штамм bifidobacterium breve ov-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств
Классы МПК: | C12N1/00 Микроорганизмы, например простейшие; их композиции; способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды A23C9/12 сброженные молочные продукты; обработка с использованием микроорганизмов и(или) ферментов A61K35/74 бактерии A23L1/29 изменение питательных свойств пищевых продуктов; диетические продукты A61K8/99 из микроорганизмов |
Автор(ы): | Алешкин Владимир Андрианович (RU), Амерханова Аделаида Михайловна (RU), Афанасьев Станислав Степанович (RU), Алешкин Андрей Владимирович (RU), Жиленкова Ольга Геннадьевна (RU), Воронина Ольга Львовна (RU), Субботина Марина Евгеньевна (RU), Кунда Марина Сергеевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2008-07-15 публикация патента:
20.11.2009 |
Штамм Bifidobacterium breve OV-12 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под № 217. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. breve OV-12 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также обеспечивает расширение арсенала аналогичных средств. 4 табл.
Формула изобретения
Штамм Bifidobacterium breve OV-12, коллекционный номер № 217, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].
Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.
Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3,6].
Применение современных подходов генотипирования бифидобактерии подтвердило присутствие В. breve в составе микрофлоры грудных детей [2, 5, 6, 8].
Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.
Целью настоящего изобретения является штамм Bifidobacterium breve OV-12, который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под № 217.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе биологически активных добавок, капсул, таблеток, суспензий, суппозиториев; ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. breve OV-12 может быть применен в производстве гигиенических средств, например кремов, гелей, косметических масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм В. breve OV-12, в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливающего биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, органическим кислотам, а также внешним воздействиям, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.
Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации штаммов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Морфологические свойства
Клетки штамма В. breve OV-12 представляют собой Грам+ полиморфные, бесспоровые неподвижные крупные палочки с бифуркацией на одном конце, расположенные попарно крестообразно в виде хромосомы, буквы Х, Т, «рожек улитки».
В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии имеют вид «комет» в форме елочек длиной до 1 см. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Физиолого-биохимические свойства
Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания - 37,5-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует мальтозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелецитозу, сахарозу, маннозу, вариабельно сбраживает раффинозу, ксилозу, арабинозу. Не ферментирует салицин, трегалозу, рамнозу, маннозу, эскулин, целлобиозу, сорбитол. На уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.
Генотипирование штамма В. breve OV-12 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу.
Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272015 и EU 272021.
Культуральные свойства
Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Таблица 1 | ||
Накопление биомассы и органических кислот при культивировании штамма В. breve OV-12 на различных питательных средах. | ||
Питательная среда | КОЕ/мл | °T |
Среда для культивирования бифидобактерий (БС) | 5,0×109 | 178 |
МРС | 5,6×109 | 205 |
Гидролизатно-молочная среда | 6,0 ×10 9 | 210 |
Печеночная среда | 5,8×10 9 | 210 |
Молоко восстановленное обезжиренное | 2,0×10 8 | 135 |
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. breve OV-12 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко сквашивает к 24 часам до 90°Т с образованием плотного сгустка. Максимальная кислотность в молоке - 150°Т.
Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот (продуктов метаболизма) в процессе культивирования представлены в таблице 2.
Таблица 2 | ||||
Динамика культивирования штамма В.breve OV-12 в молоке и среде для выделения и культивирования бифидобактерий в стационарных условиях | ||||
Время выращивания после посева, (ч) | Выращивание на молоке | Выращивание на БС среде | ||
°T | КОЕ/мл | °T | КОЕ/мл | |
0 | 18 | 1,2×107 | 34 | 2,lxl06 |
24 | 90 | 2,0×108 | 140 | 3,5х109 |
48 | 135 | 2,2×108 | 260 | 4,0х109 |
Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.
Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных и лабораторных средах с высокими показателями значения КОЕ/мл.
Антагонистическая активность штамма изучалась на плотных питательных средах методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных микроорганизмов.
Результаты, представленные в таблице 3, показали, что В. breve OV-12 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых штаммов.
Таблица 3 | ||
Антагонистическая активность штамма В. breve OV-12 | ||
№ | Штамм тестируемого микроорганизма | Зона задержки роста в присутствии штамма В. breve OV-12, мм |
1 | Staphylococcus aureus ATCC 6538-P | 20±3 |
2 | Shigella flexneri 337 | 28±3 |
3 | Shigella sonnei 177 | 26±5 |
4 | Proteus vulgaris 1274 | 28±2 |
5 | Escherichia coli 157 | 26±3 |
Чувствительность к антибиотикам штамма В. breve OV-12 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4 | ||||||
Антибиотикочувствительность штамма В. breve OV-12 | ||||||
№ | Название антибиотика | Интерпретация зон | Содержание препарата в диске, мкг | Диаметр зоны ингибирования роста в мм | ||
Устойчив | Промежуточно устойчив | Чувствителен | ||||
1 | Бензилпенициллин | | 20-27 | 10 | 37±1 | |
2 | Оксациллин | 11-13 | 10 | 35±0 | ||
3 | Ампициллин | 11-14 | 10 | 40±2 | ||
4 | Карбенициллин | 15-18 | 25 | 42±2 | ||
5 | Азлоциллин | 14-16 | 75 | 40±2 | ||
6 | Цефалотин | 15-18 | 30 | 40±2 | ||
7 | Цефалексин | 15-18 | 30 | 32±2 | ||
8 | Цефазолин | 15-18 | 30 | 30±2 | ||
9 | Цефтазидим | 15-17 | 30 | 33±2 | ||
10 | Цефотаксим | 15-20 | 30 | 35±2 | ||
11 | Имипенем | 14-15 | 10 | 40±0 | ||
12 | Стрептомицин | 17-19 | 30 | 15±2 | ||
13 | Неомицин | 13-16 | 30 | 0±0 | ||
14 | Канамицин | 15-18 | 30 | 0±0 | ||
15 | Гентамицин | 13-14 | 10 | 12±2 | ||
16 | Амикацин | 15-16 | 30 | 0±0 | ||
17 | Тетрациклин | 17-21 | 30 | 27±2 | ||
18 | Доксициклин | 16-19 | 10 | 34±0 | ||
19 | Эритромицин | 18-21 | 15 | 30±0 | ||
20 | Азитромицин | 14-17 | 15 | 20±2 | ||
21 | Кларитромицин | 14-17 | 15 | 25±3 | ||
22 | Рокситромицин | 15-18 | 30 | 37±2 | ||
23 | Линкомицин | 20-23 | 15 | 35±1 | ||
24 | Клиндамицин | 15-20 | 2 | 32±2 | ||
25 | Ванкомицин | 15-16 | 30 | 38±3 | ||
26 | Хлорамфеникол (левомицитин) | | 16-18 | 30 | 21±2 | |
27 | Рифампицин | 13-15 | 5 | 35±2 | ||
28 | Полимиксин | 12-14 | 300 ЕД | 0±0 | ||
29 | Налидиксовая кислота | | 13-17 | 30 | 0±0 | |
30 | Ципрофлоксацин | 16-20 | 5 | 12±2 | ||
31 | Пефлоксацин | 15-21 | 10 | 0±0 | ||
32 | Ломефлоксацин | 19-21 | 10 | 25±2 |
Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, налидиксовой кислоте, амикацину, неомицину, канамицину, пефлоксацину, гентамицину, ципрофлоксацину, стрептомицину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.
Безвредность
В опыте изучения острой токсичности штамма В.breve OV-12 показана его полная безвредность: при введении белым мышам дозы per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×107 КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 10 9 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.
Представленные данные изучения штамма В. breve OV-12 позволяют сделать заключение о перспективности его использования как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.
Пример 1. Использование штамма В. breve OV-12 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.
Пример 2. Использование штамма В. breve OV-12 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий.
Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 106-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.
Пример 3. Использование штамма В. breve OV-12 для получения бактерийного препарата
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.
К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.
Пример 4. Использование штамма В. breve OV-12 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище
Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 109 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы № 0 по 0,4 г. В1 г БАД к пище содержится не менее 10 8 KОЕ жизнеспособных бифидобактерий.
Пример 5. Использование штамма В. breve OV-12 для получения гигиенических и косметических средств
Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. breve OV-12 с содержанием бифидобактерий не менее 10 9 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Пример 6. Использование штамма В. breve OV-12 для получения кисломолочного продукта
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде
до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 108 КОЕ/мл бифидобактерий.
Литература
1. Бондаренко В.М., Мапулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.
2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, № 1-2, с.31.
3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, № 7, с.55.
4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.
5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, № 5, с.9-12.
6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника, - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890-04, 2004., 52 с.
8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерий: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, № 5, с.76-79.
Класс C12N1/00 Микроорганизмы, например простейшие; их композиции; способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды
Класс A23C9/12 сброженные молочные продукты; обработка с использованием микроорганизмов и(или) ферментов
Класс A23L1/29 изменение питательных свойств пищевых продуктов; диетические продукты
Класс A61K8/99 из микроорганизмов