средство, ускоряющее процессы регенерации

Формула изобретения

Применение надземной части живокости высокой (Delphinium elatum L.) в качестве средства, ускоряющего процессы регенерации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и может быть использовано в качестве средства, ускоряющего процессы регенерации в терапии вяло заживающих ран, ожогов, переломов костей [1].

Согласно статистическим данным ежегодно в России регистрируют более 11 миллионов больных с различными ранами травматического происхождения, осуществляют более 1,5 миллионов оперативных вмешательств, выполняемых в условиях стационара, и в пределах 4 миллионов - в поликлиниках. Лечение этой патологии в кратчайшие сроки возможно только при достаточном обеспечении лечебных учреждений современными эффективными ранозаживляющими препаратами [2]. Поэтому, несмотря на большое число предложенных средств, проблема заживления и лечения ран не теряет своей актуальности и в настоящее время. Репаративная регенерация - сложный и многоплановый процесс, который включает в себя накопление в зоне повреждения дермы фибробластов и синтез склеропротеинов, стягивание раны, эпитализацию и др. [3]. В связи с этим на современном этапе развития к новым препаратом и средствам для лечения ранений, повреждений, ожоговой болезни предъявляют более высокие требования. Лечебные препараты должны обладать антисептическими, антибактериальными, бактериостатическими, некролитическими свойствами, оказывать стимулирующее действие на репаративные процессы в ране, усиливать защитные силы организма [4]. Для решения этих задач исследователи и практические врачи все чаще обращают внимание на субстанции природного происхождения, являющиеся источником получения большого количества биологически активных соединений, которые обладают широким спектром фармакологического действия, способны влиять на все стадии патологического процесса и могут быть использованы с целью стимуляции репаративной регенерации [5].

Нами выявлено высокое антиэкссудативное, антимикробное, антигипоксическое и обезболивающее действие у извлечений, полученных из надземной части живокости высокой [6, 7], что несомненно во многом способствует ускорению сроков репаративной регенерации [8].

Наиболее близким по положительному эффекту (базовым) и по природе происхождения является сок алоэ (Succus aloes) - биогенный стимулятор, оказывает общеукрепляющее действие, способствует активации защитных сил организма, ускоряет процессы регенерации. Сок алоэ назначают при лечении гнойных ран, ожогов, воспалительных заболеваний кожи, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [9]. Мы использовали сок алоэ в качестве препарата сравнения.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала высокоэффективных лекарственных средств из растительного сырья, обладающих ранозаживляющим действием.

Поставленная задача достигается тем, что применяют надземную часть живокости высокой (трава) в качестве средства, ускоряющего процессы регенерации.

Впервые показано, что средства, содержащие спиртовые вытяжки из высушенной и измельченной надземной части (травы) живокости высокой 40%-ным этанолом в предлагаемом соотношении, а также сумма алкалоидов, ускоряют процессы регенерации. Авторами не обнаружено сведений в патентной и научной литературе об использовании надземной части (травы) живокости высокой в качестве средства ускоряющего процессы репаративной регенерации.

Ранозаживляющая активность спиртовых вытяжек из надземной части (травы) живокости высокой явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и не является очевидной для специалиста. Технология получения фитопрепаратов на основе надземной части живокости высокой легко воспроизводима в промышленных условиях. Возможно использовать спиртовые вытяжки из высушенной и измельченной травы живокости высокой в качестве средства, ускоряющего процессы регенерации в практическом здравоохранении.

Таким образом, предлагаемое изобретение соответствует критериям патентоспособности "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".

Средства, ускоряющие процессы регенерации, представляют собой спиртовые вытяжки из живокости высокой, содержащие комплекс действующих и сопутствующих веществ, извлекаемых из измельченной травы живокости высокой 40%-ным раствором этилового спирта с последующим отстаиванием и фильтрацией, а также алкалоидную вытяжку, извлекаемую хлороформом и содержащую сумму алкалоидов.

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенного к нему чертежа.

На чертеже изображена скорость уменьшения размера ран (%) за сутки под действием извлечений живокости и сока алоэ в разные периоды репаративного процесса. I этап - 1-я неделя эксперимента (воспаление); II этап - 2-я неделя эксперимента (пролиферация); III этап - 3-я неделя эксперимента (эпителизация).

- Контроль

- Сок алоэ

- Настойка живокости

- Экстракт живокости

- Фракция алкалоидов живокости

Предлагаемые нами средства получают следующим образом.

Пример 1. Извлечение ведут методом мацерации. Собранную в июле траву живокости высокой высушивают, измельчают до 3 мм, 10 г измельченной травы живокости высокой заливают 100 миллилитрами 40%-ного этилового спирта и настаивают в темном месте в течение 10 дней, периодически помешивая. Затем спиртовую вытяжку из высушенной измельченной травы живокости высокой (настойку) процеживают, сырье хорошо отжимают, доводят извлечение до первоначального объема (100 мл) 40%-ным этиловым спиртом, отстаивают в прохладном месте в течение 3-х суток, затем фильтруют через обеззоленный фильтр. Получено 10% растительное средство - 10% настойка живокости высокой. Хранят спиртовую вытяжку из высушенной травы живокости высокой (настойку) в темном прохладном месте.

Пример 2. По 50 г высушенной и измельченной травы живокости высокой загружают в пять экстракторов и в первый из них подают сверху 40%-ный этанол в количестве, создающим слой над сырьем в 5-7 см и оставляют на 24 часа. По истечении указанного срока жидкость из первого экстрактора сливают во второй, а в 1-й экстрактор подают 40%-ный этанол до получения исходного уровня. Через 24 часа производят последовательные сливы из 2-го экстрактора в 3-й, из 1-го во 2-й, а в первый подают свежий растворитель. Через каждые 24 часа повторяют указанные операции до заполнения 5-го экстрактора. Затем из 5-го экстрактора получают 100 мл экстракта, одновременно производя последовательные сливы из 1-го во 2-ой, из 2-го в 3-й, из 3-го в 4-й, а из 4-го в 5-й экстрактор. Через интервал в 24 часа из 5-го экстрактора при аналогичной последовательности передвижки жидкости получаем порциями по 100 мл еще четыре раза жидкий экстракт. Полученные экстракты объединяют (500 мл). Получено растительное средство - экстракт живокости высокой жидкий. Хранят спиртовую вытяжку из высушенной травы живокости высокой (экстракт жидкий) в темном прохладном месте.

Пример 3. 100 г высушенной и измельченной травы живокости высокой обрабатывают 5% раствором натрия гидроксида (рН 9,0) и загружают в перколятор. Через 12 часов после загрузки заливают в него 2000 мл хлороформа. Экстракцию хлороформом проводят на лабораторной установке непрерывного действия, состоящей из перколятора, пленочного испарителя и прямого холодильника. Непрерывная циркуляция растворителя проводится со скоростью 2 л/ч. Продолжительность исчерпывающей экстракции 5 дней. Сконцентрированный хлороформный экстракт сливают через кран испарителя. Последняя порция хлороформного экстракта из перколятора сливается через нижний кран и концентрируется в испарителе. Далее хлороформное извлечение подвергают очистке путем переведения оснований алкалоидов в соли хлористоводородной кислоты и, наоборот, с последующей экстракцией их подходящими растворителями. Затем хлороформный экстракт фильтруют через осушитель (15 г безводного сульфата натрия). На последней стадии полученную сумму алкалоидов сгущают на роторном испарителе под вакуумом. Количественное определение по [9] показало, что выход суммы алкалоидов из надземной части живокости высокой составил 0,23% в пересчете на воздушно-сухое сырье. Получено растительное средство, содержащее сумму алкалоидов.

Ранозаживляющее действие жидкой вытяжки из высушенной и измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10, и жидкой вытяжки из высушенной и измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, а также сухой вытяжки суммы алкалоидов, выделенной из высушенной и измельченной травы живокости высокой, было найдено благодаря экспериментальным исследованиям.

Исследование выполнено на 35 белых беспородных мышах-самках массой 20-25 г (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г.Страсбург, 1986). Эвтаназию производили, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденных Министерством Здравоохранения России. В эксперименте животные были распределены на группы: контрольная, сравнения, опытные. Для сравнительной оценки влияния вытяжек из живокости на регенераторную активность с официнальным препаратом использовали сок алоэ в дозе 10,0 мл/кг. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме. В опытных группах животные получали предлагаемое средство из высушенной и измельченной травы живокости высокой в разных концентрациях. Влияние фитопрепаратов на заживление раневого дефекта изучали на модели "лоскутной раны". На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно через зонд, начиная с первого дня после нанесения раны и в течение всего периода заживления раневого повреждения. Критериями развития патологического процесса служили следующие показатели: общее состояние животных, визуальная оценка состояния самого дефекта и окружающей ткани, средний диаметр раны, скорость уменьшения размера раны за сутки в % по отношению к размеру, определяемому при предыдущем измерении [10]. Оценку эффекта фитопрепаратов осуществляли сравнивая соответствующие показатели животных опытных и контрольной групп.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием параметрического (критерий Стьюдента) и непараметрического (критерий Вил-коксона) методов. Для сравнения результатов экспериментов, где показатели выражались в долях, достоверность определяли с помощью метода углового преобразования Фишера. Значимость различий считали достоверной при Pt, Pu, P 0,05.

Пример конкретного выполнения эксперимента 1.

В ходе выполнения эксперимента предлагаемое средство, содержащее спиртовую вытяжку из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10, в дозе 0,6 мл/кг вводили опытным животным через зонд в желудок в течение 20 дней после повреждающего воздействия. В группах сравнения применяли сок алоэ в дозе 10 мл/кг (базовый препарат) в аналогичном режиме. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме. Ранозаживляющую активность оценивали по скорости заживления раневого дефекта у мышей.

Динамический контроль за процессом заживления ран в эксперименте позволяет оценить этапы репаративной регенерации и влияние исследуемых веществ на них [8]. Согласно полученным данным процент угнетения размера ран за сутки в первую неделю исследования у нелеченных животных составил 6%, за вторую, скорость репарации возрастала до 11%, а к концу эксперимента вновь сокращалась до первоначального уровня (см. чертеж). Таким образом, естественный процесс заживления, отражал стадийность репаративной регенерации, включающей три этапа: I этап (1-я неделя) - воспаление; II этап (2-я неделя) - пролиферация, которая характеризуется повышением митотического индекса и активацией репарации; III (3-я неделя) - эпителизация [10]. Лечение животных жидкой вытяжкой из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг, начиная с первых дней наблюдения, улучшало общее состояние животных. Под влиянием жидкой вытяжки из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг, темпы репаративного процесса на первом этапе ускорялись в 1,9 раза по сравнению с контролем (см. чертеж). Это объясняется высокой обезболивающей, антиэкссудативной и антимикробной активностями извлечений живокости [6, 7], поскольку известно, что подавление патогенной микрофлоры, уменьшение экссудации и снижение ноцицептивной реакции играет ведущую роль в процессах заживления на ранних этапах регенерации и создает условия для последующей репарации [3]. Введение животным препарата сравнения - сока алоэ в дозе 10 мл/кг увеличивало скорость заживления в первую неделю эксперимента в 1,8 раза по сравнению с нелеченными мышами. На втором этапе репаративного процесса под действием жидкой вытяжки из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг, наблюдалась устойчивая тенденция к ускорению в 1,2 раза процессов регенерации относительно контроля (см. чертеж). Необходимо заметить, что вторая фаза репарации тесно связана с процессом роста сосудистой сети, в условиях ярко выраженной гипоксии, существенно замедляющей восстановление тканей [10]. Поэтому для ускорения процессов регенерации на этом этапе нужно создавать условия для улучшения кислородного снабжения раневой поверхности. В данном случае благодаря антигипоксическим свойствам жидкой вытяжки из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг [11], происходило ускорение темпов заживления ран у мышей в этот период. Назначение животным сока алоэ в дозе 10 мл/кг в 1,3 раза ускоряло заживление раны на 2 этапе репаративной регенерации, также в форме тенденции. В последнюю неделю исследований скорость репаративных процессов на фоне применения жидкой вытяжки из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг, незначительно увеличивалась, а введение сока алоэ в дозе 10 мл/кг даже несколько снижало этот показатель относительно нелеченных животных (см. чертеж).

Ослабление общей воспалительной реакции и увеличение скорости репаративной регенерации под действием жидкой вытяжки из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг, приводило к тому, что у большинства мышей в опытной группе наблюдалось заживление раневой поверхности к 20-м суткам эксперимента, тогда как в контроле к этому сроку процесс эпителизации был полностью завершен только у 10% животных (табл.2). Под действием жидкой вытяжки из травы живокости высокой, выделенной 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг, средний диаметр ран достоверно уменьшался, начиная с 3-х суток наблюдения и к концу эксперимента у 40% животных данной группы происходила полная эпителизация раневого повреждения (табл.1, 2). Использование препарата сравнения - сока алоэ в дозе 10 мл/кг достоверно уменьшало средний диаметр ран, начиная с 6-х суток эксперимента, и приводило к заживлению кожного повреждения у 80% мышей (табл.1, 2).

Таким образом, жидкая вытяжка из травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 в дозе 0,6 мл/кг проявляет регенераторную активность, сопоставимую с действием препарата сравнения - сока алоэ.

Пример конкретного выполнения эксперимента 2.

В ходе выполнения эксперимента предлагаемое средство, содержащее спиртовую вытяжку из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, в дозе 0,25 мл/кг вводили опытным животным через зонд в желудок в течение 20 дней. В группах сравнения применяли сок алоэ в дозе 10 мл/кг (базовый препарат) в аналогичном режиме. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме. Ранозаживляющую активность оценивали по скорости заживления раневого дефекта у мышей.

В результате проведенного исследования было показано, что под влиянием спиртовой вытяжки из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, в дозе 0,25 мл/кг темпы репаративного процесса на первом этапе ускорялись в 1,9 раза по сравнению с контролем (см. чертеж). Введение животным препарата сравнения - сока алоэ в дозе 10 мл/кг увеличивало скорость заживления в первую неделю эксперимента в 1,8 раза по сравнению с нелеченными мышами. На втором этапе репаративного процесса под действием спиртовой вытяжки из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, в дозе 0,25 мл/кг наблюдалась устойчивая тенденция к ускорению в 1,4 раза процессов регенерации относительно контроля (см. чертеж). Назначение животным сока алоэ в дозе 10 мл/кг в 1,3 раза ускоряло заживление раны на 2 этапе репаративной регенерации, также в форме тенденции. В последнюю неделю исследований скорость репаративных процессов на фоне введения спиртовой вытяжки из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, в дозе 0,25 мл/кг и сока алоэ в дозе 10 мл/кг незначительно снижалась относительно контрольных животных (см. чертеж).

Под действием спиртовой вытяжки из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, в дозе 0,25 мл/кг средний диаметр ран достоверно уменьшался, начиная с 3-х суток наблюдения, и к концу эксперимента у всех животных данной группы происходила полная эпителизация раневого повреждения (табл.1, 2). Использование препарата сравнения - сока алоэ в дозе 10 мл/кг достоверно уменьшало средний диаметр раны, начиная с 6-х суток эксперимента, и приводило к заживлению кожного повреждения у 80% мышей (табл.1, 2).

Таким образом, спиртовая вытяжка из травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2 в дозе 0,25 мл/кг проявляет ранозаживляющую активность, превосходящую препарат сравнения - сок алоэ.

Пример конкретного выполнения эксперимента 3.

В ходе выполнения эксперимента предлагаемое средство, содержащее сухую вытяжку суммы алкалоидов, выделенную из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг, вводили опытным животным через зонд в желудок в течение 20 дней. В группах сравнения применяли сок алоэ в дозе 10 мл/кг (базовый препарат) в аналогичном режиме. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме. Ранозаживляющую активность оценивали по скорости заживления раневого дефекта у мышей.

Лечение животных сухой вытяжкой суммы алкалоидов, выделенной из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг, начиная с первых дней наблюдения, улучшало общее состояние животных, при этом темпы репаративного процесса на первом этапе ускорялись в 1,8 раза по сравнению с контролем (см. чертеж). Введение животным препарата сравнения - сока алоэ в дозе 10 мл/кг увеличивало скорость заживления в первую неделю эксперимента в 1,8 раза по сравнению с нелеченными мышами. На втором этапе репаративного процесса введение сухой вытяжки суммы алкалоидов, выделенной из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг, обеспечивало устойчивую тенденция к ускорению в 1,3 раза процессов регенерации относительно контроля (см. чертеж). Назначение животным сока алоэ в дозе 10 мл/кг в 1,3 раза ускоряло заживление раны на 2 этапе репаративной регенерации, также в форме тенденции. В последнюю неделю исследований скорость репаративных процессов на фоне введения сухой вытяжки суммы алкалоидов, выделенной из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг и сока алоэ в дозе 10 мл/кг, незначительно снижалась относительно контрольных животных (см. чертеж).

Назначение животным сухой вытяжки суммы алкалоидов, выделенной из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг, приводило к достоверному уменьшению среднего диаметра ран, начиная с 6-х суток наблюдения, и к концу эксперимента у всех животных данной группы происходила полная эпителизация раневого повреждения (табл.1, 2). Использование препарата сравнения - сока алоэ в дозе 10 мл/кг способствовало уменьшению среднего размера ран, начиная с 6-х суток эксперимента, и приводило к заживлению кожного повреждения у 80% мышей (табл.1, 2).

Таким образом, сухая вытяжка суммы алкалоидов, выделенная из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг, оказывает более выраженный ранозаживляющий эффект, чем препарат сравнения - сок алоэ.

Проведенное исследование позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое в изобретении средство из высушенной надземной части (травы) живокости высокой (Delphinium elatum L.) способствует увеличению скорости репаративного процесса и приводит к полной эпителизации раневой поверхности у большинства животных. Эффективность изучаемых фитопрепаратов была на уровне сока алоэ или даже выше (табл.2). Наибольшую активность проявили: сухая вытяжка суммы алкалоидов, выделенная из высушенной и измельченной травы живокости высокой в дозе 0,05 мл/кг, и спиртовая вытяжка из высушенной измельченной травы живокости высокой 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:2, в дозе 0,25 мл/кг.

Таблица 2 Влияние извлечений из живокости высокой на количество животных с зажившими ранами у беспородных мышей-самок
Группа животных	Число животных	Доза, мл/кг, мг/кг	Количество животных с зажившими ранами, %
Сутки наблюдения
15-е	17-е	20-е
Контроль	10	-	0	0	10
Сок алоэ	5	10,0	0	20*	80*
Настойка	5	0,6	0	20*	40*
Экстракт	5	0,25	0	40*	100*
Фракция алкалоидов	5	0,05	17	27*	100*
Примечание: * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем при Р 0,05

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд., переработ., испр., и доп. М.: Новая волна. 2006. 1206 с.

2. Алексеева И.В. Разработка лекарственных форм для лечения ран // Фармация. 2003. № 2. С.43-45.

3. Лукманова К.А., Янгирова З.З., Салихова Н.Х., Зайнутдинова Ф.Н. и др. Изучение ранозаживляющего действия твердых лекарственных форм иммунобиологических препаратов для местного применения // Эксперим. и клинич. фармакология. 2004. Т.67. С.73-75.

4. Убашеев И.О., Назаров-Рыгдылон В.Э., Батарова С.М., Лоншакова К.С. Раны и их лечение в тибетской медицине. Новосибирск: Наука. 1990. 192 с.

5. Кузин М.И., Костюченок Б.А. Раны и раневая инфекция: руководство для врачей. М.: Медицина. 1990. 592 с.

6. Зеленская К.Л., Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н. и др. Углекислотные экстракты пихты и спиртовые экстракты дельфиниума и болиголова в комплексном лечении и профилактике воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей // Современные проблемы фитотерапии. Материалы I Международного съезда фитотерапевтов. Москва. 2006. С.84-88.

7. Нестерова Ю.В., Нагорняк Ю.Г., Попова Е.В. Изучение противовоспалительной активности извлечений из надземной части Delphinium elatum // Итоговая научная конференция ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии": Тез. докл. Томск. 2005. С.30-32.

8. Глубокова И.Б., Колсанов А.В., Колсанова О.А. и др. Репаративные процессы в ранах кожного покрова и методы их нормализации. Новосибирск. 2004. 500 с.

9. Бешитаишвили Л. В., Султанходжаев М.Н., Муджири К.С., Юнусов М.С. Алкалоиды Delphinium tamara // Химия природных соединений. 1981. № 2. С.199-201.

10. Фенчин К.М. Заживление ран. Киев: Здоров'я. 1979. 168 с.

11. Аксиненко С.Г., Поветьева Т.Н., Провалова Н.В. и др. Тканевая гипоксия, вызванная нитропруссидом натрия, и ее коррекция растительными средствами // Бюл. экспер. биол. и мед. Приложение 1. 2007. С.49-53.