способ экстракции пенициллинов из плазмы крови

Формула изобретения

Способ экстракции антибиотиков пенициллинового ряда из плазмы крови, включающий адсорбирование аналита, разведенного в фосфатном буфере, на сорбенте C₁₈, элюирование ацетонитрилом, отличающийся тем, что к одной части элюата добавляют одну часть воды и 7 частей хлороформа, перемешивают, центрифугируют при 3000 g 5 мин и верхний водный слой отбирают для последующего анализа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической фармакокинетике, и может быть использовано для определения содержания антибиотиков в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Одним из ведущих компонентов общего медикаментозного лечения воспалительных заболеваний является антибактериальная терапия. Ее основной принцип - сохранение средних терапевтических концентраций препарата в крови, органах и тканях организма [1, 2]. Врачами используются стандартные схемы антибактериальной терапии, описанные в инструкциях по их применению. Между тем снижение терапевтической дозы антибиотиков в организме больного приводит к развитию резистентности микроорганизмов к ним и низкой эффективности проводимого лечения [3, 4]. К сожалению, в клинической медицине редко используются методы слежения за содержанием антибиотика в кровеносном русле [5].

На сегодняшний день в современной терапии гнойно-воспалительных заболеваний актуальной проблемой остается разработка не только новых антибактериальных средств, но и методов их мониторинга.

Существует достаточно много технологий определения антибиотиков в биологических жидкостях, в том числе и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), для которой требуется экстрагировать искомые вещества из плазмы крови.

Известен способ экстракции антибиотиков методом H.J. Nelis et al. (1992) [6], заключающийся в том, что к 0,5 мл плазмы крови больных, которым проводят антибактериальную терапию, добавляют 5 мл 1,8% NaCl и 0,1 мл 1 М краун-эфира (18-crown-6) в метаноле и перемешивают. Картридж с сорбентом СН (cyclohexil) для твердофазной экстракции предварительно промывают 5 мл метанола и 5 мл дистиллированной воды, после чего образец (5,6 мл) наносят на сорбент и пропускают через картридж. Далее картридж промывают 1 мл смеси вода:метанол (9:1 по объему), содержащей 0,1 М краун-эфира. Антибиотики элюируют 3 мл смеси вода:метанол (55:45 по объему). Метанольную фазу элюата упаривают вакуумным насосом при постоянном перемешивании. К водному остатку добавляют 0,1 мл 1 М краун-эфира в метаноле и затем воду до общего объема 3 мл. Полученную смесь наносят на картридж с сорбентом C₁₈, предварительно промытый 5 мл метанола и 5 мл воды. Картридж промывают 1 мл смеси вода:метанол (9:1 по объему), содержащей 0,1 М краун-эфира в метаноле, и антибиотик элюируют 3 мл метанола. Элюат испаряют досуха под вакуумом, сухой остаток растворяют в 0,25 мл применяемой мобильной фазы хроматографической системы и 100 мкл этого раствора подвергают анализу.

Однако данный способ за счет необходимости двойного экстрагирования на различных сорбентах значительно удлиняет время исследования. Способ недостаточно чувствителен, так как в качестве элюента применяется метанол, использование которого при упаривании приводит к разрушению части исследуемых соединений [7] и уменьшению степени экстракции на 20-30%, что существенно затрудняет расчеты концентрации и снижает точность определения.

В качестве прототипа взят способ экстракции антибиотиков по Sorensen L.K. and Snor L.K. (2001) [8], заключающийся в том, что к 2 мл плазмы, содержащей антибиотик, добавляют 20 мл 25 мМ фосфатного буфера с рН 9 и перемешивают. Картридж Oasis HLB (С₁₈) («Waters») для твердофазной экстракции предварительно промывают 2 мл метанола и 5 мл дистиллированной воды, после чего образец (22 мл) самотеком пропускают через картридж со скоростью 1-2 мл в мин. Далее картридж промывают 3 раза 2 мл 25 мМ фосфатного буфера с рН 9 и высушивают досуха в течение 1 мин. Антибиотики элюируют 2,5 мл ацетонитрила, элюат выпаривают досуха при 50°С в потоке азота, остаток растворяют в 600 мкл 25 мМ фосфатного буфера с рН 9. Экстракт фильтруют через целлюлозную мембрану путем центрифугирования при 3000 g 20 мин. К 500 мкл фильтрата добавляют последовательно дериватизационные реагенты и проводят хроматографический анализ.

Однако данный способ экстракции антибиотиков имеет недостатки: 1) способ недостаточно чувствителен за счет многократного разведения пробы и неминуемых потерь аналита; 2) длительность проведения экстракции с упариванием и дериватизацией (минимум 1 час); 3) сложность из-за необходимости применять 2 дериватизационных реагента; 4) антибиотики достаточно термолабильны и повышение температуры даже до 50°С приводит к разрушению части их молекул [9], что существенно затрудняет расчеты концентрации и снижает в последующем точность определения количества антибиотиков.

Для повышения точности способа и сокращения времени проведения экстракции антибиотиков плазму крови разводят 0,5 М Na₂HPO₄ с рН 9,0, элюируют с картриджа LiChroprep RP-18 ацетонитрилом, к 1 части элюента добавляют 1 часть воды и 7 частей хлороформа, перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 g и верхний водный слой применяют для анализа.

Способ осуществляют следующим образом. К 0,5 мл плазмы, содержащей антибиотик, добавляют 0,5 мл 0,5 М Na₂HPO ₄ с рН 9,0 и перемешивают. Картридж LiChroprep RP-18 (C ₁₈) («Merck») для твердофазной экстракции предварительно промывают 0,5 мл хлороформа, 1 мл метанола и дважды 0,5 мл дистиллированной воды, после чего образец (1 мл) самотеком пропускают через картридж со скоростью 2 мл в мин. Далее картридж промывают 0,2 мл воды и высушивают под вакуумом в течение 1 мин. Антибиотики элюируют 0,2 мл ацетонитрила, к элюату добавляют 1 часть (0,2 мл) воды и 7 частей (1,4 мл) хлороформа, перемешивают в течение 1 мин и центрифугируют при 3000 g 5 мин. Отбирают верхний водный слой и проводят хроматографический анализ. Полный экстракционный цикл составляет 15-20 мин, степень экстракции - 84-100%.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что если в прототипе используют упаривание элюата (ацетонитрила с антибиотиком) при 50°С в потоке азота, то в предлагаемом способе избегают этой стадии, по причине того, что упаривание элюента даже при 50°С обусловливает снижение точности способа, так как антибиотики очень термолабильны и часть их молекул может разрушаться при данной температуре [9]. Если в прототипе сухой остаток растворяют в 600 мкл 25 мМ фосфатного буфера с рН 9, который фильтруют через целлюлозную мембрану путем центрифугирования при 3000 g 20 мин, то в предлагаемом способе используют добавление к элюату (ацетонитрилу с антибиотиком) 1 части воды и 7 частей хлороформа, перемешивание и центрифугирование 5 мин при 3000 g, так как применение комбинации ацетонитрил:вода:хлороформ позволяет получать высокую степень экстракции антибиотика из плазмы и экстракты особой чистоты (см. чертеж), что повышает чувствительность способа, а также значительно продлевает срок эксплуатации колонки. Если в прототипе к 500 мкл фильтрата добавляют последовательно 2 дериватизационных реагента и проводят хроматографический анализ, то в предлагаемом способе избегают дериватизации и подвергают анализу верхний водный слой, что существенно уменьшает длительность проведения всего анализа.

Молярность и соотношение используемых реагентов определены экспериментальным путем, при которых регистрируют максимальную степень экстракции, что позволяет улучшить предел детекции определяемого вещества.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1

Больной К., 22 лет, диагноз: острый гнойный периостит нижней челюсти справа. В день поступления проведено вскрытие периостита, назначена стандартная антибактериальная и противовоспалительная терапия. Для мониторинга ампициллина взяли кровь, выделили плазму и к 0,5 мл плазмы добавили 0,5 мл 0,5 М Na₂HPO₄ с рН 9,0, перемешали. Картридж LiChroprep RP-18 («Merck») для твердофазной экстракции предварительно промыли 0,5 мл хлороформа, 1 мл метанола и дважды 0,5 мл дистиллированной воды, после чего образец (1 мл) самотеком пропустили через картридж со скоростью 2 мл в мин. Далее картридж промыли 0,2 мл воды и высушили под вакуумом в течение 1 мин. Исследуемые вещества элюировали 0,2 мл ацетонитрила, к элюату добавили 1 часть (0,2 мл) воды и 7 частей (1,4 мл) хлороформа, перемешали в течение 1 мин и центрифугировали при 3000g 5 мин. Отобрали верхний водный слой и провели хроматографический анализ (см. чертеж).

Для исследования применяют обращенно-фазовую колонку 100×4 мм с сорбентом Диасфер-110-C₁₈ с размером частиц 5 мкм, 8200-9500 ТТ («БиоХимМак») и защитную предколонку 4×3 мм с C₁₈-сорбентом, cat. N 4286 («Phenomenex»), УФ-детекцию при 215 нм, элюент ацетонитрил - 0,01М фосфатный буфер с рН=5,0 - изопропанол (20:80:1 по объему) при скорости потока 500 мкл/мин и давлении 40 бар. Для регистрации хроматограмм используют программно-аппаратный комплекс «Multichrom for Windows» («Амперсенд», Россия).

Степень экстракции ампициллина составила 94,3±0,8%. Предел обнаружения антибиотика в данной хроматографической системе составил 10 нг/мл. Линейная зависимость в диапазоне от 20 до 400 нг. Концентрация антибиотика в крови через 1 час после в/м введения 0,5 г ампициллина составила 2,4 мкг/мл, а через 4 часа она равнялась нулю. Период полуэлиминации составил 0,28 часа. Индивидуальные границы терапевтических концентраций ампициллина в крови колебались от 0,02 до 32,1 мкг/мл.

Пример 2

Больная Л., 21 год, диагноз: абсцесс щечной области справа. Проведено вскрытие абсцесса, назначена стандартная антибактериальная и противовоспалительная терапия. Для мониторинга бензилпенициллина взята кровь, выделена плазма, которая обработана по предлагаемому способу, и проведен анализ аналогично примеру 1 (см. чертеж). Степень экстракции ампициллина составила 89,4±0,7%. Предел обнаружения антибиотика составил 10 нг/мл. Линейная зависимость в диапазоне от 20 до 400 нг. Концентрация антибиотика в крови через 1 час после в/м введения 0,5 г бензилпенициллина составила 5,7 мкг/мл, концентрация через 4 часа составила 0,24 мкг/мл, период полуэлиминации составил 0,66 часа, границы терапевтических концентраций составили 0,03-16,4 мкг/мл.

Данным способом проведено 20 исследований экстрактов плазмы крови (табл.).

Таблица
Параметры экстракции антибиотиков различными способами
	Прототип	Заявляемый способ
Степень экстракции	78-85%	88-100%
Время проведения экстракции	50-60 мин	15-20 мин
Предел детекции	100 нг/мл	10 нг/мл

Воспроизводимость способа оценивали по значению коэффициента вариации (V):

V=(S/M)·100%,

где S - среднеквадратическое отклонение, М - средняя арифметическая. Коэффициент вариации (V) способа составил 5,6%.

Таким образом, предлагаемый способ является более точным, быстрым, менее трудоемким и обладает высокой воспроизводимостью.

Используемая литература

1. Артеменко К.Л. Повышение эффективности антимикробной терапии у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой локализации // Совр. стом. технологии: сб. науч. тр. 7-й науч.-практ.конф. врачей-стоматологов, посвящ. 15-летию стомфак-та АГМУ; под ред. Л.Н.Тупиковой. - Барнаул: АГМУ, 2005. - С.21-23.

2. Клиническая фармакология: учебник; под ред. В.Г.Кукеса. - М.: ГЭОТАР-мед. - 2004. - 936 с.

3. Ушаков Р.В. Химиотерапия гнойно-воспалительных заболеваний ЧЛО: метод, рекомендации / Иркутск, 1994. - 48 с.

4. Царев В.Н. Антимикробная терапия в стоматологии / М.: МИА, 2004. - 144 с.

5. Дутов А.А. О принципах и проблемах терапевтического мониторинга лекарств // Лаборатория. - 2004. - № 4. - С.3-5.

6. Nelis H.J., Vandenbranden J., De Kruif A., De Leenheer A.P. Liquid chromatographic determination of amoxicillin concentrations in bovine plasma by using a tandem solid-phase extraction method // Antimicrobial Agents and Chemotherapy - 1992. - V.36, № 9. - P.1859-1863.

7. Jehl F., Gallion С., Monteil H. High-performance liquid chromatography of antibiotics // J. Chromatography - 1990. - V.531. - P.509-548.

8. Sorensen L.K., Snor L.K. Determination of eight penicillins in serum from cattle and pigs by generic HPLC method // Chromatographia - 2001. - V.53, № 7-8. - P.367-371.

9. Ristuccia P.A. Liquid chromatographic assays of antimicrobial agents // J. Liquid Chromatography - 1987. - V.10, № 2-3. - P.241-276.