27 показаны полученные результаты.

Приведенные выше результаты подтверждают, что 77Е205А43А тромбин специфически снижает Fbgn-связывающую способность за счет замещения глютаминовой кислотой лизина в положении 77 и демонстрирует более сильный эффект по увеличению ЧАТВ, чем 205А43А тромбин, которому свойственен более сильный эффект по ингибированию ЧАТВ за счет усиления FVIII-связывающей способности, вызванного одновременным изменением серина в положении 205 и гистидина в положении 43. При этом 77Е205А43А тромбин не демонстрирует способность по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, однако проявляет эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной М-тромбином.

(4) Определение ЧАТВ для продукта с модифицированными карбоксильными группами

Далее 1 мг/5 мл 77Е205А43А тромбин/0,5 мМ NaCl (pH 6,5) подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч для модификации карбоксильных групп в 77Е205А43А тромбине. Примерно 40% модифицированного продукта получают в солюбилизированном состоянии.

100 мкл растворов, полученных при растворении 50 мкг или 25 мкг 77Е205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группам в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 45 с, тогда как значение ЧАТВ для 77Е205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 119 с (50 мкг) и 89 с (25 мкг) соответственно.

(5) Оценка антитромбоцитарного эффекта 77Е205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами при использовании тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл ФБР раствора с 77Е205А43А тромбином с модифицированными карбоксильными группами, который был откорректирован до достижения конечной концентрации модифицированного 77Е205А43А тромбина 100 мкг/мл в случае добавления 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР раствора в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и определяют время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.28 показаны полученные результаты.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методу, описанному в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР раствора. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. В результате было показано, что 77Е205А43А тромбин с модифицированными карбоксильными группами полностью ингибирует агрегацию тромбоцитов, индуцированную М-тромбином в конечной концентрации 30 мкг/мл.

Приведенные выше результаты подтверждают, что 77Е205А43А тромбин характеризуется повышенным эффектом по увеличению ЧАТВ за счет наличия модификации. При этом 77Е205А43А тромбин демонстрирует ингибирующие эффекты на агрегацию тромбоцитов, индуцированную М-тромбином, и на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином. Однако, как и в случае продукта с модифицированными карбоксильными группами на основе 77Е203А205G тромбина, выход 77Е205А43А тромбина после модификации существенно снижается в связи с замещением глютаминовой кислотой в положении 77 в цепи В в сравнении с выходом для модифицированного продукта 205А43А тромбина.

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «24Е205А43А тромбин»), в котором глютамин в положении 24 в цепи В замещен глютаминовой кислотой, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 24Е205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 39 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 24Е205А43А тромбин.

Проводят экспрессию 24Е205А43А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1 и при этом выявляют несколько полос в протекающей фракции, хотя большая часть полос тромбина отмечается в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1. После этого элюат, содержащий рекомбинантный тромбин, подвергают диализу против 50 мМ NaHCO ₃ (pH 8) и полученный продукт вносят в 5 мл состава в колонке с бензамидином HI TRAP (Pharmacia), которая была уравновешена 50 мМ NаHCO₃ (pH 8). Полученный продукт промывают в достаточной мере с использованием 50 мМ NаHCO₃/0,3 M NaCl (pH 8) и проводят элюцию 50 мМ NаHCO₃/0,3 M NaCl/0,1 М бензамидина (pH 8), получая 1 мг практически чистого 24Е205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

Раствор, полученный при растворении 50 мкг 24Е205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 42 с, тогда как значение ЧАТВ для 24Е205А43А тромбина составляет 62 с.

(2) Сравнение специфичности по связыванию 24Е205А43А тромбина и АНТ с Fbgn и FVIII

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,7), содержащий 24Е205А43А тромбин или AHT в концентрации примерно 0,1 мг/мл, добавляют в кювету с NHS-активированным СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.). Каждую смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая кювету с иммобилизованным 24Е205А43А тромбином и кювету с иммобилизованным AHT (1380 arc и 2400 arc иммобилизуется соответственно). Далее добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования.

К кювете 24Е205А43А и к кювете с AHT, к каждой, добавляют 100 нМ Fbgn и FVIII и строят соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.18 и Фиг.14 показаны полученные результаты.

На Фиг.18 видно, что в кювете с 24Е205А43А тромбином связывается большее количество FVIII, чем Fbgn. Было подтверждено, что 24Е205А43А тромбин имеет высокую специфичность в отношении FVIII.

(3) Сравнение ТМ-связывающих способностей 205А43А тромбина и 24Е205А43А тромбина

В кюветы с иммобилизованными 205А43А тромбином и 24Е205А43А тромбином добавляют 16,7 нМ ТМ и затем 50 нМ ТМ.

На Фиг.19 показаны полученные кривые, характеризующие связывание. Примерно 980 arc 205А43А тромбина иммобилизуется и примерно 1380 arc 24Е205А43А тромбина иммобилизуется.

На основании приведенных выше результатов был сделан вывод о том, что 24Е205А43А тромбин представляет собой производное, обладающее большей специфичностью к FVIII, чем к Fbgn, и что он демонстрирует эффект по увеличению ЧАТВ. Далее было показано, что 24Е205А43А тромбин характеризуется существенно сниженной ТМ-связывающей способностью. В этой связи считается, что мутант тромбина не ингибирует или не блокирует активацию белка С, вызываемую тромбином в живом организме, в случае введения такого мутанта в живой организм.

Экспериментальный пример 20

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205А99А тромбин»), в котором серин в положении 205 замещен аланином и аспарагиновая кислота в положении 99 замещена аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205А99А тромбина. На SEQ ID NO: 41 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 205А99А тромбин.

Проводят экспрессию 205А99А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Активацию экарином проводят по методике, описанной выше в разделе (2) в экспериментальном примере 1, но не отмечается под действием экарина расщепления на цепи А и В.

На основании полученных выше результатов был сделан вывод, что 205А99А тромбин, активированный в форме двух цепей, не может быть получен в эксперименте, в рамках которого 205А99А тромбин экспрессируется в виде претромбина в CHO клетке.

Экспериментальный пример 21

Сравнение значений ЧАТВ для AHT с модифицированными карбоксильными группами, 203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами и 205А43А тромбина

50 мкг/мл каждого из: AHT с модифицированными карбоксильными группами, 203А205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами и 205А43А тромбина растворяют в ФБР и подвергают анализу для определения ЧАТВ по приведенным ниже двум методикам. Для контроля добавляют один только ФБР и определяют ЧАТВ по приведенным ниже методикам «a» и «b». Для максимально возможного предупреждения влияния остаточной активности к AHT с модифицированными карбоксильными группами добавляют 2 мг/мл APMSF реактива (Sigma-Aldrich) после синтеза для инактивации AHT с модифицированными карбоксильными группами и полученный продукт подвергают диализу достаточной длительности против ФБР для удаления остатков APMSF реактива.

Метод «а»: К 100 мкл стандартной плазмы добавляют 50 мкл ЧАТВ реактива и все инкубируют при температуре 37°С в течение 5 мин. К раствору добавляют по 100 мкл каждого из соответствующих образцов и сразу же добавляют 12 мкл 0,1 M CaCl₂. Определяют соответствующие временные интервалы от момента добавления кальция до свертывания.

Метод «b»: К 100 мкл стандартной плазмы добавляют по 100 мкл каждого из соответствующих образцов, растворенных в ФБР, и 50 мкл ЧАТВ реактива. Каждый из растворов инкубируют при температуре 37°С в течение 5 мин. После этого к каждому из растворов добавляют 22 мкл 0,1 M CaCl₂ и определяют соответствующие временные интервалы от момента добавления кальция до свертывания.

Ниже показаны полученные результаты.

Контроль:
	Метод «а» - 43 с	Метод «b» - 45 с
AHT с модифицированными карбоксильными группами:
	Метод «а» - 105 с	Метод «b» - 66 с
203A205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами:
	Метод «а» - 75 с	Метод «b» - 80 с
205А43А тромбин:
	Метод «а» - 67 с	Метод «b» - 77 с
205A43А тромбин с модифицированными карбоксильными группами:
	Метод «а» - 145 с	Метод «b» - 170 с

Как было указано выше, значение ЧАТВ для AHT с модифицированными карбоксильными группами в достаточной мере повышается в соответствии с результатами анализа по методу «а», тогда как значение ЧАТВ для 203A205G тромбина с модифицированными карбоксильными группами и 205A43А тромбина повышается в достаточной мере в соответствии с результатами анализа по методу «b». При этом 203A205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами характеризуется большим эффектом по увеличению ЧАТВ, чем 205A43А тромбин в тех же условиях.

Метод «а» не включает время инкубации смеси стандартной плазмы и соответствующего производного тромбина, тогда как в методе «b» учитывается инкубация смеси стандартной плазмы и соответствующего производного тромбина при температуре 37°С в течение 5 мин. Причиной снижения эффекта по увеличению ЧАТВ у AHT с модифицированными карбоксильными группами по данным анализа по методу «b» является наличие тромбина, который присутствует в очень малом количестве в AHT, который был получен путем химического синтеза из тромбина, которое нельзя не учитывать, и это чрезвычайно малое количество тромбина в условиях инкубирования со стандартной плазмой при температуре 37°С приводит к активации небольшого количества фактора свертывания крови, в особенности FVIII, подавляя таким образом эффект по увеличению ЧАТВ. Тогда как 203A205G тромбин с модифицированными карбоксильными группами и 205A43А тромбин представляют собой производные тромбина, которые полностью утратили свою активность в результате проведения методики генной рекомбинации. В этой связи активация фактора свертывания крови не происходит, даже если инкубацию проводят со стандартной плазмой. Скорее, значение ЧАТВ значительно повышается при проведении инкубации, поскольку происходит уравновешивание, так что хорошо отражается субстратная специфичность.

В свете приведенного выше обсуждения можно видеть, что производное тромбина и производное указанного тромбина с модифицированными карбоксильными группами, используемые в качестве антитромботических агентов, полностью инактивируются и имеют однородные функции в контексте методов генной инженерии, в сравнении с ситуацией использования AHT, который может быть контаминирован очень малым количеством тромбина. Соответственно производное тромбина и производное указанного тромбина с модифицированными карбоксильными группами согласно настоящему изобретению рассматриваются как агенты, демонстрирующие стабильную и высокую лекарственную эффективность.

Экспериментальный пример 22

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «77А205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 77 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 77А205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 43 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 77А205А43А тромбин.

Проводят экспрессию 77А205А43А тромбина по методу, приведенному в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике указанного выше раздела (2) в экспериментальном примере 1 и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как в пике элюции отмечается полоса, эквивалентная полосе тромбина. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 77А205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

Далее определяют связывающую способность с гепариновым гелем по методике F и получают элюат в том же положении элюции (то есть А50%), что и в случае человеческого тромбина дикого типа. Было подтверждено, что связывающая способность с гепарином сохраняется даже в том случае, когда проводят замещение аминокислот в активном центре и экзосайте I.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг и 25 мкг 77А205А43А тромбина в 1 мл ФБР соответственно, добавляют, каждый, к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что ЧАТВ в контроле составляет 45 с, тогда как значение ЧАТВ для 77А205А43А тромбина составляет 90,5 с и 85 секунд соответственно, что указывает на то, что значение ЧАТВ увеличилось в 2,01 раза и в 1,89 раза соответственно. 205А43А тромбин в концентрации 50 мкг/мл в экспериментальном примере 12 имел эффект по увеличению ЧАТВ, равный 1,7 раз, и таким образом замещение аланином лизина в положении 77 в цепи повысило эффект по увеличению ЧАТВ в 1,2 раза.

(3) Определение ЧАТВ для продукта с модифицированными карбоксильными группами

Далее 1 мг/5 мл 77А205А43А тромбина/0,5 мМ NaCl (pH 6,5)/0,5 М NaCl подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч, для модификации карбоксильных групп в 77А205А43А тромбине. Получают примерно 85% модифицированных производных в солюбилизированном состоянии.

100 мкл раствора, полученного при растворении 50 мкг или 25 мкг 77А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 45 с, тогда как значение ЧАТВ для 77А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 144 с и 109 с, соответственно.

(4) Определение протромбинового времени (ПВ)

Растворы, полученные при растворении 50 мкг 77А205А43А тромбина и 77А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами, каждого, в 1 мл ФБР добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.), используют в качестве контроля и определяют ПВ. Используют PT реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что значение ПВ в контроле составляет 23 с, тогда как значение ПВ для 77А205А43А тромбина составляет 24 с, и значение ПВ для 77А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 25 с, где оба тромбина демонстрируют эффект по увеличению ПВ. На основании указанных выше результатов можно сделать вывод о том, что замещение лизина аланином в положении 77 в цепи В повышает эффект по увеличению ЧАТВ в сравнении с ситуацией до замещения. Кроме того, что замещение лизина на аланин в положении 77 в цепи В повышает эффект по увеличению ЧАТВ также и в модифицированном продукте. Дополнительно не отмечается существенного снижения выхода в случае модификации в сравнении с ситуацией, когда используют глютаминовую кислоту для замещения в положении 77 в цепи В, и, таким образом, было показано, что аланин лучше подходит для модификации в положении 77 в цепи В.

Экспериментальный пример 23

(1) Экспрессия производного тромбина (далее называемого как «65А205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 65 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 65А205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 45 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 65А205А43А тромбин.

65А205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 65А205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг и 25 мкг 65А205А43А тромбина в 1 мл ФБР соответственно добавляют, каждый, к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что ЧАТВ в контроле составляет 42 с, тогда как значение ЧАТВ для 65А205А43А тромбина составляет 93 с и 86 с, что указывает на повышение эффекта по увеличению ЧАТВ в 2,21 раза и 2,05 раза соответственно. 65А205А43А тромбин в концентрации 50 мкг/мл в экспериментальном примере 12 имел эффект по увеличению ЧАТВ, равный 1,7 раз, что указывает на повышение эффекта по увеличению ЧАТВ в 1,3 раза при замещении лизина на аланин в положении 65.

(3) Определение ЧАТВ для продукта с модифицированными карбоксильными группами

Далее 1 мг/5 мл 65А205А43А тромбин/0,5 мМ NaCl (pH 6,5)/0,5 М NaCl подвергают диализу против 0,25 М сложного глицинэтилового эфира/0,5 М NaCl (pH 6,5) при температуре 4°С в течение 3 ч. После этого к полученной смеси добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с достижением его концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубируют при температуре 25°С в течение 1 ч, для модификации карбоксильных групп в 65А205А43А тромбине.

100 мкл раствора, полученного при растворении 50 мкг или 25 мкг 65А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив, доступный от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате получают значение ЧАТВ для контроля 41 с, тогда как значение ЧАТВ для 65А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 184 с и 88 с, соответственно.

(4) Определение протромбинового времени (ПВ)

Растворы, полученные при растворении 50 мкг 65А205А43А тромбина или 65А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами соответственно в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ПВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.), используют в качестве контроля и определяют ПВ. Используют ПВ реактив, доступный от Sigma-Aldrich в виде «тромбопластина с кальцием». В результате было получено, что значение ПВ в контроле составляет 23 с, тогда как значение ПВ для 65А205А43А тромбина составляет 22 с и значение ПВ для 65А205А43А тромбина с модифицированными карбоксильными группами составляет 25 с, где оба тромбина практически не демонстрируют эффекта по увеличению ПВ.

(5) Оценка антитромбоцитарного эффекта для 65А205А43А тромбина при использовании тромбоцитемического образца

Метод оценки 1: Сразу после отбора крови 10 мл цельной крови с добавленной лимонной кислотой подвергают центрифугированию при 800 об/мин в течение 15 мин, получая 2 мл тромбоцитемического образца из супернатанта. Далее кровь подвергают центрифугированию при 2800 об/мин в течение 10 мин, получая тромбоцитемический образец. 100 мкл раствора ФБР раствора с 65А205А43А тромбином, который был откорректирован до конечной концентрации 65А205А43А тромбина, равной 100 мкг/мл при добавлении 100 мкл раствора, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. Затем к смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР, служащего в качестве индицирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,4)/0,15 М NaCl и проводят эксперимент по ингибированию агрегации тромбоцитов. Не отмечается разницы между контролем и 65А205А43А тромбином.

Метод оценки 2: Проводят эксперимент по методике, приведенной в методе оценки (1), за исключением того, что в качестве индуцирующего вещества используют 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР и добавляют 65А205А43А тромбин до достижения его конечной концентрации 100, 50, 25 и 10 мкг/мл соответственно. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.29-31 показаны полученные результаты.

Метод оценки 3: 1 мкг/мл М-тромбина/ФБР в качестве индуцирующего вещества объединяют с соответствующими ФБР растворами модифицированного 65А205А43А тромбина, который был откорректирован до достижения конечных концентраций 65А205А43А тромбина 36, 18, 9 и 4,5 мкг/мл соответственно в случае добавления 100 мкл раствора. Эксперимент проводят по методике, приведенной в методе оценки 1. На Фиг.32, Фиг.33 и Фиг.34 показаны полученные результаты.

Метод оценки 4: 100 мкл ФБР раствора с модифицированным 65А205А43А тромбином, который был откорректирован до достижения конечных концентраций модифицированного 65А205А43А тромбина 36 мкг/мл, добавляют к 130 мкл тромбоцитемического образца. К смеси добавляют 35 мкл 5 мг/мл ристоцетина/ФБР в качестве индуцирующего вещества. Для контроля к 130 мкл тромбоцитемического образца добавляют 100 мкл ФБР и записывают время, в течение которого проба становится прозрачной. На Фиг.35 показаны полученные результаты.

Из указанных выше результатов видно, что 65А205А43А тромбин обладает более высоким эффектом по увеличению ЧАТВ, чем 205А43А тромбин, и демонстрирует более сильный ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов, индуцированную М-тромбином, в более низкой концентрации, чем 205А43А тромбин. Кроме того, модифицированный 65А205А43А тромбин демонстрирует эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированный ристоцетином, и в то же время демонстрирует относительно намного более высокий эффект по ингибированию активности рецептора тромбина, чем другие производные.

(6) Сравнение специфичности по связыванию для 65А205А43А тромбина и 205А43А с Fbgn и FVIII

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,7), содержащий 65А205А43А тромбин или 205А43А тромбин, каждый в концентрации 0,1 мг/мл, добавляют в кювету с NHS-активируемым СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.) соответственно. Каждый из растворов перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая кювету с иммобилизованным 65А205А43А тромбином (связывается примерно 1800 arc). Затем добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования. К кювете с 65А205А43А тромбином добавляют 100 нМ Fbgn и FVIII и строят соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.36 показаны полученные результаты. Из Фиг.36 видно, что в кювете с 65А205А43А тромбином Fbgn-связывающая способность снижается, а специфичность к FVIII повышается в сравнении с соответствующими показателями для 205А43А тромбина.

Было подтверждено, что соотношение между FVIII-связывающей способностью и Fbgn-связывающей способностью повышается в 2,8 раза в сравнении с указанным соотношением до замещения лизина в положении 65 в цепи В.

(7) Сравнение ТМ-связывающих способностей для 205А43А тромбина и 65А205А43А тромбина

В кювету с 65А205А43А иммобилизованным тромбином добавляют 16,7 нМ ТМ и затем 50 нМ ТМ.

На Фиг.37 показаны кривые, описывающие связывание. Иммобилизуется примерно 1800 arc 65А205А43А тромбина.

Из приведенных выше результатов видно, при сравнении с ТМ-связывающей способностью 205А43А тромбина, показанного на Фиг.19, что 65А205А43А тромбин обладает сниженной ТМ-связывающей способностью примерно на 30% от соответствующей величины до замещения лизина в положении 65 в цепи В в расчете на количество иммобилизованного белка. Поскольку ТМ-связывающая способность снижается, был сделан вывод, что 65А205А43А тромбиновый мутант ингибирует или блокирует активацию белка С, вызываемую тромбином в живом организме, когда мутант вводят в живой организм.

Экспериментальный пример 24

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «205G тромбин»), в котором серин в положении 205 в цепи В замещен глицином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 205G тромбина.

205G тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (2) в экспериментальном примере 1, при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как полоса, эквивалентная тромбину, отмечается в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 5 мг практически чистого 205G тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Определение активности 205G тромбина по разложению субстрата

Активность тромбина по разложению субстрата тромбина определяют по указанной выше методике В и полученные результаты показаны на Фиг.42. На линии 7 показан образец, полученный после трехчасовой инкубации. Выявляется полоса FXIII, который подвергся разложению примерно на 50%. Как указывалось выше, 205G тромбин все еще обладает активностью, которая создает проблемы в случае его использования в качестве антитромботического агента.

Экспериментальный пример 25

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «197А205А43А тромбин»), в котором аргинин в положении 197 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 197А205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 47 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 197А205А43А тромбин.

197А205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как полоса, эквивалентная полосе тромбина, отмечается в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 197А205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг или 25 мкг 197А205А43А тромбина в 1 мл ФБР соответственно, добавляют, каждый, к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что значение ЧАТВ в контроле составляет 43,5 с, тогда как значение ЧАТВ для 197А205А43А тромбина составляет 77,5 с и 65 с, соответственно.

Из приведенных выше результатов видно, что 197А205А43А тромбин демонстрирует несколько более сильный эффект по увеличению ЧАТВ, чем до замещения аргинина в положении 197. Дополнительно делается вывод, что замещение аргинина в положении 197 устраняет активность, влияющую на клеточный рост, за счет RGDA последовательности.

Экспериментальный пример 26

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «77S205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 77 в цепи В замещен серином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

Синтез проводят по методике ПЦР с использованием праймера с введенной мутацией, соответствующего ДНК 77S205А43А тромбина. На SEQ ID NO: 49 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 77S205А43А тромбин.

77S205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как полоса, эквивалентная полосе тромбина, отмечается в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 2,5 мг практически чистого 77S205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Раствор, полученный при растворении 50 мкг 77S205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении объемов 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что значение ЧАТВ в контроле составляет 48 с, тогда как значение ЧАТВ для 77S205А43А тромбина составляет 86 с.

Экспериментальный пример 27

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «65A77A205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 77 в цепи В замещен аланином, лизин в положении 77 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

65A77A205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1.

На SEQ ID NO: 51 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 65A77A205А43А тромбин. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 65A77A205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг и 25 мкг или 12,5 мкг 65A77A205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что значение ЧАТВ в контроле составляет 49 с, тогда как значения ЧАТВ для 65A77A205А43А тромбина составляют 145,5 с, 112,5 с и 86,5 с соответственно, что указывает на увеличение ЧАТВ в 2,3 раза и в 1,77 раз соответственно. 50 мкг/мл 205А43А тромбина в примере 12 показал эффект по увеличению ЧАТВ в 1,7 раза, и, таким образом, эффект по увеличению ЧАТВ повысился в 1,35 раза за счет замещения лизина на аланин в положении 65 и лизина на аланин в положении 77 в цепи В.

Было подтверждено, что 65A77A205А43А тромбин обладает чрезвычайно высоким эффектом по увеличению ЧАТВ благодаря синергическому эффекту замещения аминокислот в положениях 65 и 77 в цепи В.

Экспериментальный пример 28

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «65A245A205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 65 в цепи В замещен аланином, аргинин в положении 245 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

65A245A205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1.

На SEQ ID NO: 53 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 65A245A205А43А тромбин. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая 2 мг практически чистого 65A245A205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

Далее определяют связывающую способность с гепарином по методике F и получают элюат при А35%. Афинность к гепарину снижается до 35% относительно афинности, характерной для человеческого тромбина дикого типа. Делается вывод, что снижение афинности к гепарину связано с замещением аминокислот, то есть аргинина в положении 245, который находится в экзосайте II, представляющем собой гепарин-связывающий участок.

(2) Растворы, полученные соответственно при растворении 50 мкг или 25 мкг 65A245A205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что значение ЧАТВ в контроле составляет 42 с, тогда как значения ЧАТВ для 65A245A205А43А тромбина составляют 65 с и 60 с, соответственно.

Указанные выше результаты подтверждают, что 65A245A205А43А тромбин обладает эффектом по увеличению ЧАТВ и имеет сниженную афинность к гепарину в сравнении с соответствующими показателями для человеческого тромбина дикого типа, за счет замещения аминокислот в экзосайте II.

Экспериментальный пример 29

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «65A248A205А43А тромбин»), в котором лизин в положении 65 в цепи В замещен аланином, лизин в положении 248 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

65A248A205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1.

На SEQ ID NO: 55 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 65A248A205А43А тромбин. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая 2 мг практически чистого 65A248A205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

Далее определяют связывающую способность с гепарином по методике F и получают элюат при А35%.

Афинность к гепарину снижается до 35% относительно афинности, характерной для человеческого тромбина дикого типа. Делается вывод, что снижение афинности к гепарину связано с замещением аминокислот, то есть лизина в положении 248, который находится в экзосайте II, представляющем собой гепарин-связывающий участок.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг или 25 мкг 65A248A205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме Sysmex International Reagents Co., Ltd. в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от Sysmex International Reagents Co., Ltd. В результате было получено, что значение ЧАТВ в контроле составляет 45 с, тогда как значения ЧАТВ для 65A248A205А43А тромбина составляют 83 с и 71 с соответственно.

Приведенные выше результаты подтверждают, что как и 65A245A205А43А тромбин, данный 65A248A205А43А тромбин обладает эффектом по увеличению ЧАТВ и имеет сниженную аффинность к гепарину в сравнении с человеческим тромбином дикого типа, за счет замещения аминокислот в экзосайте II.

Экспериментальный пример 30

Сразу после отбора крови 220 мкл цельной крови с добавленной лимонной кислотой добавляют в стеклянную пробирку. Растворы получают при растворении 205А43А тромбина, М-205А43А тромбина и М-65A205А43А тромбина в ФБР в концентрации 100 мкг/мл соответственно. 20 мкл каждого из растворов и 20 мкл ФБР добавляют в стеклянную пробирку. К крови с добавлением каждого из производных тромбина добавляют 30 мкл 0,1 M СaCl₂.

После добавления кальция определяют текучесть каждые 30 с для определения времени, при котором теряется текучесть (то есть времени свертывания). В результате были получены значения времени свертывания 4 мин и 30 с для ФБР, 7 мин для 205А43А тромбина, 8 мин и 30 с для М-205А43А тромбина и 8 мин и 30 с для М-65A205А43А тромбина. 205А43А тромбин, М-205А43А тромбин и М-65A205А43А тромбин, каждый, демонстрируют высокую противосвертывающую способность, даже в цельной крови.

Экспериментальный пример 31

(1) Экспрессия тромбина (далее называемого как «19A205А43А тромбин»), в котором фенилаланин в положении 19 в цепи В замещен аланином, серин в положении 205 замещен аланином и гистидин в положении 43 замещен аланином

19A205А43А тромбин экспрессируют по методике, приведенной в указанном выше разделе (1) в экспериментальном примере 1. На SEQ ID NO: 57 показана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 19A205А43А тромбин. Подтверждают наличие связывающей способности с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (2) в экспериментальном примере 1, и при этом не выявляют полосы в протекающей фракции, тогда как полоса, эквивалентная полосе тромбина, отмечается в пике элюции. Далее проводят очистку с использованием колонки с сульфатированным целлулофином и колонки с С-концевым пептидом гирудина по методике, описанной в указанном выше разделе (3) в экспериментальном примере 1, получая примерно 3 мг практически чистого 19A205А43А тромбина, по данным анализа в ДСН-ПААГ.

(2) Растворы, полученные при растворении 50 мкг или 25 мкг 19A205А43А тромбина в 1 мл ФБР, добавляют к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1 и определяют ЧАТВ. Раствор, полученный при добавлении ФБР к стандартной плазме (Sysmex International Reagents Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1, используют в качестве контроля и определяют ЧАТВ. Используют ЧАТВ реактив от (Sysmex International Reagents Co., Ltd.). В результате было получено, что значение ЧАТВ в контроле составляет 46,5 с, тогда как значения АPTТ для 19A205А43А тромбина составляют 83,5 с и 79 с, соответственно.

Было подтверждено, что эффект по увеличению ЧАТВ несколько повышается в сравнении с ситуацией до замещения, что определяется замещением фенилаланина аланином в положении 19.

(3) Сравнение специфичности по связыванию для 19A205А43А тромбина с Fbgn и FVIII

10 мМ фосфатный буфер (pH 7,7) с производным 19A205А43А тромбина в концентрации примерно 0,1 мг/мл добавляют в кювету с NHS-активированным СМ декстраном (Nissan Sangyo Co., Ltd.). Раствор перемешивают при температуре 25°С в течение 10 мин для иммобилизации исследуемого образца (то есть производного тромбина) в кювете с NHS-активированным СМ декстраном, получая кювету с иммобилизованным 19A205А43А тромбином (связывается примерно 1000 arc). Далее добавляют 0,2 мл 1 М этаноламина (pH 8) для блокирования. К кювете с 19A205А43А тромбином добавляют 100 нМ Fbgn и FVIII и строят соответствующие кривые по связыванию. На Фиг.47 показаны полученные результаты. Было подтверждено, что Fbgn-связывающая способностью снижается, а специфичность к FVIII повышается в кювете с 19A205А43А тромбином в сравнении с 205А43А тромбином.

Промышленная применимость

Производные тромбина по настоящему изобретению могут оказывать стабильный антитромботический эффект даже при использовании в меньшем количестве, чем в случае традиционого производного тромбина. Эффект может быть подтвержден путем определения ЧАТВ, определения времени свертывания цельной крови или по эффекту ингибирования агрегации тромбоцитов в плазме, как описано в примерах. В настоящем изобретении термин «антитромботический эффект» обозначает антитромботический эффект, включающий антитромбоцитарный эффект и противосвертывающий эффект, который включает первичный гомеостаз и вторичный гомеостаз в целом. Производные тромбина по настоящему изобретению обладают антитромбоцитарным эффектом и противосвертывающим эффектом на кровь, например: в звене первичного гомеостаза действуют на рецепторы тромбина, преимущественно включающие GPIb (то есть тромбоцитарный гликопротеиновый рецептор Ib ) и PAR1, ингибируя стимуляцию тромбоцита, в условиях наличия тромбина с модифицированными карбоксильными группами (далее также называемого как «М-тромбин»), ристоцетина или стресса, приводя к ингибированию агрегации и адгезии тромбоцитов; и в звене вторичного гомеостаза ингибируют преимущественно активацию FVIII, что сказывается на специфическом увеличении ЧАТВ.

Соответственно замещение аминокислот активного центра и других аминокислот приводит к получению производных тромбина, характеризующихся различными аспектами в выражении данных эффектов, таких как производное тромбина, которое оказывает высокий эффект по увеличению ЧАТВ, но характеризуются низким антитромбоцитарным эффектом, и производное тромбина, которое демонстрирует высокий эффект по увеличению ЧАТВ и высокий антитромбоцитарный (только PAR1-ингибирующий) эффект. Производные тромбина по настоящему изобретению, в которых замещены аминокислоты активного центра и другие аминокислоты, ингибируют активацию белка С, вызываемую тромбином на ТМ в живом организме.

Далее, в том случае, когда осуществляют модификацию карбоксильной группы в производном тромбина по настоящему изобретению, то не только увеличивается ЧАТВ, но и появляется или контролируется антитромбоцитарный эффект, в особенности ингибирующий эффект на активацию PAR1 и агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином, в зависимости от замещения аминокислоты. Таким образом, может быть получено производное тромбина, оказывающее противосвертывающий эффект на кровь и антитромбоцитарный эффект, которое может быть применено в случае различных тромбозов.