способ лечения птиц при сальмонеллезе, вызванном salmonella typhimurium

Формула изобретения

Способ лечения птиц при сальмонеллезе, вызванном S. typhimurium, включающий оральное введение биопрепарата на основе бактериофагов, отличающийся тем, что используют препарат, полученный путем смешивания в равных объемах в культуральной среде штаммов бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium № 5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см, Phagum Salmonella typhimurium № 8 ME-ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см ³, Phagum Salmonella typhimurium № 9 MM-ДЕП - 1,4х10⁸ БОЕ/см, консервированный 1%-ным раствором хинозола в конечной концентрации в фаговом лизате 0,01%, который вводят индивидуально или групповым способом с питьевой нехлорированной водой в разведении 1:10-1:20 в дозе от 0,25 до 5 мл в зависимости от живой массы птицы каждые 12 ч первые 1-3 суток, затем каждые 48 ч до выздоровления; одновременно дополнительно птице вводят пробиотический препарат Лактобифадол с содержанием в 1 г 80 млн живых клеток бифидобактерий вида В. adolescentis и 1 млн лактобактерий вида L.acidophilum из расчета 0,4 г/кг массы в первые 10 суток лечения, далее 0,2 г/кг массы в течение 20 суток.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к разработке способа лечения сальмонеллеза птиц. Сальмонеллез является одной из самых распространенных бактериальных болезней птиц и наносит значительный ущерб, складывающийся из потерь от гибели птицы, снижения продуктивности, отставания в росте и развитии, снижения оплодотворяемости яиц, потери спортивных, служебных и декоративных качеств.

Известно, что серовариант Salmonella typhimurium (S.typhimurium), относящийся к серогруппе В, - является доминирующим возбудителем сальмонеллеза у уток, гусей (80-90%), голубей (98%). S. typhimurium является также одним из основных возбудителей сальмонеллеза индюков, перепелов, лебедей, фазанов, кур, вызывает сальмонеллез у телят, поросят, других животных и пищевые токсикоинфекции человека [2, 3, 5, 6].

Существующие способы лечения сальмонеллеза птиц предусматривают проведение общих ветеринарно-санитарных мероприятий и ориентированы на широкое применение антимикробных препаратов [2].

Известные способы малоэффективны, так как у сальмонелл отмечается широкий спектр антибиотикоустойчивости, а требования к экологическому качеству продукции птицеводства накладывают ограничения на применение антибиотиков [7].

Существующие вакцины против S.typhimurium птиц не являются лечебными препаратами, не ликвидируют инфекцию полностью, так как не устраняют сальмонеллоносительства [2].

Особенно остро стоит проблема лечения при заражении высокопородной птицы, склонной как к иммунодефицитным состояниям, так и к появлению аллергий на фоне антибиотикотерапии. Проблемным является также иммунологически толерантный молодняк.

Известен также способ лечения сальмонеллеза - птиц с применением активных бактериофагов. Они специфичны, лизируют бактериальную клетку-возбудителя, обеспечивают бактерицидный эффект, в отличие от антибиотиков, не нарушают естественную микрофлору. Фаги могут быть применены с первых дней жизни, не вызывают побочных эффектов и осложнений, экологически безопасны, т.к. после лизиса бактерий-мишеней (сальмонелл) они элиминируются.

Используемые в животноводстве фаговые препараты против сальмонеллеза не могут быть высокоэффективны птице, так как основными компонентами содержат фаги S.dublin, S.enteritidis, S.choleraesuis и S.typhimurium; последний - в невысокой концентрации с ограниченным спектром литической активности.

В промышленном птицеводстве для лечения и профилактики сальмонеллеза кур применяют сальмофаги энтеритидис и пуллорум, но только при инфицировании S.enteritidis и S.gallinarum-pullomm. Эти препараты не эффективны или слабоэффективны при лечении сальмонеллеза, вызванного S.typhi-murium у птиц[1].

Известен также пробиотический препарат Лактобифадол, обладающий лечебно-профилактическим эффектом при сальмонеллезе, эшерихиозе и других желудочно-кишечных болезнях млекопитающих животных и птицы, вызываемых патогенными и условно-патогенными бактериями [4, 8].

В задачу наших исследований входила разработка эффективного способа лечения сальмонеллеза птиц, вызванного Salmonella typhimurium, при повышении экологической безопасности и безвредности применения.

Это достигается применением препарата Бактериофаг тифимуриум в комплексе с пробиотиком Лактобифадол. Предлагаемый способ отличается тем, что используют препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза, содержащий суспензию высокоактивных штаммов бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium № 5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см ³, Phagum Salmonella typhimurium № 8 ME - ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см ³, Phagum Salmonella typhimurium № 9 MM-ДЕП - 1,4×10⁸ БОЕ/см³, консервированный 1%-ным раствором хинозола в конечной концентрации в фаговом лизате - 0,01% орально индивидуально или групповым способом с питьевой нехлорированной водой в разведении 1:10-1:20 в дозе от 0,5 до 5 мл в зависимости от живой массы птицы каждые 12 часов первые 1-3 суток, затем - каждые 48 часов до выздоровления; одновременно применяют пробиотический препарат Лактобифадол с содержанием в 1 г 80 млн живых клеток бифидобактерий вида В.adolescentis и 1 млн лактобактерий вида L.acidophilum из расчета 0,4 г/кг массы в первые 10 суток лечения, далее 0,2 г/кг массы в течение 20 суток.

Бактериофаг тифимуриум специфичен к возбудителю S. typhimurium, содержит суспензию высокоактивных штаммов бактериофагов к Salmonella typhimurium Phagum Salmonella typhimurium № 5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см ³, Phagum Salmonella typhimurium № 8 MЁ - ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см ³, Phagum Salmonella typhimurium № 9 MM-ДЕП - 1,4×10 БОЕ/см³, выделенных Пименовым Н.В. и Чирковой И.В.

Штаммы депонированы в ФГУ ВГНКИ во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ВГКШМ-вет)» г.Москва, в частности:

1. Штамм бактериофага Salmonella typhimurium № 8 MЁ предложен в качестве производственного для изготовления лечебно-профилактических препаратов, депонирован 16 октября 2007 г., регистрационный номер Phagum Salmonella typhimurium № 8 MЁ-ДЕП.

2. Штамм бактериофага Salmonella typhimurium № 5 ТЗ предложен в качестве производственного для изготовления лечебно-профилактических препаратов, депонирован 16 октября 2007 г., регистрационный номер Phagum Salmonella typhimurium № 5 ТЗ-ДЕП.

3. Штамм бактериофага Salmonella typhimurium № 9 MM предложен в качестве производственного для изготовления лечебно-профилактических препаратов, депонирован 16 октября 2007 г., регистрационный номер Phagum Salmonella typhimurium № 9 ММ-ДЕП.

Препарат формируют путем смешивания указанных фагов в равных объемах в культуральной среде, консервированной хинозолом, 1%-ным раствором в конечной концентрации, в фаговом лизате - 0,01%.

Бактериофаг тифимуриум обладает лечебным и профилактическим эффектом, не дает осложнений при передозировке, санирует организм от сальмонеллоносительства, является перспективным компонентом комплексной системы профилактики сальмонеллезной инфекции.

Пробиотик Лактобифадол включает в 1 г 80 млн живых клеток бифидобактерий вида В.adolescentis и 1 млн лактобактерий L.acidophilum, которые характерны для микробиоценоза животных. Обладает свойствами синбиотика, штаммы устойчивы к широкому диапазону pH, желчи, имеют выраженную кислотообразующую, антагонистическую, ферментативную активность. Изготовлен методом контактно-сорбционной сушки биомассы, обеспечивающей максимальную сохранность биологических свойств микроорганизмов-доноров нормальной пристеночной микрофлоры.

Способ осуществляют следующим образом:

Больной птице после подтверждения диагноза вводят Бактериофаг тифимуриум: птице массой до 1 кг - 0,5 мл (голубям, перепелам, попугаям, канарейкам, цыплятам), птице массой 1-5 кг (фазанам, курам, уткам) - 1 мл, птице массой 5-10 кг (уткам, индоуткам, селезням, гусям, лебедям) - 3 мл, птице массой 10-20 кг (гусям, лебедям, индюкам) - 5 мл 1 раз в сутки. Молодняку голубей, перепелок - в дозе 0,25 мл. Препарат применяют перорально индивидуально или групповым способом с питьевой, кипяченой и остуженной до 25-30°С водой в разведении из расчета по объему 1:10-1:20 или из расчета разведения на 5-10 мл воды на 1 кг живой массы птицы. Не допускается для разведения хлорированная вода или обработанная и содержащая другие дезинфектанты. В течение трех часов до выпаивания препарата птицу выдерживают без поения.

При лечении сальмонеллеза, вызванного S.typhimurium длительность курса с применением бактериофага каждые 12 часов устанавливают индивидуально, исходя из тяжести эпизоотического процесса и используемых средств терапии. Основная схема применения: каждые 12 часов в первые 1-3 суток, затем - каждые 48 часов 2-3 введения.

Одновременно с бактериофагом с первых суток лечения больной птице назначают пробиотик Лактобифадол в лечебной дозе 0,4 г/кг массы ежедневно в течение 10 суток, далее 0,2 г/кг массы в течение 20 суток.

Применение бактериофагового препарата и Лактобифадола при необходиморсти можно сочетать с лечением эффективным антибиотиком.

Пример 1

Испытание эффективности препарата бактериофага тифимуриум и пробиотика Лактобифадола в остром опыте проводили на 30 цыплятах 14-дневного возраста в сентябре 2007 г. в виварии ФГОУ ВПО МГАВМиБ. Для этого были созданы три группы: две опытные (по 10 цыплят) и контрольная (10 цыплят), которых кормили и содержали по принципу аналогов.

Заражение цыплят всех групп проводили смесью из 2 изолятов S.typhimurium (с вирулентностью для белых мышей при подкожном инъецировании 4 тыс. микробных клеток) в одинаковом количестве каждого изолята орально в общей дозе 2 млн микробных клеток (дозу определяли, используя оптические стандарты мутности энтеробактерий).

После появления клинических признаков заболевания (потеря аппетита, одышка, угнетение, взъерошенность оперения, иногда - диарея) цыплятам первой опытной группы орально вводили Бактериофаг тифимуриум из расчета 0,5 мл при помощи автоматической пипетки-дозатора. Обработку проводили трижды с интервалом 12 часов, а затем с интервалом 48 часов еще 2 раза. За три часа до выпойки бактериофага тифимуриум цыплят выдерживали без поения. Суспензию Лактобифадола вводили ежедневно из расчета 0,4 г на 1 кг живой массы. Цыплятам второй опытной группы использовали стандартный метод лечения с использованием энрофлоксацина - энрофлон 10%-ный раствор в дозе 0,5 мл на 1 л воды 5 дней согласно временного наставления.

Цыплят контрольной группы бактериофагом тифимуриум не обрабатывали и инфицировали смесью культур S.typhimurium в тех же дозах, что и в опытных группах.

За птицей наблюдали 15 дней, после чего проводили убой. Бактериологическое исследование трупов павших и убитых цыплят проводили по схеме: посевы из паренхиматозных органов, крови сердца и красного костного мозга на МПА, МПБ, агар Эндо, висмут-сульфитный агар, окраска мазков-отпечатков и мазков растущих культур по Граму, реакция агглютинации с O-комплексными и О- и Н-агглютинирующими монорецепторными сальмонеллезными сыворотками. Результаты лабораторных испытаний представлены в таблице.

Эффективность применения Бактериофага тифимуриум и Лактобифадола в лабораторных условиях (n=10)
Группа	Всего, голов	Пало, голов	Сохранность, %	Цыплят, из органов которых выделена S typhimurium
голов	%
Опытная 1 (бактериофаг+Лактобифадол)	10	0	100	0	0
Опытная 2 (энрофлоксацин)	10	3	70	2	20
Контрольная	10	9	10	10	100

Проведенные исследования показали, что в контрольной группе летальность составила 90%. Все павшие цыплята имели характерные клинические признаки и патологоанатомические изменения: одышку, потерю аппетита, диарею, энтерит, ринит и др. При бактериологическом исследовании из печени с желчным пузырем, крови сердца, крови костного мозга, головного мозга, селезенки этих цыплят выделили S.typhimurium, обладающую характерными свойствами.

Применение с лечебной целью бактериофагового препарата в сочетании с пробиотиком Лактобифадол обеспечило выраженный лечебный эффект при непосредственном заражении вирулентными изолятами S.typhimurium в высоких дозах. Сохранность цыплят при таком способе лечения составила 100%, сроки выздоровления 3-5 дней, а сальмонеллоносительства на 15 сутки не было установлено.

Сочетанное применение Бактериофага тифимуриум и Лактобифадола более эффективно по сравнению с традиционной схемой лечения энрофлоксацином, так как в опытной группе 2 летальность составила 30%, а скрытое носительство 20%.

Пример 2. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум и пробиотика Лактобифадол на голубятнях в Подольском и Домодедовском районах Московской области.

Клиническая картина сальмонеллеза у голубей проявлялась взъерошенностью оперения, угнетением, одышкой, потерей координации движения, потерей способности к полету, иногда - «вертячкой», отказом от корма; помет становился жидким серого и зеленого цвета с примесью крови и слизи; у некоторых голубей проявлялся ринит. Диагноз был подтвержден бактериологическими исследованиями и методом молекулярной диагностики (ПЦР).

В сентябре 2006 года в двух голубятнях в п.Поливанове Подольского района Московской области (всего 175 голубей: пермские, гривуны, свердловские, синие) болезнь выявили при заболеваемости 14,3% и ежедневной гибели 3 голубей (1,7%). При этом вспышка была отмечена на фоне применения байтрила. Выделенная S.typhimurium обладала высокой чувствительностью к клафорану, средней - к ампициллину, низкой - к энрофлоксацину, ципрофлоксацину, доксициллину, резистентностью - к азитромицину, гентамицину, эритромицину, тетрациклину, мономицину, оксициллину, линкомицину. Проведенный курс терапии бактериофагом тифимуриум в дозе 0,5 мл на голубя при групповой выпойке с водой в разведении 1 к 20 трижды с интервалом 48 часов и дачей с кормом Лактобифадола в дозе 0,4 г/кг в течение 10 дней, далее в дозе 0,2 г/кг массы еще в течение месяца остановили развитие заболеваемости и гибели птицы. С 3-х суток после начала лечения состояние заболевших голубей улучшилось, появилась активность, восстановился аппетит. Консистенция помета постепенно нормализовалась, его цвет к 4-6 суткам стал светло-коричневым. Через 14 суток при бактериологическом исследовании смывов из клоаки больных и других голубей из исследуемых голубятен п.Поливанове (всего 47 проб - 27,3%) бактерии рода Salmonella не выделялись. При контрольных исследованиях в ПЦР через 30 дней - положительных результатов не было в 20 пробах крови из оздоровленных голубятен. В период наблюдения 6 месяцев рецидивов сальмонеллеза не отмечали.

В голубятне г.Домодедово (150 голубей: почтовые) вспышка сальмонеллеза возникла в осенний период 2005 года. При этом заболеваемость среди молодняка 2-3-месячного возраста, полученного от основных самок, составила 100%, заболеваемость среди всех голубей - 80% (120 из 150) с летальностью 65% (78 из 120 голубей) при полной гибели молодняка в течение 22-дневного периода. Клинически болезнь проявлялась в виде водянистых фекалий серого цвета, иногда с примесью зелени и крови, быстрой потери живой массы, дегидратации, уменьшения мышечной массы в области киля (голуби «сохли»), угнетения. В 19 случаях (15,8%) - в виде нервных явлений: дрожь, - запрокидывание головы, «вертячка». До применения Бактериофага и Лактобифадола владелец выпаивал птице энрофлон и бактисубтил, что ослабило развитие эпизоотического процесса, но не остановило инфекцию. Из трупов голубей выделили высоковирулентный изолят S.typhimurium (LD₅₀ для белых мышей массой 12-16 г - 5495 кл. при подкожном инъецировании), обладающий низкой чувствительностью и резистентностью к 28 тестируемым антибиотикам, кроме имипенема. Применение последнего не представляется возможным для птиц из-за необходимости внутривенного введения.

Выпойку бактериофага тифимуриум в неблагополучной голубятне проводили согласно разработанной и использованной в лабораторном эксперименте схеме. Обработку проводили трижды с интервалом 12 часов, затем еще трижды с интервалом 48 часов. Лактобифадол давали в дозе 0,4 г/кг массы в течение первых 10 дней лечения, далее в -дозе 0,2 г/кг массы еще в течение 20 суток. Параллельно в голубятне провели дезинфекцию 4%-ным раствором хлорамина.

Случаи гибели голубей прекратились со вторых суток предложенного и примененного способа лечения. Фекалии в течении 3-4 дней приобрели естественную консистенцию и цвет, голуби начали активно потреблять корм (зерно, мука). Восстановление живой массы отмечалось к 20-30 дню после прекращения диареи. При бактериологических исследованиях смывов из клоаки от 50 голубей бактерий рода Salmonella не выделяли.

Пример 3. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум и пробиотика Лактобифадол на фазанах и утках передвижного частного зоопарка «Ташир».

Заболеваемость уток, фазанов и других птиц сальмонеллезом наблюдали в частном передвижном зоопарке (вольеры в автофургонах, приписанных к государству Армения) в ноябре 2005 г. Взрослая птица имела матовое взъерошенное оперение, угнетение. У фазанов 4-5 месяцев отмечали периодически жидкий помет зеленого цвета, отставание в росте. Клиническая картина острого заболевания проявлялась преимущественно у молодых фазанов и характеризовалась повышением температуры тела до 42,5-43,0°С, угнетением, понижением аппетита, взъерощенностью оперения. Из 28 фазанов разных пород типичную клиническую картину заболевания отмечали у 6(21%). 2 фазана 3-месячного возраста пали. S.typhimurium выделяли из смывов клоаки всех фазанов. Диагноз был подтвержден бактериологическими исследованиями и методом молекулярной диагностики (ПЦР).

В вольерах содержались также утки, которые положительно реагировали в ПЦР на сальмонеллез. При бактериологическом исследовании у них из клоаки в 100% случаев выделена S.typhimurium. В 25-40-дневном возрасте среди утят отмечалась инфекция с развивитием унетения, анорексии, повышения температуры до 43,5-44°С, диареи и гибели (пали 5 утят из 8).

Выпойку Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза проводили групповым способом всей птице зоопарка из расчета: перепелам - по 0,5 мл препарата, фазанам, уткам - по 1 мл, селезням, павлинам - по 3 мл, гусям, лебедям - по 5 мл трижды д. с интервалом 12 часов, четвертую и пятую выпойки - через 48 часов. Препарат растворяли в воде из расчета 1:20. За три часа предварительно птицу оставляли без поения. Лактобифадол давали ежедневно всей птице в течение 10 дней в дозе 0,4 г/кг массы, далее в течение 20 дней в дозе 0,2 г/кг массы.

На 3 сутки после начала лечения состояние птицы улучшилось, температура нормализовалась, восстановился аппетит, помет оформился и приобрел серо-коричневую окраску. Гибель птицы больше не отмечали. При бактериологическом анализе смывов из клоаки у всех фазанов, уток, перепелов и павлинов зоопарка, проведенном через 15 суток, бактерий рода Salmonella не выделяли.

Проведенные исследования показали эффективность способа лечения сальмонеллеза птиц, вызванного S.typhimurium. Бактериофагом тифимуриум и пробиотиком Лактобифадол.

Такой способ лечения позволяет:

а) с помощью видоспецифичного бактериофагового препарата лизировать бактериальную клетку-возбудителя, обеспечивая без применения антибиотика бактерицидный эффект;

б) применять фаги с первых дней жизни, поскольку они элиминируются после лизиса бактерий-мишеней (сальмонелл), не вызывают побочных эффектов, аллергий и других осложнений;

в) добиваться неспецифического терапевтического эффекта за счет двух видов бактерий, входящих в пробиотический препарат Лактобифадол (лакто- и бифидобактерии), которые относятся к доминирующим по численности и физиологической значимости родам резидентной микрофлоры кишечника птицы. Они обладают выраженной антагонистической активностью в отношении гнилостной, патогенной и условно-патогенной микрофлоры, что обеспечено синтезом лизоцима, интерферонов, перекиси водорода, органических кислот, других антагонистических механизмов, включая конкурентную адгезию на слизистой кишечника и иммуномодулирующие эффекты;

г) получить более выраженный терапевтический эффект без последующего скрытого сальмонеллоносительства за счет специфического воздействия на возбудителя Бактериофага тифимуриум и неспецифического терапевтического действия пробиотика Лактобифадол, что обеспечивает эффективное воздействие на разные мишени патологического процесса, приводит к суммарному терапевтическому эффекту и подтверждается результатами лечения.

Предложенный способ апробирован с положительным результатом в сентябре 2007 г. в виварии ФГОУ ВПО МГАВМиБ на цыплятах 14-дневного возраста; в сентябре 2006 года в двух голубятнях поселка Поливанове Подольского района Московской области на голубях пород пермские, гривуны, свердловские, синие; на почтовых голубях в городе Домодедово Московской области в октябре-ноябре 2005 года; в ноябре 2005 г. в городе Москве в частном передвижном зоопарке «Ташир» (Армения) на фазанах, утках, перепелах и павлинах.

Предложенный способ найдет применение для оздоровления птицеводческих хозяйств, питомников, вольеров и голубятен, неблагополучных по сальмонеллезу, вызванному S.typhimurium, позволит резко сократить и ликвидировать сальмонеллез птиц, получать здоровый приплод, поголовье и улучшить качество мяса птицы.

Источники информации

1. Ганюшкин В.Л. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. - Ульяновск, 1988. - 84 с.

2. Гусев В.В. Сальмонеллезная инфекция у голубей. / Гусев Вал. В., Гусев Вик. // «Птицеводство» № 5; 2003. - С.48-53

3. Гусев В.В. Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей. Дис. на степ. канд. биол. наук. - Оболенск, 2005 г. - С.48-53).

4. Данилевская Н.В. Метод селективной деконтаминации и бактериотерапии с использованием пробиотического препарата лактобифадол при выращивании цыплят-бройлеров. / Данилевская Н.В., Субботин В.В. // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве. Матер. Межд. науч. - практ. конф. - СПб., 2004. - С.237-238.

5. Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В. и др. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур. - М. МГАВМиБ., 2002 г. - 35 с.

6. Осидзе Д.Ф. Биологические и химиотерапевтические средства профилактики и лечения заболеваний продуктивных животных. / Сб. ст. ВГНКИ., 1983. - 122 с.

7. Пименов Н.В. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных от домашних голубей. / Пименов Н.В., Данилевская Н.В. // «Ветеринария». - 2006. - № 9. С.20-24.

8. Субботин В.В Применение пробиотического препарата лактобифадол при откорме бройлеров. / Субботин В.В., Данилевская Н.В. // «Ветеринария и кормление», 2004, № 1. С.11-13.