применение морфолиновых соединений для предотвращения бактериального заражения

Формула изобретения

1. Применение соединения, имеющего формулу (I), или его соли для предотвращения или снижения образования биопленки на абиотической поверхности или для предотвращения или снижения роста жизнеспособных микробов на абиотической поверхности:



где R₁ представляет собой прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от 8 до 16 атомов углерода в 2- или 3-м положении морфолинового кольца, и R ₂ представляет собой прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, замещенную гидроксигруппой, за исключением альфа-положения, причем сумма атомов углерода в группах R₁ и R₂ составляет, по меньшей мере, 10 и предпочтительно от 10 до 20.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что абиотическая поверхность представляет собой медицинское устройство, устройство для хранения текучей среды, устройство для доставки текучей среды или хирургический инструмент.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что соединение представляет собой делмопинол.

4. Применение по пп.1, 2 или 3, отличающееся тем, что медицинское устройство представляет собой хирургический имплантат.

5. Применение по пп.1, 2 или 3, отличающееся тем, что поверхность представляет собой контактные линзы или образует их часть.

6. Применение по пп.1, 2 или 3, отличающееся тем, что поверхность представляет собой фильтр или трубку для доставки воды.

7. Применение по пп.1, 2 или 3, отличающееся тем, что поверхность пропитана или покрыта соединением.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что поверхность является металлической, пластмассовой, керамической, полистирольной или стеклянной.

9. Применение по п.8, отличающееся тем, что поверхность является металлической.

10. Применение по любому из пп.1-3, 8 и 9, отличающееся тем, что соединение содержится в препарате с контролируемым высвобождением или содержится в устройстве, которое обеспечивает контролируемое высвобождение соединения.

11. Применение тканого материала, содержащего соединение, имеющее формулу (1), или его соль для предотвращения образования биопленки на поверхности.

12. Применение соединения, как оно определено в п.1, для нанесения покрытия на хирургический инструмент перед операцией.

13. Тампон, пропитанный соединением, как оно определено в п.1.

14. Медицинское устройство, покрытое соединением, как оно определено в п.1.

15. Медицинское устройство по п.14, отличающееся тем, что соединение представляет собой делмопинол.

16. Медицинское устройство по п.14 или 15, отличающееся тем, что оно представляет собой хирургический имплантат.

17. Медицинское устройство по п.14 или 15, отличающееся тем, что оно представляет собой контактную линзу.

18. Медицинское устройство по п.14 или 15, отличающееся тем, что оно представляет собой зубной имплантат, катетер, эндопротез сосуда, проволочный проводник катетера или ортопедический протез.

19. Фильтр или трубка для доставки воды, покрытые соединением, как оно определено в п.1.

20. Устройство для хранения или доставки текучей среды, покрытое соединением, как оно определено в п.1.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к предотвращению образования биопленки на медицинских устройствах и на изделиях для хранения содержащихся в них текучих сред.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биопленка может быть описана просто в качестве "сообщества микробов, погруженного в органический полимерный матрикс, прилипающий к поверхности" (Carpentier, 1993. J. Appl. Bacteriol. 75:499-511). Все биопленки содержат три основных ингредиента: микробы, гликокаликс и поверхность. Если один из этих компонентов удаляют, то биопленка не развивается.

Биопленка может образовываться одним видом бактерий, но часто биопленки состоят из многих видов бактерий вместе с грибами, водорослями, простейшими, грязью и продуктами коррозии. Биопленка может образовываться почти на любой поверхности, подверженной воздействию бактерий и некоторого количества воды.

Процесс прикрепления бактерий к доступной поверхности (живой или абиотической) и последующего развития биопленки описан в документе W. Michael Dunne Jr. Clin Microbiol Rev. 2002 Apr; 15(2):155-66. Прикрепление бактерий продиктовано целым рядом переменных величин, включая виды бактерий, состав поверхности, факторы окружающей среды и основные генные продукты.

Простыми словами, биопленка образуется, когда бактерии прикрепляются к поверхности в водном окружении и начинают выделять слизистое, клеевидное вещество, которое может прикреплять их к ряду материалов, таких как металлы, пластмасса, частицы почвы, материалы для медицинских имплантатов и ткань.

Первичная адгезия возникает в результате случайной встречи находящейся в определенных условиях поверхности и планктонного микроорганизма. В качестве упрощения, первичная адгезия между бактериями и абиотическими поверхностями опосредуется неспецифическими (например, гидрофобными) взаимодействиями, тогда как адгезия к живой или безжизненной ткани осуществляется через специфические молекулярные (пектиновые, лигандные или адгезионные) механизмы связывания. Эта стадия является обратимой и диктуется физико-химическими параметрами, определяющими взаимодействие между поверхностью бактериальной клетки и интересующей поверхностью, находящейся в данных условиях.

После первичной адгезии имеет место фаза заякоривания, на которой слабо связанные организмы усиливают адгезию путем продуцирования экзополисахаридов, которые образуют комплекс с поверхностью, приводящий к необратимой адгезии к поверхности.

После того как бактерии необратимо прикрепляются, начинается созревание биопленки. Общая плотность и сложность биопленки увеличивается по мере того, как связанные с поверхностью организмы активно реплицируются (и умирают) и внеклеточные компоненты (продуцируемые прикрепленными бактериями) взаимодействуют с органическими и неорганическими молекулами в окружающей среде с образованием гликокаликса. Экзополисахариды образуют основной компонент (за исключением воды) гликокаликса, который у большинства видов является преимущественно анионным и улавливает питательные вещества, защищая бактерии от факторов окружающей среды. В случае инфицированных биомедицинских имплантатов гликокаликс может включать в себя происходящие из хозяина белки воспалительной реакции или матриксные белки, такие как комплемент, фибриноген и гликозаминогликаны, прикрепленные к имплантату.

Ростовой потенциал биопленки ограничивается доступностью питательных веществ в окружающей среде, попаданием этих питательных веществ внутрь клеток в пределах биопленки и удалением отходов. Оптимальный гидродинамический поток через биопленку способствует росту и перфузии, а не эрозии внешних слоев. Другие факторы, которые контролируют созревание биопленки, включают в себя величину внутреннего рН, снабжение кислородом, источник углерода и осмолярность. При критической массе достигается динамическое равновесие, при котором внешний слой роста (наиболее удаленный от поверхности) продуцирует планктонные организмы. Эти организмы свободно выделяются из биопленки и колонизируют другие поверхности. Клетки, ближайшие к поверхности, переходят в состояние покоя или умирают в результате отсутствия питательных веществ или перфузии, пониженного рН, рO₂ или накопления токсичных побочных продуктов метаболизма.

После заякоривания на поверхности микроорганизмы биопленки осуществляют множество вредных или полезных реакций (с точки зрения человека) в зависимости от условий окружающей среды. Ущерб от микробных биопленок на поверхностях оценивается в биллионах долларов ежегодно при повреждении оборудования, загрязнении продуктов, потерях электроэнергии и медицинских инфекциях. Традиционные способы уничтожения бактерий (такие как антибиотики и дезинфекция) часто неэффективны в отношении бактерий биопленок отчасти благодаря защитной природе гликокаликса. Огромные дозы противомикробных средств, требующихся для очистки систем от бактерий биопленки, нежелательны для окружающей среды (и могут не разрешаться правилами охраны окружающей среды) и невыполнимы с медицинской точки зрения (поскольку количество, требующееся для уничтожения бактерий биопленки, также могло бы оказывать вредное воздействие на пациента).

Хотя поверхности или поверхностные покрытия, которые замедляют адгезию бактерий, и были описаны (например, Sheng etal, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 38:1-5), не было создано ни одного, которое предотвращало бы ее развитие (р.1-11, Lappin-Scott and Costerton, Microbial Biofilms 1995. Cambridge University Press). Поэтому необходимы новые стратегии для контролирования образования биопленки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что делмопинол и его производные могут быть применены для предотвращения или снижения образования биопленки или для обеспечения непатогенного (нежизнеспособного) состояния биопленки. Это может быть использовано в промышленных применениях, включая предотвращение образования биопленки на хирургических устройствах или устройствах для хранения или доставки воды.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения соединение, имеющее формулу (I), или его соль применяют для предотвращения или снижения образования биопленки на поверхности или для предотвращения или снижения роста жизнеспособных микробов на поверхности,

где R₁ представляет собой прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от 8 до 16 атомов углерода в 2- или 3-положении морфолинового кольца, a R₂ представляет собой прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, замещенную гидроксигруппой, за исключением альфа-положения, причем сумма атомов углерода в группах R₁ и R₂ равна, по меньшей мере, 10 и предпочтительно составляет от 10 до 20.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложено применение соединения, как оно определено выше, для обработки хирургических инструментов перед операцией.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен тампон, пропитанный соединением, как оно определено выше.

Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предложено медицинское устройство, покрытое соединением, как оно определено выше.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения фильтр, трубка для доставки воды или емкость для хранения текучей среды (жидкости) покрыты соединением, как оно определено выше.

Согласно шестому аспекту изобретения контейнер, содержащий соединение, как оно определено выше, применяют для обработки поверхности для предотвращения или снижения образования биопленки на поверхности или для предотвращения или снижения роста жизнеспособных микробов на поверхности.

Согласно седьмому аспекту изобретения контейнер включает множество отдельных герметичных упаковок, причем каждая упаковка содержит стандартную (единичную) лекарственную форму соединения, как оно определено выше, в жидкой форме.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение основано на неожиданном открытии, что делмопинол и его производные могут предотвращать или снижать образование биопленки и/или могут обеспечивать неактивность любой бактериальной биопленки, т.е. ее нахождение в нежизнеспособном состоянии. Термин "биопленка", используемый в данном описании, относится к общепризнанному в данной области значению термина, т.е. к сообществу микробов и ассоциированного гликокаликса, прикрепленных к поверхности. В данной области существует целый ряд определений, каждое из которых находится в области охраны настоящего изобретения. Например, Carpentier (см. выше) описывает биопленку как "сообщество микробов, погруженных в органический полимерный матрикс, прилипающий к поверхности"; Costerton (1999 Science 284:1318-1322) определяет биопленку как "структурированное сообщество бактериальных клеток, заключенных в произведенный ими полимерный матрикс и прикрепившихся к инертной или живой поверхности"; Elder (1995 Eye 9:102-109) описывает биопленку в более общих терминах как "функциональный консорциум микроорганизмов, организованных в пределах протяженного экзополимерного матрикса".

Соединения для применения в настоящем изобретении имеют общую формулу (I), как показано выше, где R₁ представляет собой прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от 8 до 16 атомов углерода в 2- или 3-положении морфолинового кольца, и R₂ представляет собой прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, замещенную гидроксигруппой, за исключением альфа-положения, причем сумма атомов углерода в группах R₁ и R₂ равна, по меньшей мере, 10 и предпочтительно составляет от 10 до 20. В предпочтительной форме осуществления соединение представляет собой известное соединение делмопинол, т.е. 3-(4-пропилгептил)-4-(2-гидроксиэтил)морфолин.

Получение соединений, применяемых согласно данному изобретению, описано в патенте US 4894221, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки.

В нижеследующем описании сделана ссылка на "предотвращение или снижение образования биопленки". Однако настоящее изобретение также охватывает обработку поверхностей для предотвращения или снижения образования "активных" биопленок. Активные биопленки представляют собой биопленки, характеризующиеся жизнеспособными микроорганизмами. Соответственно, ссылка на предотвращение образования биопленки включает предотвращение или снижение образования жизнеспособных микробных комплексов или колоний или снижение образования таких комплексов или колоний. "Снижение" измеряют путем сравнения с необработанной поверхностью.

Данные соединения могут применяться для обработки любой поверхности. Фактически любая поверхность - животная, минеральная или растительная (т.е. биотическая или абиотическая) - может быть подходящей для бактериальной колонизации и образования биопленки, включая контактные линзы, корпуса судов, молоко- и нефтепроводы и все разновидности биомедицинских имплантатов и чрескожных устройств; поэтому данные соединения могут применяться для предотвращения образования биопленки на любой из этих поверхностей.

Данные соединения имеют особое преимущество в предотвращении образования биопленок на медицинских устройствах, например хирургических имплантатах, включая искусственные суставы, такие как тазобедренные суставы, ортопедические металлоконструкции, такие как стержни, пластинки и проволока, искусственные/протезные конечности, клапаны сердца, эндопротезы сосудов, контактные линзы и устройства для доставки текучих сред, питательных веществ и лекарственных средств или для удаления текучих сред и отходов, например катетеры. Во избежание неопределенности термин "медицинское устройство", используемый в данном описании, включает устройства и имплантаты, используемые в косметических процедурах. Данные соединения также могут применяться для предотвращения образования биопленки на идентификационных и информационных знаках, или электронных чипах, которые имплантированы субъекту.

Соединение согласно изобретению также может применяться для обработки хирургических инструментов, например хирургических ножей, пил, скальпелей, щипцов и т.д., или любого другого инструмента, используемого в инвазивной хирургической процедуре.

Медицинское устройство может представлять собой имплантат, т.е. устройство, которое вставлено в организм субъекта. В предпочтительном примере осуществления устройство представляет собой хирургический имплантат, который требует разреза, который будет сделан в организме для осуществления имплантации. В особенно предпочтительном примере осуществления устройство, которое подлежит обработке, представляет собой зубной имплантат, например удерживающийся в зубе зубной штифт или винт. Альтернативно, медицинское устройство контактирует с организмом, но не проникает в него, например протезная конечность, гипсовая повязка, контактные линзы или наружный слуховой аппарат.

В контексте контактных линз поверхность контактных линз может быть пропитана соединением по изобретению. Альтернативно, в контексте гидрогельных контактных линз гидрогельный матрикс может быть пропитан соединением. Альтернативно, соединение может находиться в растворе, используемом для хранения или очистки контактных линз.

Субъект, в (или на) которого имплантируют (или с которым приводят в контакт) устройство, может представлять собой человека или животное, т.е. ветеринарные применения находятся в области охраны изобретения.

В характерном случае соединение наносят на поверхность или устройство, подлежащие обработке. Существует множество способов, с помощью которых соединения можно наносить на подходящие вещества, включая нанесение покрытий распылением, излучение и закрепление с помощью ультрафиолетового облучения. Технологии нанесения биоматериалов на медицинские устройства совершенствуются в настоящее время, и эти технологии могут быть использованы в настоящем изобретении. Соответственно, настоящее изобретение охватывает покрытые материалы, в частности медицинские устройства, покрытые соединением формулы I. Фильтр или трубки для доставки воды, покрытые соединением формулы I, также находятся в области охраны настоящего изобретения, поскольку представляют собой покрытые устройства для хранения или доставки текучих сред. Материал, подлежащий покрытию, может быть металлическим, пластмассовым, керамическим, полистирольным или стеклянным. Предпочтительно, материал, подлежащий покрытию, представляет собой металл, например нержавеющую сталь.

Соединение согласно изобретению может быть связано с обработанной поверхностью ковалентной или нековалентной связью. При ковалентном связывании может быть использована линкерная молекула для связывания соединения с поверхностью. Например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой полезный линкерный субстрат, который может быть использован в настоящем изобретении. Аминирование также может быть использовано для обеспечения эффективной линкерной молекулы.

Альтернативно, соединением может быть пропитан матрикс, например полимерный матрикс. Для удержания соединения на поверхности могут быть использованы традиционные биосовместимые полимерные матриксы. Например, поли(органо)фосфазен, гидрофильные гидрогели (например, 2-гидроксиэтилметакрилат; НЕМА) или покрытия на основе силикона (например, фторсиликон) все используются в качестве традиционных покрытий на медицинских устройствах и могут быть использованы для удерживания соединения согласно изобретению. Подходящий способ нанесения покрытия раскрыт в документе US 2005/0187611, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки на него.

В предпочтительном примере осуществления медицинское устройство приводят в контакт с соединением формулы I до или во время введения субъекту (или контакта с субъектом), в (или на) котором будет размещен имплантат. Более предпочтительно, устройство промывают в соединении до или во время контакта с субъектом. Наиболее предпочтительно, промывка имеет место непосредственно перед контактом с субъектом с последующей сушкой для нанесения соединения на устройство.

Предпочтительный пример осуществления изобретения включает определенное количество соединения формулы I, подходящее для однократного нанесения на медицинское устройство или другую поверхность, в контейнере. Предпочтительно, внутренние поверхности контейнера, его внутренняя среда и содержимое (например, делмопинол) являются асептическими, т.е. стерильными и по существу свободными от патогенов и, следовательно, подходящими для применения в медицинской (или косметической) операции, такой как хирургическое вмешательство. Более предпочтительно, наружные поверхности также являются стерильными. Может быть использован любой контейнер, подходящий для хранения текучей среды; предпочтительно, чтобы контейнер можно было герметически закрыть. Предпочтительный контейнер представляет собой саше (небольшой пакет) или мешок, которые можно герметически закрыть в асептических условиях при изготовлении и разрезать или распечатать, когда это необходимо. Предпочтительно, саше изготовлено из гибкого пластмассового или металлического материала; подходящие саше известны в данной области. Другие подходящие контейнеры включают в себя флаконы, сосуды и пробирки из любого материала, предпочтительно стеклянные или пластмассовые. В предпочтительном примере осуществления контейнер представляет собой контейнер для хранения или очистки контактных линз. Размер контейнера (и, следовательно, заданная дозировка соединения, хранящегося в нем), подходящего для различных применений, будет очевидна специалисту в данной области, например тазобедренный имплантат будет требовать большего количества делмопинола, чем (стандартный) катетер. Предпочтительно, чтобы каждый контейнер был предназначен для "однократного применения", т.е. после того как он был открыт и содержимое использовано, его выбрасывают независимо от того, все ли содержимое было использовано. Это имеет преимущество в минимизации любого возможного загрязнения.

Соединение согласно изобретению может находиться в контейнере в любой подходящей концентрации. В характерном случае соединение присутствует в концентрации от 0,01% (мас./об.) до 10% (мас./об.), предпочтительно от 0,1% (мас./об.) до 5% (мас./об.) и наиболее предпочтительно от 1% (мас./об.) до 3% (мас./об.), например 2% (мас./об.). В характерном случае соединение находится в водном растворе, хотя может быть использован любой другой подходящий растворитель, включая спирт.

Соединения формулы I могут быть введены в материал, который используют для контакта с поверхностью, на которой должно быть предотвращено образование биопленки, путем пропитывания ими этого материала. Материал может быть тканым или нетканым. Тканый материал в характерном случае может использоваться для вытирания поверхности; неограничивающие примеры подходящих тканых материалов включают в себя тампон, ткань, салфетку или швабру. Тканый материал может включать натуральные (например, хлопковые) или синтетические (например, нейлоновые) волокна или комбинацию тех и других. В предпочтительном примере осуществления пропитанный материал представляет собой асептический/стерильный материал "однократного применения", подходящий для применения в медицинских условиях, например повязку. Наиболее предпочтительно, материал поставляется в контейнере, описанном выше; контейнер может содержать только пропитанный материал или пропитанный материал и избыток соединения, подходящего для промывки поверхности (кроме или вместо его контактирования с пропитанным материалом).

Соединения формулы I также полезны в других промышленных применениях, где жидкость, например воду, приводят в контакт с поверхностью. В предпочтительном примере осуществления изобретения соединения применяют для предотвращения образования биопленки в системах для доставки или хранения воды или текучих сред (жидкостей), включая системы очистки или транспортировки воды, включающие трубки для доставки воды и емкости для хранения воды.

В другом предпочтительном примере осуществления сама по себе поверхность покрыта или пропитана соединением согласно изобретению. Этот пример осуществления особенно подходит для поверхностей, которые будут оставаться in situ в течение продолжительного периода времени, например для медицинских устройств и систем для доставки воды или текучих сред, описанных выше.

Соединения могут быть приведены в контакт с поверхностью, подлежащей обработке, обычным способом. Например, может быть приготовлен раствор этих соединений, и данный раствор приводят в контакт с поверхностью.

Соединения могут применяться для промывки или вытирания поверхности, как описано выше. В дополнительном предпочтительном примере осуществления соединение распыляют на поверхности. В этом примере осуществления соединение может быть помещено в аэрозольный баллон, флакон для аэрозольного распыления или другое похожее устройство, подходящее для производства капельного тумана, содержащего данное соединение. Это является эффективным способом контактирования больших поверхностей с соединением. Это также особенно эффективно для контактирования с поверхностями, имеющими неудобную форму, или с деликатными поверхностями, такими как контактные линзы.

Соединения можно доставлять в любой подходящей форме, которая обеспечивает желаемый эффект. Соединения могут быть включены в состав препарата с контролируемым высвобождением или храниться в устройстве, которое обеспечивает контролируемое высвобождение соединения. Препарат с контролируемым высвобождением может применяться в комбинации с любым другим примером осуществления изобретения, раскрытым в данном описании, например поверхность может быть пропитана препаратом с контролируемым высвобождением или он может быть доставлен с использованием распыляющего устройства.

Соединение согласно изобретению может применяться в форме любой его соли. В частности, соединение может находиться в форме его кислой соли (например, делмопинола НСl) или при низкой насыщенности раствора - в водных растворах. Поэтому соединение будет удерживаться на поверхности обработанного устройства даже после промывки.

Количество, эффективное для предотвращения образования биопленки, будет совершенно очевидно специалисту в данной области и может быть определено исходя из поверхности, подлежащей обработке.

Изобретение дополнительно описано в следующем не ограничивающем его примере.

Пример

Тестируемые поверхности

В исследование включали следующие тестируемые материалы:

- нержавеющая хирургическая сталь 316 (например, для клапанов сердца),

- титан (например, для тазобедренных имплантатов).

Различные материалы получали в виде дисков с приблизительным диаметром 30 мм и толщиной 1 мм. Эти диски затем помещали на дно чашек Петри.

Тестируемое соединение

Делмопинола гидрохлорид растворяли в ультрачистой воде (UHQ) до концентрации 20 мг/мл (2 мас./об.%). Раствор хранили в темноте при комнатной температуре до применения.

Обработка тестируемых поверхностей делмопинолом

Методика А: Тестируемые поверхности обрабатывали 2 мл 2%-ного водного раствора делмопинола HCl и оставляли неразмешанными в течение 15 минут при комнатной температуре. Весь раствор делмопинола удаляли пипеткой. Лунки затем тщательно промывали три раза 4 мл калийфосфатного буфера, 10 мМ, рН 7,2. Поскольку рКа делмопинола составляет 7,1, то значительная часть соединения будет превращаться в его основание, которое имеет очень низкую растворимость в водных растворах, и поэтому будет оставаться на поверхности и не будет полностью отмываться во время процедуры промывки.

Методика Б: Тестируемые поверхности обрабатывали 2 мл 2%-ного водного раствора делмопинола HCl и оставляли в течение ночи сушиться.

Микроорганизмы

Свежий бактериальный штамм Staphylococcus epidermidis выделяли из кожи и хранили в сухом молоке при -80°С. За сутки до экспериментального применения бактерии переносили в кровяной агар и инкубировали в атмосфере 95% Н₂ и 5% СО₂ при 37°С в течение ночи. Колониеобразующие единицы собирали из кровяного агара и суспендировали в 10 мМ калийфосфатном буфере, рН 7,2, до оптической плотности 0,4 при 600 нм, соответствующей приблизительно 10 ⁸ клеток/мл.

Жизнеспособность бактерий из бактериальной суспензии, выраженную в процентных значениях жизнеспособности, оценивали с помощью метода флуоресцентной микроскопии, используя способ оценки жизнеспособности бактерий путем подсчета живых/мертвых клеток, разработанного фирмой Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, США, в соответствии с инструкциями производителя. Так, SYTO 9 (1,5 мкл) и йодид пропидия (1,5 мкл) смешивали с 1 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,2. Аликвоты по 10 мкл добавляли к 10 мкл клеточной суспензии и анализировали при 1000Х в отношении зеленых/ЖИВЫХ и красных/МЕРТВЫХ клеток во флуоресцентном микроскопе (микроскоп Leitz Aristoplan, снабженный галогеновой лампой и возбуждающим фильтром 470-490 нм).

Во всех случаях жизнеспособность клеточных культур составляла более 95%.

Способ анализа адгезии

4 мл бактериальной суспензии добавляли сверху на покрытые и непокрытые тестируемые поверхности, помещенные в чашки Петри. Клеткам позволяли прикрепляться (адгезировать) в течение 60 мин при 37°С. Неприкрепившиеся клетки удаляли путем промывки поверхности три раза 4 мл буферного раствора. Всю жидкость на поверхности удаляли и прикрепившиеся бактерии визуализировали, используя красители SYTO 9 и йодид пропидия, как описано выше. 10 мкл аликвоту смеси добавляли на поверхность и анализировали через 10 мин инкубации в темноте. Микроскопические изображения прикрепившихся клеток анализировали из 10 полей каждого диска. Эти изображения записывали с помощью цифровой камеры, соединенной с микроскопом, и использовали для усреднения количества прикрепленных клеток в отдельных полях. Количество прикрепленных клеток, а также процент жизнеспособных клеток оценивали, используя математическую программу MATLAB.

Способ анализа открепления

Популяции прикрепившихся клеток получали на покрытых делмопинолом поверхностях, как описано выше. Для того чтобы проанализировать, удалились ли клетки с поверхности с делмопинолом, эти поверхности промывали три раза 2%-ным раствором делмопинола в воде с последующим анализом с помощью флуоресцентной микроскопии.

I. Воздействие покрытия делмопинолом на адгезию

Культуры бактериальных штаммов исследовали в трех экспериментах и представляли средние значения разных экспериментов. Общие (жизнеспособные и нежизнеспособные) количества прикрепленных клеток представлены в Таблице 1.

Сравнение адгезии к поверхностям, покрытым или непокрытым делмопинолом. Числа представляют собой количество клеток на мм² на данных поверхностях, предварительно обработанных или предварительно необработанных 2%-ным раствором делмопинола HCl.

Таблица 1
Эксп. №	Нержавеющая сталь	Титан
Непокрытая	Покрытая	Непокрытый	Покрытый
I	250	739	377	415
II	227	241	1070	110
III	332	273	703	95
Среднее	270	418	717	207

II. Воздействие покрытия делмопинолом на жизнеспособность бактерий

Культуры бактериальных штаммов в трех экспериментах обрабатывали, как описано выше, и средние значения разных экспериментов представлены в Таблице 2.

Сравнение жизнеспособности бактерий на поверхностях, покрытых или непокрытых делмопинолом. Числа представляют собой процент жизнеспособных клеток на данных тестируемых поверхностях.

Таблица 2
Эксп. №	Нержавеющая сталь	Титан
Непокрытая	Покрытая	Непокрытый	Покрытый
I	83	10	69	5
II	28	0	43	11
III	63	17	67	11
Среднее	58	9	60	9

III. Рост прикрепившихся бактерий на обработанных и необработанных поверхностях

Способность бактерий расти на покрытых и непокрытых поверхностях определяли путем добавления 4 мл среды, представляющей собой триптический дрожжевой экстракт, в каждую лунку и инкубации при 37°С. Результаты показывают, что рост на твердых поверхностях ингибируется путем покрытия делмопинолом (Таблица 3).

Таблица 3
Клеточная культура IV	Нержавеющая сталь	Титан
Непокрытая	Покрытая	Непокрытый	Покрытый
Рост через 1 сутки	да	нет	да	нет
Рост через 5 суток		нет		нет

В заключение, покрытые делмопинолом поверхности продемонстрировали значительное снижение жизнеспособности прикрепившихся клеток, и делмопинол значительно ингибировал рост ассоциированных с поверхностью бактерий.