штамм lactococcus lactis subsp.lactis f-119 - продуцент антибиотического комплекса lgs и способ получения антибиотического комплекса lgs с его использованием

Формула изобретения

1. Штамм Lactococcus lactis subsp.lactis 284 - Коллекция микроорганизмов Московского государственного Университета им. М.В.Ломоносова - продуцент антибиотического комплекса LGS.

2. Способ получения антибиотического комплекса LGS, характеризующийся тем, что проводят культивирование штамма продуцента по п.1 в ферментационной среде, содержащей источник углерода, калий фосфорнокислый, магний сернокислый, хлористый натрий, изолейцин и дрожжевой автолизат в количестве, обеспечивающем биосинтез с последующим высушиванием культуральной жидкости, содержащей целевой продукт, и при необходимости разделение его на антибиотики LGS-B и LGS-H, при этом антибиотик LGS-B имеет:

в УФ-спектре (С₂Н₅ОН) _max при 260 нм;

молекулярная масса, (М+Н)⁺, m/z, (MALDI-MS)=506,9;

ТСХ (SiO ₂), R_f=0,75 в системе МеОН-Н₂О (96:4);

при электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик остается на старте;

ИК-спектр (СНСl₃), _mах, см^-1: 3670, 3360, 2850, 1720, 1665, 1450, 1380, 1220-1200, 1120, 1090;

обладает активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и действует на грибы;

относится к группе алкил-ароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы,

а антибиотик LGS-H имеет:

в УФ-спектре (Н₂О) _mах при 215 нм;

молекулярная масса (М+Н) ⁺, m/z, (MALDI-MS)=3161,6;

ИК-спектр (KBr), _max, см^-1: 3600-3400, 3300-3200, 2940, 1700-1650, 1600-1560, 1470-1420, 1350, 1250-1230 1160, 1130, 1060, 1020, 950, 850, 750, 660;

ТСХ (SiO₂ ), R_f=0,0 в системе МеОН-Н₂О (96:4);

при электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик мигрирует к катоду с подвижностью более высокой, чем стандарт низина;

обладает активностью в отношении грамположительных бактерий, включая термостойкую B.coagulans;

по структуре является аналогом низина, отнесен к группе антибиотиков-полипептидов, обладающих основными свойствами.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что высушивание проводят распылительной сушкой или лиофильной сушкой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, молочной, медицинской и микробиологической, консервной промышленностях, как биоконсервант и как пробиотик, поскольку отвечает всем требованиям, предъявляемым к штаммам данного назначения: высокая ферментативная и антибиотическая активность по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, обитающим в сырье, продуктах питания и желудочно-кишечном тракте человека и животных.

В последние годы наблюдается возросший интерес по использованию бактериоцинов или, как их называют в литературе и повседневной практике, «естественных» антибиотиков, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья. Широко используемые химические консерванты и антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е 234) является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков имеющий «GRAS» статус (признанный Европейским парламентом как безопасный). Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается с пищей, не оказывает влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта, не токсичен (Eckburg et al., 2005, Bernbom Nete et al., 2006). Обладая способностью адсорбироваться на поверхности спор чувствительных к нему спорообразующих микроорганизмов - основной причины порчи консервов и пресервов, низин нарушает проницаемость мембран, снижает термоустойчивость спор (Лапинска, 1981, Breukink, E., 1999, Cleveland et al., 2001). Особенно возрос интерес к молочнокислым стрептококкам серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «Gras», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных (Ленглер и др. 2005).

Синтез бактериоцинов - наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.

В настоящее время известны продуценты бактериоцина низина, являющегося по структуре полипептидным антибиотиком, обладающим антибиотической активностью только на грамположительные бактерии.

Известен штамм Lactococcus lactis ВКПМ В-7480 (Streptococcus lactis) - продуцент пищевого полипептидного консерванта, который в конце логарифмической фазы роста образует наибольшее количество низина 11500-12500 МЕ/мл и сбраживающий более широкий спектр углеводов и спиртов. RU 2115724 C1, 20.07.1998.

Известен штамм Lactococcus lactis ВКПМ B-7699 - способный продуцировать пищевой полипептидный консервант низин. Штамм на производственной среде, использующей фермент мегатерин, за 14-16 ч культивирования образует наибольшее количество низина 12800 МЕ/мл. RU 2151796 С1, 27.06.2000.

Известен штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-116 - продуцент антибиотика низина. Штамм является гибридным, полученным при слиянии протопластов низко активных по низину родственных штаммов 729 и 1605, который при культивировании в солевой среде с дрожжевым автолизатом, с содержанием аминного азота 25 мг%, глюкозой, калием фосфорнокислым, магнием сернокислым и хлористым натрием за 8-9,5 ч инкубирования при 25-26°С обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4000-4200 МЕ/мл, SU 1687616 А1, 30.10.1991.

Известен штамм Lactococcus lactis subsp.lactis NRRL-B-18922 - продуцент двух и более низинподобных бактериоцинов. Штамм получен генноинженерным методом переноса плазмид двух штаммов Lactococcus lactis, эффективен против близкородственного штамма Lactobacillus casei 842, с активностью бактериоцинов 1600 МЕ/мл и 400 МЕ/мл с максимумом поглощения при 280 нм и бактериоцином с активностью 3200 МЕ/мл и максимумом поглощения при 230 нм. US 5,348,881, 20.09.1984.

Известен антибактериальный белок - лактибиотик, экспрессируемый штаммом Streptococcus salivarius DSM 13084. Антибактериальный белок является бактерицидным в отношении S. pyogenes. Названный «саливарицин В» относится к антибактериальному белку, имеет молекулярную массу примерно 2733 Да по данным ионной масс-спектрометрии и содержит на N-конце аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gin. Активен в отношении множества видов стрептококков, пригоден в решении проблемы контроля стрептококковых инфекций. RU 2279481 С2, 10.07.2006.

Следует отметить, что использование генетически модифицированных бактерий в пищевой промышленности, в медицинской терапии неприемлемо по закону и этическим причинам. В последние годы в генетико-селекционной практике используют метод слияния протопластов, позволяющего соединить полные геномы и цитоплазмы родительских штаммов и часто происходящий в природе при определенных условиях внешней среды.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является получение без применения мутагенов и генетических манипуляций штамма Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 - продуцента нового антибиотического комплекса, обеспечивающего высокий выход целевого продукта широкого спектра антибиотического действия.

Новый штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 - продуцент двухкомпонентного антибиотика, названного авторами LGS, один из компонентов которого - LGS-B эффективен против грамположительных бактерий по типу низина, второй - LGS-H - отнесен к группе алкилароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы, является антибиотиком широкого спектра действия, ингибирует рост грамположительных бактерий, включая споровые и патогенные формы, например, Bacillus cereus, В.coagulans, В.polymyxa, В.mycoides, Clostridium sp., Listeria monocitogenes, Staphylococcus aureus, Mycobacterium sp., Enterococcus sp., а также грамотрицательные бактерии, такие как бактерии группы кишечной палочки (БГКП) - Е. coli, Serratia sp., a также Salmonella gallinarum, S.typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonas auruginosa, Alcaligenes faecalis.

Штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 хранится и депонирован в Коллекции микроорганизмов Московского государственного Университета им. М.В.Ломоносова под коллекционным номером 284. Штамм является гибридным, получен слиянием протопластов двух родственных штаммов L.lactis subsp.lactis 729 и 1605 с последующим отбором высокоактивных вариантов на селективных средах и культивированием продуцента в ферментационной среде, оптимизированной по содержанию фосфатов, углеводному компоненту, с внесением изолейцина и рН-статированием ферментационного процесса. Полученный штамм продуцирует двухкомпонентный антибиотик в 25 раз больше родительских штаммов, в 1,5 раза больше штамма Lactococcus lactis subsp.lactis F-116, взятого за прототип, и обладает редким свойством для бактерий этого рода, а именно - эффективен против широкого спектра патогенных бактерий. Антимикробный спектр действия штаммов в сравнении с низином представлен в таблице 1.

Таблица 1
Антимикробный спектр действия штаммов F-116,119х и МГУ в сравнении с низином
Тест-культура	F-119	119x	Nisaplin, 4000 МЕ/мл
Bacillus mycoides	21,0	19,0	17,0
Bacillus subtilis	20,0	17,0	18,0
Bacillus coagulans	18,5	16,0	18,0
Clostridium perfringens	18,5	14,0	16,0
Bacillus cereus	21,0	14,0	16,0
Micrococcus luteus	21,0	17,5	18,5
Staphylococcus aureus	20,0	16,0	15,0
Listeria monocytogenes	18,5	16,0	16,0
Salmonella gallinarum	20,0	0	0
Salmonella typhimurium	21,0	0	0
Serratia marcescens	18,0	0	0
Escherichia coli	16,0	0	0
Proteus vulgaris	17,0	0	0
Alcaligenes faecalis	17,0		0
Pseudomonas aeruginosa	18,0	0	0
Pseudomonas fluorescens	15,0	0	0
Fusarium oxysporum	15,0	0	0
Penicillum chryzogenum	16,0		0

Нуклеотидные последовательности гена 16S рНК депонированы в GenBank под номером EF 100778.

Заявляемый штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 имеет следующие характеристики:

Морфологические признаки.

Грамположительные бактерии, бесспоровые, неподвижные, клетки сферической формы до 2 мкм в диаметре, образующие пары или цепочки до четырех кокков. На агаровых средах образуют более блестящие колонии с ровными краями, мелкие с диаметром до 3 мм, поверхностный рост, глубинный рост на твердых агаровых средах возможен, при этом вырастают колонии лодочкообразной формы. Характер роста на агаровых средах с добавлением гидролизата молока, капустного отвара, дрожжевого автолизата в сочетании с солями или МПА идентичен.

Культуральные признаки.

При росте в жидких средах, приготовленных на основе гидролизата молока, глюкозо-дрожжевой с солями наблюдается помутнение, в стерильном обезжиренном молоке образуется плотный сгусток. В мясо-пептонном бульоне с 2-4% хлористого натрия наблюдается рост, а с 6,5% хлористого натрия рост отсутствует; в гидролизате молока с рН 9,2 растет, а при рН 9,6 роста нет. Штамм при 45°С не растет, как и при температуре ниже 10°С. Оптимальной температурой инкубирования является 26°С.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм образует аммиак из аргинина, сбраживает арабинозу, галактозу, маннозу, глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу, сорбит, маннит, декстрин. Является типичным представителем гомоферментативного молочно-кислого брожения, при росте образует до 4,0% молочной кислоты, следовые количества диацетила и ацетоина (по креатиновой пробе). За 9,5 ч инкубирования образует два антибиотика - низин с активностью его в культуральной жидкости до 6900 МЕ/мл. Штамм устойчив к низину, фузидиевой кислоте, рифампицину, неомицину, фагоустойчив, не патогенен. Высокая активность штамма стабильна в течение 22 генераций и при длительном хранении в лиофильном состоянии в ампулах с защитной средой, содержащей, мас.%: желатозу - 11,0, сахарозу - 22,0, глютамат натрия - 4,4, цитрат натрия трехзамещенный - 50,0. Штамм можно хранить при 4-6°С в течение месяца в условиях холодильника в виде молочного сгустка. Перевивку производят посредством внесения сгустка с одной микробиологической петли в стерильное обезжиренное молоко (8-10 мл), засеянный инокулят выращивают при 22-25°С в течение 10-12 ч.

Влияние различных компонентов ферментационной среды на рост и синтез антибиотического комплекса штаммом Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 приведено в таблице 2.

Таблица 2
Состав среды	ОП 540 (10 ч.)	pH	Активность, МЕ/мл
1% мальтозы + 2,0% КН2РO4 + дрожжевой автолизат с содержанием аминного азота 35 мг%	1,15	4,2	4200
С 2% глюкозы + 1,0% КН2РO4 + дрожжевой автолизат с содержанием аминного азота 70 мг%	1,25	4,0	4800
с 2% сахарозы + 1,0% КН2РO4 + дрожжевой автолизат с содержанием аминного азота 70 мг%+0,01% изолейцина	1,48	4,0	6860

Высокая антибиотическая активность в культуральной жидкости достигается при культивировании штамма на средах простого состава при возможности замены основного углеводного субстрата (глюкозы или мальтозы на сахарозу). Антибиотическую активность определяли микробиологическим методом с тест -культурой Bacillus coagulans. Среду для культивирования теста готовили на бульоне Хоттингера с добавлением, мас.%: глюкозы - 1,0, NaCl - 0,2, агар-агара - 2,0. Средой для титрования антибиотика низина служила среда, приготовленная на фосфатном буфере с рН 5,5, и добавлением, мас.%: пептона - 2,0, глюкозы - 1,0, агара - 2,0. Ход определения. Культуральную жидкость вместе с биомассой лактококков экстрагировали ацето-уксусной смесью в соотношении ацетон: кислота: вода, как 4:1:6 при 65°С в течение 1 ч. Для этого 0,5 мл культуральной жидкости разводили в 4,5 мл смеси, ставили на экстракцию, полученный экстракт разводили фосфатным буфером в соотношении 1:10 и 0,12 мкл и вносили в лунки на агаровой среде, засеянной тест-культурой. По зонам ингибирования роста теста за 14 ч роста определяли антибиотическую активность экстрактов в пересчете по калибровочной кривой, полученной при титровании растворов стандартного препарата "Nisaplin" фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия), (Стоянова, Егоров, 1999).

Установлено, что предлагаемый для патентования штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 - продуцирует антибиотический комплекс LGS, содержащий два антибиотических вещества:

1-й антибиотик, названный LGS-B, имеет в УФ-спектре (С₂ Н₅OН) _mах при 260 нм.

Молекулярная масса, (М+Н)⁺, m/z, (MALDI-MS)=506,9;

ТСХ (SiO₂), Rf=0,75 в системе MeOH-H₂O (96:4);

- при электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик остается на старте;

ИК-спектр (СНСl₃), _mах, см^-1: 3670, 3360, 2850, 1720, 1665, 1450, 1380, 1220-1200, 1120, 1090.

Обладает активностью в отношении Гр+ и Гр- бактерий и действует на грибы.

На основании полученных физико-химических данных антибиотик LGS-B отнесен к группе алкил-ароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы.

2-й антибиотик, названный LGS-H, является аналогом низина (низинподобным бактериоцином);

имеет в УФ-спектре (Н₂О) _mах при 215 нм.

Молекулярная масса, (М+Н)⁺, m/z, (MALDI-MS)=3161.6;

ИК-спектр (КВr), _mах, см^-1: 3600-3400, 3300-3200, 2940, 1700-1650, 1600-1560, 1470-1420, 1350, 1250-1230, 1160, 1130, 1060, 1020, 950, 850, 750, 660;

ТСХ (SiO ₂), R_f=0,0 в системе MeOH-H₂O (96:4).

При электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик мигрирует к катоду с подвижностью более высокой, чем стандарт низина;

- обладает активностью в отношении грамположительных бактерий (по типу низина), включая термостойкую В.coagulans.

На основании полученных физико-химических данных антибиотик LGS-H отнесен к группе антибиотиков-полипептидов, обладающих основными свойствами. При разработке способа согласно изобретению было установлено необходимым проводить культивирование штамма L.lactis subsp.lactis F-119 в ферментационной среде, содержащий, мас.%: глюкозу - 1,0, калий фосфорнокислый 1,0, магний сернокислый - 0,02, хлористый натрий - 0,2, изолейцин - 0,01% и дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 70 мг% - остальное с последующим высушиванием культуральной жидкости, содержащей целевой продукт лиофильной или распылительной сушкой.

Полученный антибиотический комплекс LGS, в виде порошка кремового цвета, обладает активностью 1000000-1200000 МЕ/г в пересчете на активность стандартного препарата "Nisaplin" фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия).

При необходимости антибиотики LGS-B и LGS-H можно разделить, проводя для этого: отделение биомассы, экстракцию из нативного раствора целевого продукта, содержащего антибиотики LGS-B и LGS-H, и разделение двух антибиотических веществ.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. При использовании лиофильно высушенного штамма L. lactis subsp.lactis F-119 последний восстанавливают в стерильном обезжиренном молоке и инкубируют при 26-30°С до образования сгустка. Микробиологической петлей сброженный культурой молочный сгусток вносят в 10 мл стерильного обезжиренного молока и инкубируют 9 ч. Затем тем же способом вносят в посевную промежуточную среду состава, мас.%: глюкоза - 1,0, дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 35 мг% - остальное. После 9 ч инкубирования 3% инокулята переносят из посевной среды в ферментационную солевую среду, содержащую, маc.%: мальтозу - 1,0; К₂НРO₄ - 2,0; MgSO₄ - 0,02; NaCl-0,2; дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 35 мг% - остальное. Процесс ферментация ведут 9 ч при комнатной температуре, что обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4200 МЕ/мл.

Пример 2. При использовании лиофильно высушенного штамма L.lactis subsp.lactis F-119 последний восстанавливают в стерильном обезжиренном молоке и инкубируют при 25°С до образования сгустка в ферментационной солевой среде, содержащей, мас.%: глюкозу - 1,0; K₂HPO ₄ - 1,0; MgSO₄ - 0,02; NaCl - 0,2; дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 70 мг% - остальное. Процесс ферментации ведут 9,5 ч при комнатной температуре, что обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4800 МЕ/мл.

Пример 3. Штамм L.lactis subsp.lactis F-119, восстановленный в стерильном обезжиренном молоке, после инкубирования в промежуточной посевной среде состава, как указано в примере № 2, высевают в ферментационную солевую среду, содержащую вместо глюкозы сахарозу - 2,0%, добавляют 0, 01% изолейцина (остальные компоненты в том же количестве). Уровень антибиотической активности при тех же режимах составляет 6860 МЕ/мл. Полученную культуральную жидкость высушивают распылительной сушкой при температуре 50-60°С до достижения конечной влажности порошка 2-3%. Полученный антибиотический комплекс LGS, в виде порошка кремового цвета, обладает активностью 1200000 МЕ/г в пересчете на активность стандартного препарата "Nisaplin" фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия).

Пример 4. Процесс получения антибиотического комплекса LGS ведут аналогично примеру 3, но полученную культуральную жидкость высушивают лиофильной сушкой при температуре замораживания (-40°С), температуре сублимирования - (-30°С), максимальная температура продукта 60°С. Полученный антибиотический комплекс LGS обладает активностью 1000000 МЕ/г в пересчете на активность стандартного препарата "Nisaplin" фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия).

Пример 5. При необходимости антибиотики LGS-B и LGS-H разделяют. Для 1 л культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 с активностью 6800 МЕ/мл, экстрагируют смесью ацетон - уксусная кислота - вода (4:1:5) при 55°С в течение 1,5 ч. После отгона растворителей в вакууме, антибиотик осаждают избытком метанола. Осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают метанолом, затем ацетоном и высушивают в вакууме. Получают около 3,1 г фракции антибиотика LGS-H, содержащего бактериоцин с молекулярной массой, (М+Н)⁺, m/z, (MALDI-MS)=3161.6 а.е.м., УФ-спектром (Н₂O) _mах при 215 нм. При электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик LGS-H мигрирует к катоду с подвижностью более высокой, чем стандарт низина (Низоплин). Антибиотик LGS-H активен в отношении грамположительных бактерий, включая термостойкую В.coagulans.

Из маточного раствора, полученного после осаждения фракции LGS-H, методом экстракции хлороформом с последующей очисткой на колонке с кизельгелем 60 (Merck), получают антибиотик LGS-B с мол. массой, (М+Н) ⁺, m/z, (MALDI-MS)=506,9 а.е.м. и УФ-спектром (С₂ Н₅OН) _max при 260 нм. При электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 час) антибиотик LGS-B остается на старте. Антибиотик LGS-B обладает широким спектром действия, подавляя рост грамположительных бактерий, включая термостойкую В.coagulans, грамотрицательных бактерий (Е.coli) и действует на простейшие грибы.

При ТСХ на пластинках Силуфол (Чехия) в системе MeOH-H₂O (96:4) антибиотик LGS-B имеет R_f=0,75, в то время как антибиотик LGS-H имеет R_f=0,0. В выделенном антибиотическом комплексе соотношение антибиотиков LGS-B и LGS-H составляет (1:4). Выход биологически активных компонентов от активности культуральной жидкости штамма-продуцента составляет 65%.

Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования как продуцента нового антибиотического комплекса LGS, способного синтезировать антибиотический комплекс на среде простого состава с высокой антибиотической активностью и выходом целевого продукта.

Литература

1. Лапинска Е. 1981. Низин и его применение. В кн.: Антибиотики и антибиоз в сельском хозяйстве. М.: "Колос". С.105-134.

2. Ленглер Й., Древс Г., Шлегель Г. 2005. Современная микробиология. Прокариоты. М.: Мир. Т.2, стр.393.

3. Стоянова Л.Г., Егоров Н.С. Сравнительная характеристика новых штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis, полученных методом слияния протопластов // Микробиология. 1999. Т.68. № 2. С.235-240.

4. Breukink Eefjan, Ben de Kruijff. 1999. The lantibiotic nisin, a special case or not?, Biochimica et Biophisica acta 1462, 223-234.

5. Cleveland, J., Montville T.J., Nes I.F., and Chikindas М.L. 2001. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. // Int. J. Food Microbiol. 71. P.1-20.

6. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N. et al. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora. // Scince. V.308. P.1635-1638.

7. European Commission, 1996. List of enzymes, micro-organisms and preparations of these in feedingstuffs that are ahhroved in the various Member States. OJ № 39, Sept. 11, 1996: 3-22.