соли ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты и ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека на их основе

Формула изобретения

1. Соли ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты общей формулы:

,

,

при этом:

, или

, или

,

или Y=COOH,

,

,

при этом

2. Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека, включающий соединение глицирризиновой кислоты, отличающийся тем, что названным соединением являются соли ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологически активным веществам, производным глицирризиновой кислоты, и может использоваться в медицине, вирусологии, фармакологии, например в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека.

Известно, что глицирризиновая кислота - основной ингредиент экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и солодки уральской (Gl. Uralensis), обладает высокой биологической активностью и является высокоэффективным средством в лечении различных заболеваний. Так, она применяется при лечении вирусных гепатитов, входит в перечень препаратов (который насчитывает около 50 наименований), подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека in vitro. Названная кислота оказывает противовирусное, противовоспалительное, противозудное и иммуномодулирующее действие, действует на разные типы ДНК и РНК вирусов in vitro и in vivo (Varicella zoster; Herpes simplex 1 и 2 типа; различные типы вируса папилломы человека, в т.ч. онкогенные), прерывает репликацию вирусов на ранних стадиях, вызывает выход вириона из капсида, тем самым не допуская его проникновение в клетки, что связано с селективным дозозависимым ингибированием фосфорилирующей киназы Р. Глицирризиновая кислота взаимодействует со структурами вируса (возможно, с белками), изменяя различные фазы вирусного цикла, что сопровождается необратимой инактивацией вирусных частиц, находящихся в свободном состоянии вне клеток, блокирует внедрение активных вирусных частиц внутрь клетки, нарушает способность вируса к индукции синтеза новых вирусных частиц, индуцирует образование интерферона, что является одним из компонентов противовирусного действия, инактивирует указанные вирусы в нетоксичных для нормально функционирующих клеток концентрациях. Мутантные штаммы вирусов герпеса, резистентные к ацикловиру, также высокочувствительны к глицирризиновой кислоте, как и немутантные штаммы. Противовоспалительная активность глицирризиновой кислоты сочетается со стимулирующим влиянием на гуморальные и клеточные факторы иммунитета.

Производные глицирризиновой кислоты так же, как и сама кислота, обладают высокой биологической активностью. В частности, пента-O-никотинат глицирризиновой кислоты, 3-(b-D-2,3,4-три-о-никотинилглюкуронпиранозил)1 2(а-D-3,4-ди-О-никотинилглюкуронпиранозил глицирретовой кислоты (ниглизин, НГ) используются для ингибирования репродукции вируса Марбург [Патент РФ

№ 2088232]. Гликопептид глицирризиновой кислоты обладает анти-СПИД-активностью [Патент РФ № 2024546]. Ди и триникотинаты глицирризиновой кислоты являются высокоактивными ингибиторами репродукции вируса иммунодефицита человека и могут использоваться в чистом виде или в качестве основы новых высокоэффективных лекарственных форм для лечения СПИДа [Патент РФ № 2304145].

Как самостоятельные препараты используются соли глицирризиновой кислоты. Например, Глицирам (Glycyrramum), в котором действующим веществом является аммония глицирризинат (ammonium glycyrrhizinate) - монозамещенная аммонийная соль глицирризиновой кислоты, используется для лечения бронхиальной астмы средней тяжести, синдрома отмены (для снижения дозы преднизолона у детей с крайне тяжелыми формами бронхиальной астмы), астенического состояния и гипотонического синдрома различного происхождения, гипофункции коры надпочечников, экземы и аллергических дерматитов, дерматозов у детей, болезни Аддисона - диэнцефально-гипофизарных форм и др.

Препарат Фосфоглив (Phosphogliv), содержащий фосфатидилхолин и тринатриевую соль глицирризиновой кислоты, применяется для лечения хронических заболеваний печени - гепатитов и гепатозов различной этиологии.

В связи с вышеизложенным производные глицирризиновой кислоты и их соли вызывают интерес как потенциально активные вещества, имеющие большие перспективы в медицине, фармакологии и биологии, а получение новых производных глицирризиновой кислоты и их солей является важной задачей.

В рамках решения этой задачи получен ряд солей ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты как по карбоксильным группам, так и по основным (пиридиновым) группам общей формулы:

,

a ,

при этом:

, или

, или

,

или Y=COOH,

а ,

,

при этом:

Синтез таких солей может быть осуществлен, например, в соответствии с приведенными ниже примерами 1-3.

Исследования токсичности солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты показали, что они не токсичны и могут применяться в медицине, фармакологии и биологии - оценка цитотоксичности этих соединений приведена в примере 4 (таблица 1).

Исследования биологической активности солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты, проведенные в отношении вируса иммунодефицита человека, показали их высокую эффективность как ингибитора репродукции этого вируса, при том, что проблема лечения ВИЧ-инфекции остается одной из самых важных проблем современной медицины. Оценка активности солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека приведена в примере 5 (таблица 2).

Для лечения ВИЧ-инфекции на протяжении многих лет в клинической практике широко использовался препарат Азидотимидин (АЗТ), являющийся эффективным ингибитором вирусной обратной транскриптазы [Машковский М.Д. Лекарственные средства, т.2. Изд. 14-е. М.: ООО «Новая волна» - 2000]. Однако последние годы показали, что в организме ВИЧ-инфицированных пациентов быстро развивается резистентность вируса к нему [Larder B.A, Kemp S.D. «Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT)». Science, 1989 - V.246, p.1155-1158], а также он высоко токсичен [Chiu D.T. & Duesberg P.H. «The toxicity of azidothymidine (AZT) on human and animai cells in culture at concentrations used for antiviral therapy». Genetica, 1995 - V.95, p.103-109 и Brinkman K., ter Hofstede J.M., Burger D.M. «Adverse effects of reverse transcriptase inhibitors: mitochondrial toxicity as common pathway». AIDS, 1998 - V.12, p.1735-1744]. Кроме того, монотерапия Азидотимидином приводит к появлению устойчивых к препарату мутантов вируса. В настоящее время Азидотимидин применяют в основном в качестве составляющего компонента в так называемых «коктейлях» в сочетании с 2-4 другими препаратами, воздействующими на другие мишени цикла репродукции вируса [Schmit J.-C., Weber В. «Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring». Intervirology, 1997, V.40, № 5/6, p.304-321 и Кравченко А.В. «Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции». Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, № 1, с.59-62], как правило, ингибиторами протеазы ВИЧ или ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ. Несмотря на эффективность некоторых таких «коктейлей» актуальным остается поиск новых сочетаний и комбинаций Азидотимидина с препаратами другой природы и иного механизма действия, достаточно эффективными и при этом недорогими.

Одним из таких доступных препаратов является глицирризиновая кислота, которая в отличие от Азидотимидина ингибирует репродукцию вируса на ранних стадиях инфекции [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. Изучение анти-ВИЧ активности -глицирризиновой кислоты. Вопросы вирусологии, 1992, № 5-6, с.235-238].

Исследования противовирусной активности целого ряда производных глицирризиновой кислоты также продемонстрировали эффективность их анти-ВИЧ действия в культуре клеток [Покровский А.Г., Плясунова О.А., Ильичева Т.Н., Борисова О.А., Федюк Н.В., Петренко Н.И., Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности. Химия в интересах устойчивого развития, 2001, № 9, с.485-491, Патент РФ № 2199547 и Патент РФ № 2198177]. Например, уже упоминавшаяся моноаммониевая соль глипирризиновой кислоты Глицирам не является антагонистом по отношению к Азидотимидину и в сочетании с ним эффективно блокирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток как при острой, так и при хронической инфекции при соотношении АЗТ: Глицирам, равном 1:10000 [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. Изучение анти-ВИЧ активности -глицирризиновой кислоты. Вопросы вирусологии, 1992, № 5-6, с.235-238].

Наиболее близким аналогом предлагаемого ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека являются ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты, показавшие самую высокую анти-ВИЧ активность по сравнению с другими производными названной кислоты [Патент РФ № 2304145]. Их недостатком является плохая растворимость в воде, а растворимость препаратов в воде во многих случаях весьма желательна или даже необходима.

Предлагаемое изобретение решает задачу создания ингибиторов репродукции вируса иммунодефицита человека, имеющих высокую активность и при этом хорошую растворимость в водных средах.

Поставленная задача решается тем, что предлагается ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека, который является солью ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты.

Получение солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты показано в примерах 1-3. Исследование их цитотоксичности показано в примере 4 (таблица 1). Оценка активности солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека приведена в примере 5 (таблица 2).

При исследовании ингибирования репродукции вируса иммунодефицита человека осуществляют культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии МТ-4 в присутствии указанных соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,0001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток. Об ингибировании репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток судят по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования [Schmit J.-C., Weber В. Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring. Intervirology, 1997, V.40, № 5/6, p.304-321 и Кравченко А.В. Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, № 1, с.59-62] при окрашивании 3-(4,5-dimemylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).

Пример 1

Синтез солей ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты с органическими аминами

Для осуществления синтеза солей ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты используют следующие органические амины: пиридин, пиперидин, (R)-1-фенилэтиламин, этилендиамин.

Для подтверждения факта образования солей и определения качества образующихся продуктов используют комбинированную методику, включающую в себя запись ВЭЖХ-хроматограмм на обращенной фазе ProntoSil 120-5-C-18 AQ и тест на растворимость в воде. Так как запись ВЭЖХ-хроматограмм производится с использованием элюента, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, то этим способом невозможно подтвердить факт образования солей, однако он позволяет однозначно сказать, имела ли место основно- или кислотно-катализируемая деструкция ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты. Для подтверждения образования солей проверяют поведение полученных продуктов при помещении их в воду, сравнивая с аналогичным поведением ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты. Образование соли ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты прошло успешно только в случае существенного различия поведения этой соли и исходного продукта при выдерживании их в воде.

С целью применимости полученных солей для тестирования на токсичность и специфическую активность проверяют также растворимость полученных солей в ДМСО.

Полностью подходящими для дальнейшего биотестирования признают образцы, не подвергшиеся деструкции, отличающиеся от исходного продукта при выдерживании в воде и без остатка растворяющиеся в ДМСО.

Рассчитанное количество органического амина добавляют к предварительно растворенному в 3 мл смеси хлороформ: метанол, равному 5:1 ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты - 0,35 г. Полученный раствор перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 ч, после чего продукт высаживают добавлением 5 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок отстаивают в течение 1 ч, после чего отфильтровывают его на фильтре Шотта (16 микрон), промывают диэтиловым эфиром (2×20 мл) для отделения от избытка амина и затем высушивают на фильтре.

Для увеличения вероятности образования солей используют 5-кратный молярный избыток амина по отношению к ди- и триникотинатам глицирризиновой кислоты В случаях, когда такой избыток приводит к деструкции ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты, используют эквимолярные соотношения.

В результате взаимодействия с названными выше разнообразными органическими аминами синтезировано три новых вещества, являющиеся солями ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты (в скобках указаны шифры, использующиеся далее в сводных таблицах):

- соль с (R)-1-фенилэтиламином (НС-3);

- соль с пиперидином (НС-4);

- соль с этилендиамином (НС-11).

Общая формула полученных солей:

,

где

где

где

где

Пример 2

Синтез солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты с иными основаниями

С целью синтеза солей ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты используют следующие основания, принадлежащие к разным классам соединений: мочевина, аммиак, гидрокарбонат натрия.

Реакции с перечисленными основаниями проводят аналогично реакциям с органическими аминами, как показано в примере 1, добавлением рассчитанного количества основания к предварительно растворенному в 3 мл смеси хлороформ: метанол, равном 5:1, ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты - 0,35 г с последующей обработкой. При этом мочевину используют в кристаллическом виде, аммиак - в виде 30%-ного водного раствора, гидрокарбонат натрия - в виде свежеприготовленного 10%-ного водного раствора NaHCO₃.

В результате взаимодействия ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты с разнообразными основаниями синтезировано три новых вещества, являющихся солями ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты (в скобках указаны шифры, использующиеся далее в сводных таблицах):

- соль с мочевиной (НС-12);

- соль с аммиаком (HC-14);

- соль с гидрокарбонатом натрия (HC-25).

Общая формула полученных солей:

где

где

где

где

Пример 3

Синтез солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты с органическими кислотами

Для синтеза используют следующие органические кислоты: винная кислота, щавелевая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, бензойная кислота.

Рассчитанное количество органической кислоты добавляют к предварительно растворенному в 3 мл смеси хлороформ: метанол, равной 5:1 ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты - 0.35 г. Полученную реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 24 ч. В случаях использования щавелевой, уксусной и бензойной кислот раствор становится гомогенным, продукт высаживают добавлением 5 мл диэтилового эфира и далее обрабатывают аналогично реакциям с органическими аминами, как показано в примере 1.

Если кислота за 24 ч не растворилась - это винная и янтарная кислоты, то к реакционной смеси добавляют 0.2 мл воды и каталитическое количество катализатора межфазного переноса - тетрабутиламмоний бромида. После дополнительного перемешивания на магнитной мешалке в течение 15-30 мин продукт высаживают добавлением 5 мл диэтилового эфира и далее обрабатывают аналогично реакциям с органическими аминами (как в примере 1).

В результате взаимодействия ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты с разнообразными органическими кислотами синтезировано четыре новых вещества, являющиеся солями ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты (в скобках указаны шифры, использующиеся далее в сводных таблицах):

- соль со щавелевой кислотой (НС-17);

- соль с уксусной кислотой (НС-18);

- соль с янтарной кислотой (НС-19);

- соль с бензойной кислотой (НС-20).

Общая формула полученных солей:

где ,

где

где

где

где

Пример 4

Исследование цитотоксичности солей ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты

Для оценки цитотоксичности препаратов используют высокочувствительную к ВИЧ перевиваемую культуру клеток - лимфоцитов человека МТ-4. Применение этой культуры клеток позволяет определить индекс селективности соединений, при наличии данных об анти-ВИЧ активности, полученных на этой же культуре клеток.

Исследование проводят по стандартной схеме: раствор препарата в ДМСО в нетоксичных концентрациях от 0,001 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) вносят в клетки МТ-4 - концентрация клеток 2×10 ⁶ кл/мл.

Затем клетки разводят полной ростовой средой RPMI - 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл линкомицина, гентамицина, до посевной концентрации 5×10⁵ кл/мл. Далее клетки культивируют в течение 4 суток при температуре 37°С во влажной атмосфере 5% СО₂, после чего учитывают долю жизнеспособных клеток методом исключения трипановым синим. По полученным экспериментальным данным строят дозозависимые кривые, как показано на фиг.1, и определяют дозы препаратов, на 50% (CD50) и на 90% (CD90) снижающие количество живых клеток.

В качестве препарата сравнения используют моноаммонийную соль глицирризиновой кислоты (Глицирам) и ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты (НГК). На основании полученных экспериментальных данных по токсичности препаратов на культуре клеток рассчитывают количественные характеристики цитоксичности для культуру клеток МТ-4, которые приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, наименее эффективен в отношении ВИЧ препарат НС-3 - соль ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты с (R)-1-фенилэтиламином. Наиболее эффективные ингибиторы ВИЧ следующие соли ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты: соль с янтарной кислотой (НС-19), соль с бензойной кислотой (НС-20), соль с гидрокарбонатом натрия (НС-25), соль с пиперидином (НС-4) (IS>100), анти-ВИЧ активность которых выше активности ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты (НГК).

Таблица 1
Цитотоксичность препаратов серии НС на культуре клеток МТ-4
№ п/п	Шифр препарата	CD50, мкг/мл
1	НС-3	300,0
2	НС-4	>2000,0
3	НС-11	1450,0
4	НС-12	1930,0
5	НС-14	2600,0
6	НС-17	>2000,0
7	НС-18	>2000,0
8	НС-19	>2000,0
9	НС-20	>2000,0
10	НС-25	>>2000,0
11	НГК	1650,0
12	Глицирам	1800,0

Данные по индексу селективности приведены с учетом результатов по определению анти-ВИЧ активности исследуемых соединений.

Таким образом, исследована цитотоксичность производных глицирризиновой кислоты. Установлено, что цитотоксичность исследованных препаратов, как правило, ниже, чем препарат сравнения - НГК, за исключением препарата НС-3 - соль с (R)-1-фенилэтиламином, который относится к наиболее токсичным среди исследованных производных. Для всех остальных исследованных соединений не удалось определить дозу, токсичную для 90% клеток и даже 50%-ную цитотоксическую дозу для соединений НС-17, 18, 19, 20, 25. Наименее токсичным оказалось соединение НС-25 - соль с гидрокарбонатом натрия, для которого даже к концентрации 2000 мгк/мл цитотоксичность составила менее 70%.

Пример 5

Исследование анти-ВИЧ активности и определение индекса селективности солей ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты

Для оценки эффективности анти-ВИЧ действия препаратов в работе используют штамм ВИЧ-1_EVK, полученный из Института вирусологии им. Д.И.Ивановского, и высокочувствительную к ВИЧ перевиваемую культуру клеток - лимфоцитов человека МТ-4. В качестве контроля сравнения используют известный ингибитор ВИЧ - Азидотимидин (АЗТ).

Исследование проводят по стандартной схеме: раствор препарата в ДМСО в нетоксичных концентрациях от 0,001 до 100 мкг/мл - по три лунки на каждую концентрацию, вносят в клетки МТ-4, при концентрации клеток 2×10 ⁶ кл/мл, одновременно с вирусом (множественность заражения - 0,1 - 0,2 инфекционных единиц на клетку), инкубируют в лунках 96-луночного планшета в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% СО₂ (адсорбция вируса).

По окончании инкубации инфицированные клетки разводят полной ростовой средой RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл линкомицина, гентамицина, до посевной концентрации 5×10⁵ кл/мл и вновь вносят растворы препаратов для поддерживания их концентрации неизменной. В качестве контролей используют ВИЧ-инфицированные клетки без добавления препаратов и неинфицированные клетки. Далее клетки культивируют в течение 4-х суток при температуре 37°С, во влажной атмосфере 5% СО₂, после чего учитывают долю жизнеспособных клеток методом исключения трипановым синим и уровень вируспродукции в экспериментальных и контрольных образцах путем количественного определения вирусоспецифического белка р24 иммуноферментным методом. По полученным экспериментальным данным строят дозозависимые кривые, как показано на фиг.2, и определяют дозы препаратов, на 50% (ID50) и на 90% (ID90), снижающие накопление вирусспецифического белка р24. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе.

В качестве препарата сравнения используют моноаммонийную соль глицирризиновой кислоты - Глицирам и ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты. На основании полученных экспериментальных данных по ингибированию ВИЧ в культуре клеток рассчитывают количественные характеристики ингибирования штамма ВИЧ-1_EVK исследуемыми препаратами в культуре клеток МТ-4, которые приведены в таблице 2. Как видно из таблицы, наименее эффективен в отношении ВИЧ препарат НС-3. Наиболее эффективные ингибиторы ВИЧ из исследованной серии препаратов - препараты с шифрами НС-19 - соль с янтарной кислотой, НС-20 - соль с бензойной кислотой, НС-25 - соль с гидрокарбонатом натрия, НС-4 - соль с янтарной кислотой (IS>100), анти-ВИЧ активность которых выше активности препарата сравнения - НГК.

Таблица 2
Анти-ВИЧ активность препаратов серии НС (при их внесении в клетки МТ-4 после адсорбции вируса)
№ п/п	Шифр препарата	ID50, мкг/мл	ID90, мкг/мл	IS
1	НС-3	27,0	100,0	11,11
2	НС-4	18,0	100,0	>111,11
3	НС-11	27,0	100,0	53,70
4	НС-12	23,0	100,0	83,91
5	НС-14	35,0	100,0	74,29
6	НС-17	33,0	100,0	>60,61
7	НС-18	25,0	90,0	>80,00
8	НС-19	10,0	80,0	>200,00
9	НС-20	10,0	85,0	>200,00
10	НС-25	20,0	95,0	>>100,00
11	НГК	37,0	100,0	44,59
12	Глицирам	95,0	450,0	18,9

Таким образом, исследования показали, что анти-ВИЧ активность солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты в основном выше, чем активность аммонийной соли глицирризиновой кислоты - Глицирама и ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты. Наиболее эффективные ингибиторы ВИЧ из исследованных солей ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты: соль с пиперидином (НС-4), соль с янтарной кислотой (НС-19), соль с бензойной кислотой (НС-20), соль с гидрокарбонатом натрия (НС-25). Эти соединения обладают способностью эффективно подавлять репликацию ВИЧ-1 в культуре клеток лимфоцитов человека МТ-4 и, поскольку эти соединения являются солями, они хорошо растворяются в воде.